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英国癌症杂志。2006年3月27日；94(6): 842–853.
2006年3月7日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.bjc.6603030
预防性维修识别码：PMC2361380型
PMID：16523199

Omega 6促进前列腺向人骨髓造口转移及其Omega 3 PUFAs的抑制作用

M D棕色，1,* C A Hart公司，1 E加西，1 S巴格利，2和西北克拉克1,三，4
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关联数据

补充资料

摘要

流行病学研究表明，摄入膳食脂类不仅与发生转移性前列腺癌的风险增加有关，而且还与摄入脂类的类型有关，这些脂类的摄入会影响前列腺癌的转移风险。Omega-6多不饱和脂肪酸，即花生四烯酸，已被证明可以增强恶性前列腺上皮细胞的增殖，并增加晚期前列腺癌的风险。然而，它在促进癌细胞迁移方面的作用尚不清楚。这里我们显示花生四烯酸在浓度为5μM（M）是恶性上皮细胞侵袭的有力刺激物，能够完全恢复对氢化可的松剥夺的无脂肪细胞人骨髓基质的侵袭。这种观察到的侵袭是由花生四烯酸代谢物前列腺素E介导的2并且被Omega-3多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸以1:2 Omega-3:Omega-6的比例以及COX-2抑制剂NS-398抑制。这些结果确定了花生四烯酸可能增强转移转移和二次植入风险的机制体内这种风险可以通过摄入欧米茄-3多不饱和脂肪酸而降低。

关键词：前列腺癌、花生四烯酸、转移、骨髓、ω6、ω3

前列腺癌（CaP）是全球男性中第二常见的恶性肿瘤，占2002年诊断的所有癌症病例的11.9%。发病率有很大的地理差异，这种疾病在发达国家（19%）比发展中国家（5.3%）更常见(帕金等, 2005). 即使在发达国家，发病率也有很大差异，美国的年龄标准化发病率最高（124.8/100000），日本最低（12.6/100000）。这也反映在死亡率上，与日本（5.7/100000）相比，北美、北欧和西欧的年龄标准化率较高（分别为15.8、17.5和19.7/100000）。从低风险国家到高风险国家的移民风险显著增加，达到与常住人口相似的癌症风险水平(黑泽尔，1961年;Haenszel和Kurihara，1968年). 虽然CaP的病因和发病机制尚不清楚，但