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美国国家科学院院刊。1996年11月12日；93(23): 12969–12973.
数字对象标识：10.1073/pnas.93.23.12969
预防性维修识别码：PMC24030型
PMID：8917528

p300/CBP在细胞中的重要作用响应 到 缺氧

佐尔塔·阿兰尼，*† L。 埃里克·黄，†‡ 理查德·埃克纳，* Shoumo Bhattacharya公司，* 中国江，‡ 标记 A.戈德堡，‡ H。 富兰克林·邦恩，‡和大卫 M.利文斯顿*§
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

p300和CBP是由E1A癌蛋白。它们参与许多生物过程，包括细胞周期阻滞、分化和转录激活。p300和/或CBP（p300/CBP）也共同激活CREB。怎么他们参与这些过程尚不清楚。在搜索中特异性p300结合蛋白，我们克隆了完整的cDNAHIF-1α。这种转录因子介导基因的低氧诱导编码某些糖酵解酶、促红细胞生成素（Epo）和血管内皮生长因子。缺氧条件导致包含HIF-1α和p300/CBP的DNA结合复合物。Epo启动子的低氧诱导转录是特异性的异位p300增强，E1A结合p300/CBP抑制。低氧诱导的VEGF和Epo mRNA合成同样受到E1A。因此，p300/CBP–HIF复合物参与诱导低氧反应基因，包括一个（血管内皮生长因子）在肿瘤血管生成中起主要作用。矛盾的是，据我们所知，这些数据首次表明p300/CBP在转化抑制和肿瘤中都具有活性发展。

肿瘤扩大到一定大小需要新生血管。这一过程至少部分由局部低氧诱导的血管生成因子的产生，如血管内皮生长因子（VEGF）(1，2). 缺氧激活异二聚体转录因子低氧诱导因子（HIF）-1(三). HIF-1由α组成和β亚单位，它们都属于基本螺旋-环-螺旋（bHLH）-per-arnt-sim（PAS）蛋白家族(三). HIF-1结合DNA保守的启动子/增强子连锁HIF位点和刺激缺氧反应基因如VEGF、红细胞生成素的转录（Epo）和各种糖酵解酶(三). HIF-1如何激活然而，转录尚不清楚。

腺病毒E1A结合p300和CREB结合蛋白（CBP）同源转录衔接蛋白在多种细胞中的活性转录事件(4–7). 他们被认为会行动，至少在部分，充当特定DNA绑定之间的信号管道转录因子和基本转录机制。对于例如，当细胞暴露于cAMP时，迄今为止处于非活动状态转录因子CREB与cAMP反应元件结合，招募CBP（可能还有p300）作为转录适配器，从而刺激cAMP反应基因的转录(6，8–10). 可能使用p300和/或CBP的其他因素（p300/CBP）作为适配器包括jun、fos、c-myb、MyoD、RAR-α、SRC-1、，和YY1(11–16). 此外，p300和CBP都是物理和腺病毒E1A和猴病毒40大肿瘤（T）癌蛋白(6，7，17). 重要的是，E1A能够将细胞转化为恶性表型需要完整的其p300/CBP结合域，意味着靶向这些蛋白质是E1A行动的组成部分(18). 这表明p300/CBP在抑制肿瘤转化中的作用。

为了开始理解p300的作用机制特定p300相关蛋白的搜索是由交互式蛋白表达克隆方法(19). 我们用a作为探针p300区域不同于CREB和E1A结合位点。使用这种方法，我们确定了HIF-1α和随后发现p300/CBP和HIF-1α存在于低氧诱导的DNA结合复合物，似乎在多个低氧激活基因。这些数据表明p300/CBP的主要作用对缺氧的反应。

材料和方法

质粒构建。

编码谷胱甘肽的质粒S公司-用PCR构建转移酶（GST）融合蛋白扩增p300的指示区域，然后进行亚克隆进入pGEX-2TK。C/H1（aa 300–528）包含第一个p300加上约100的富含半胱氨酸/组氨酸区域两边都有残留物。C/H1Δ（包含aa 300–345和411–528）相当于C/H1，但缺乏实际富含半胱氨酸/组氨酸区域（存在于残基346–410中）。重组杆状病毒使用BaculoGold系统（PharMinen）构建，如下制造商说明；ΔC/H1删除与上述GST融合蛋白中的蛋白。pCMVβ-HA-HIF-1α通过将HIF-1αcDNA片段插入pCMVβ包含帧内3′血凝素（HA）标签(4). 使用的碎片包含完整的ORF和5′非翻译区。

表达式克隆。

GST融合蛋白在其他地方描述的细菌(19)，使用pGEX-2TK-p300C/H-1（如上所述）。该蛋白质被放射性标记体外和用于筛选293λZAP cDNA文库（由William G。Kaelin，Dana–Farber癌症研究所），如前所述(19). 切除按照制造商的说明进行插入（Stratagene）。

细胞培养。

U-2 OS人骨肉瘤细胞和Hep3B人肝癌细胞保存在DMEM/10%胎儿体内37°C 10%CO条件下的小牛血清2/90%空气和5%一氧化碳2/95%空气。sf9昆虫细胞在格雷斯昆虫培养基中悬浮28°C补充乳清蛋白、酵母酸盐（GIBCO/BRL）和10%胎儿小牛血清。

电泳迁移率测定（EMSA）。

核提取物按照说明进行EMSA分析(20)，除了那个省略了核提取物制备中的最后透析步骤凝胶条件如参考文献所示。21野生型（WT）和突变型合成的（mut）探针分别与W18和M18匹配裁判。20XRE（外源性反应元件）和CME（中心中线元素）探针被合成并与序列相对应GGAGTGCGTGAGAGAGCCTGGAGG和AAATTTTACGTGCCACAGA，分别是。

单克隆抗体。

提高了单克隆抗体OZ15针对含有HIF-1α氨基酸530-826的GST融合蛋白（Z.A.和D.M.L.，未发表结果）和单克隆抗体AC 240针对含有CBP氨基酸的GST融合蛋白720-1676（R.E.和D.M.L.，未公布结果）。

瞬时转染。

使用磷酸钙法。携带总巨细胞病毒（CMV）使用pRC/CMV将每次转染的质粒保持在3μg主干载体（Invitrogen）作为载体。萤光素酶测定使用归一化为观测值的提取量立即执行β-半乳糖苷酶活性(22). 对于图中的实验。​图3，三，个单元格在裂解前将其分为小份并孵育44小时荧光素酶活性分析。溶血前20小时将等分试样暴露于1%O中2而另一个留在21%O2对于图中的实验。​图4，4，个单元格如有指示，转移至1%O2/100微米氯化钴2转染12–18小时后36小时。

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共转染p300增强缺氧诱导Epo增强子的转录(30). 瞬时转染用1μg荧光素酶报告基因（E）对Hep3B细胞进行检测包含猴病毒40启动子上游的Epo增强子或其中HIF-1结合位点突变的一种（Em）。细胞是用0–2μg共转染(左侧)和0或2μg(赖特)pCMV-p300的(4)含1μg pCMV-lacZ（至修正转染效率的变化）。这个年axis显示荧光素酶表达比率为1%O（运行）2到21%O2上的结果左侧是三次试验的平均值±1 SD和上的赖特是重复的实验点。

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E1A抑制低氧驱动转录(31).(一个)用1μg pCMV-lacZ共转染Hep3B细胞和0.5μg Epo49-Luc(32)（条形图下方的图表）和加上Bluescript DNA（Stratagene），总量达到16μg。20小时后，细胞感染了5型腺病毒携带指示的E1A缺失突变。1101突变株删除E1A残基4–25，而1107突变体删除残基111–123。E1AΔ111-123与p300/CBP相互作用，但不与pRB相互作用(33)，而E1AΔ4-25不识别p300/CBP，但绑定到口袋蛋白质(33). 腺病毒也有突变（dl520）不能合成13S E1A(34). (B类)Hep3B细胞感染野生型或突变型腺病毒一个感染后，将细胞置于1%或21%O2持续6小时；提取细胞总RNA使用VEGF探针进行Northern blots分析。

Northern Blot分析。

用VEGF进行Northern印迹分析按照说明进行探测(23).

结果

p300的C/H1区与HIF-1α相互作用。

一个用标记的GST融合蛋白探测表达文库包含p300第一个富含半胱氨酸/组氨酸的区域（GST–C/H1）。分离出的最长克隆（我们称之为CHIP-1）在一组包含826个氨基酸ORF的重叠cDNA中预测含有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）的蛋白质(24)和PAS域(25). 转录并翻译CHIP-1 cDNA在里面体外，生成≈120-kDa产品（图。​（图11一个，车道1）。此翻译产品能够特别绑定，体外，至细菌产生的GST–C/H1（图。​（图11一个，车道3）和昆虫细胞产生的全长p300（图。​（图11B类，车道3). 绑定依赖于第一个富含半胱氨酸/组氨酸的区域（图。​（图11 一个和B类，车道4）。同样，CHIP-1在U-2 OS人骨肉瘤中表达细胞也与昆虫产生的全长p300特异结合电池（图。​（图11C类). 随后，克隆了这两个低氧诱导因子-1亚单位（HIF-1α和HIF-1β）(三)导致认识到CHIP-1和HIF-1α是相同的。

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p300结合HIF-1α(28). (一个)商品及服务税含有p300 C/H1指定部分的融合蛋白为构建。35转录S-标记的HIF-1α翻译体外并与指定的GST混合固定在谷胱甘肽微球上的融合蛋白。珠结合蛋白通过SDS/PAGE和放射自显影观察。(B类)全长p300（WT）和p300在第一段中删除昆虫体内合成了富含半胱氨酸/组氨酸的区域（C/H1）细胞使用杆状病毒系统。35S标记HIF-1α合成了体外，翻译产品与指示的杆状p300物种混合并免疫沉淀带有p300抗体[RW128(4)]使用蛋白A琼脂糖珠。通过SDS/PAGE和放射自显影术。车道1英寸一个和B类每个包含20%的输入翻译产品车道。(C类)U-2 OS细胞转染10μgpCMVβ-HA-HF-1α（+）或单独的载体（−）。细胞被标记为[35S] 制备了蛋氨酸和细胞提取物，与相关杆状病毒p300物种混合（如有指示），以及然后用抗p300或抗HA抗体免疫沉淀，如在里面B类通过煮沸释放珠结合蛋白，并且用血凝素（HA）表位抗体重新沉淀（12CA5）。在第二轮实验中，我们观察到了与珠子结合的蛋白质SDS/PAGE和放射自显影。打开的箭头表示HA–HIF-1α。迁移速度更快的波段的身份尚不清楚但可能代表降解产物。标准分子量（kDa；Sigma）表示。IVT、，体外翻译；第页，降水；IP，免疫沉淀。

HIF-1α与p300/CBP的相互作用缺氧。

使用EMSA，我们询问p300/CBP是否存在于含低氧活化HIF-1α的稳定复合物。核提取物制备低氧和常氧HeLa细胞，并与标记物混合HIF探针，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。作为如图所示。​图22一个，至少三个正常毒性提取物中存在特定的复合物（通道6，带C，也就是说，组成），之后至少又出现了两个复合物据报道，缺氧（通道7，波段I，即诱导型）(28). 这些综合体被多余的未标记探针（第5车道）所竞争以及含有交叉反应XRE（异源反应）的探针元件）(29)和CME（中央中线元件）(26)序列（车道2和3）。XRE序列与bHLH PAS蛋白的异二聚体结合（AHR和ARNT/HIF-1β）(27，29)，CME序列由绑定单一基因的PAS蛋白产物(26). 综合体然而，没有被过量的未标记探针竞争，该探针含有突变HIF位点（第4道）或非特异性序列（第1道）。这个最快迁移带似乎是非特异性的，因为它是由未标记的多余无关寡核苷酸（1号通道）。

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p300/CBP家族的一个或多个成员在DNA结合复合物中与HIF-1α相互作用(27). (一个)使用EMSA分析Hep-3B细胞的核提取物HIF-站点控制探头。1-5车道和7-8车道的提取物用1%O处理5小时的细胞制备2、和lane6中的提取物是从常氧细胞中制备的。超过100倍未标记野生型Epo 3′增强子探针（WT，第5通道），突变探针（mut，车道4），包含中心中线元素（CME，车道3） ，含有外源响应元件的探针（XRE，通道2），或非特异性探针（NS:myc E2F位点，1道）被用作竞争者。HIF-1α抗体（OZ15）被检测为潜在的超转移通道8中的试剂。在这两个实验中，自由探针都过多未显示。(B类)Hep-3B细胞的核提取物分析为一个。准备了2–4车道的提取物用1%O处理5小时的细胞2.车道中的提取1和5是由常压细胞制备的，6号通道中不含细胞蛋白。HIF-1α抗体（OZ15）和p300/CBP单克隆抗体抗体（AC240）被分析为潜在的超转移试剂车道3和4-6。诱导（I）和本构（C）指出了配合物。

研究HIF-1α和p300/CBP在这些细胞中的存在复合物，我们测试了这些蛋白的抗体超移试剂。如图所示。​图2，2，引起的缺氧配合物通过单克隆抗体的存在而发生超移位HIF-1α抗体（图中实心箭头）。​图22 一个，第8车道，和B类或单克隆抗体与p300和CBP（图中的开放箭头。​图22B类，车道4). 因此，缺氧后，复合物存在体内包含HIF-1α和p300/CBP家族的至少一个成员。

我们注意到，迁移速度较快的一小部分在存在以下抗体的情况下，组成复合物也减少p300/CBP（图。​（图22B类，车道4和5）。这些复合体未被HIF-1α抗体超转移，因此可能不会另一个p300/CBP也有类似的作用单克隆抗体（数据未显示）。因此，在正常或缺氧细胞、p300和/或CBP存在于能够结合的复合物中HIF站点。本构复合体的详细性质是尚不清楚，但有人可能推测它们含有ATF-1、CREB-1或AP-1，所有这些都能与HIF-1位点组成性结合(30，31)和与CBP互动（可能还有p300）(6，7).

p300增加促红细胞生成素（Epo）的诱导性缺氧反应增强剂。

报告基因的共转染含有pCMV-p300的3′Epo增强子导致低氧条件下荧光素酶活性比率的剂量依赖性增加与常氧细胞（图。​（图3三 左侧).具体来说，它从5.3±1.8上升到14.9±4.8。这个缺氧诱导的3倍增加依赖于HIF-1，因为p300共转染对a的荧光素酶产生无影响HIF-1结合位点突变的报告基因（图。​（图3三 赖特). 因此，p300增加了依赖HIF-1的Epo增强子。效果最大由于已经有大量p300，可能仅限于3倍在pCMV-p300转染前存在于细胞中。

E1A抑制Epo增强器和特异性靶向p300/CBP的VEGF基因。

E1A可以抑制使用p300/CBP的系统的转录活性（例如cAMP介导的转录反应），以及直接抑制p300反激活函数(4，6，7). 如果p300/CBP也参与HIF-1介导的缺氧反应，则E1A应抑制缺氧效应。为了验证这个假设，我们转染了受荧光素酶基因调控的报告质粒与胸苷激酶TATA盒相连的Epo增强子。如上所述，该增强子包含一个缺氧反应性HIF位点。如图所示。​图44一个，这位记者的活动是缺氧刺激4倍（bars 1对2）。这个刺激是被E1A完全废除，或通过复合感染引入（bar 3），或通过共转染（数据未显示）。E1A的这种抑制作用是取决于其与p300和CBP相互作用的能力：腺病毒编码突变E1A物种，选择性地不能结合p300和CBP没有抑制缺氧反应（bar 4），而一个编码E1A不能结合pRB相关蛋白，但能够结合p300/CBP抑制（bar 5）。E1A对正常氧细胞中的报告者没有影响（未显示数据）。我们得出结论，E1A取消了Epo增强子对缺氧的反应及其通过靶向性第300页/CBP。与这些发现一致，我们还发现E1A是一种有效的低氧刺激内源性Epo抑制剂信使核糖核酸合成（L.E.H.和H.F.B.，未发表的数据）。

最后，我们询问E1A是否也抑制VEGF mRNA的诱导对缺氧的反应。如图所示。​图44B类，感染带有野生型腺病毒的Hep3B细胞显著抑制了缺氧后的VEGF mRNA（泳道3）。相比之下，一种变异病毒编码E1A物种不能结合p300，CBP不能抑制低氧反应（第5通道），证明反应至少是部分由p300/CBP结合介导。另一方面，E1A能够与p300/CBP相互作用的物种，但在与pRB相关蛋白结合，几乎抑制VEGF mRNA的合成与野生型E1A（7号车道）一样高效。因此，正如对Epo增强子，E1A对p300/CBP的结合与其相关抑制低氧诱导的VEGF mRNA水平的能力。

讨论

本文提供的数据表明p300/CBP的关键作用低氧反应基因的转录调控。300页/CBP存在体内在低氧诱导的配合物中DNA-bound HIF-1（图。​（图2），2)，可以提高Epo的响应缺氧增强剂，以HIF-1依赖的方式（图。​（图3）。三).此外，功能性p300/CBP对低氧诱导是必要的VEGF和Epo（图。​（图4）。4). 我们得出结论，p300/CBP在VEGF和Epo对缺氧和缺氧的转录反应中的作用p300/CBP很可能也参与了转录诱导其他低氧反应基因。最简单的模型与这些数据一致，p300/CBP被认为是适配器通过与HIF-1α结合招募到HIF位点的蛋白质，然后刺激转录机制。在这个情景，E1A通过结合以及使p300/CBP失活。E1A很可能通过以下方式执行此操作直接抑制p300/CBP转录激活潜能，而不是干扰p300/CBP-HIF-1α复合物，因为E1A也可以灭活可能与DNA结合的p300融合蛋白按宪法规定(6).

如前所述，p300/CBP参与了越来越多的转录调控系统（血清反应、肌生成、，荷尔蒙反应等）。鉴于如此广泛的互动转录调节功能，人们可能推测p300/CBP充当支架，同时与各种DNA结合（和其他）转录因子，从而整合信息来自不同来源。例如，p300/CBP可以通过绑定进行调节CREB和HIF-1α，在缺氧期间观察到的协同作用cAMP反应元件和HIF位点LDHA公司基因(35). 以这种方式，p300/CBP可能有助于正常集成多个输入信号以调制给定启动子的行为。

E1A阻断对病毒有什么好处低氧反应基因激活？一种可能性是缺氧反应对病毒复制有害(36，37).低氧诱导基因的中和可能有利于病毒生产。或者，E1A的作用可能只是其对不同调节的伴随效应的副现象也涉及p300/CBP的系统。例如，p300/CBP也干扰素α（IFN-α）途径中的适配器(38)，它具有强大的抗病毒增殖作用。E1A抑制干扰素-α路径有很好的文档记录(39–41). 因此，E1A抑制低氧反应基因可能只是次要于它的目的性抑制IFN-α应答基因。

本文提供的数据强烈暗示p300/CBP有助于缺氧诱导了VEGF启动子的激活，从而激活了VEGF合成。低氧诱导的VEGF表达被认为在低氧诱导血管生成及肿瘤的关键作用膨胀(1，2). 因此，p300/CBP，一种已知的转化抑制元素，可能具有支持肿瘤的矛盾特征进展。在这种情况下，p300/CBP–HIF复合物低氧特异性结构，可能成为理性以异常为特征的肿瘤和其他疾病的治疗低氧诱导的新生血管。

致谢

我们感谢James DeCaprio博士在产生HIF-1α单克隆抗体。我们还感谢Dr。Stan Bayley慷慨捐赠编码突变E1A的腺病毒蛋白质。这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持向D.M.L.、H.F.B.和M.A.G.拨款，并由Dana–Farber癌症研究所/Sandoz药物开发计划（至D.M.L.）。L.E.H.、R.E.和S.B.得到了一项国家研究的支持服务奖、瑞士国家科学基金会和英国心脏基金会。

脚注

缩写：Epo，促红细胞生成素；血管内皮生长因子生长因子；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；EMSA、，电泳迁移率测定。

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院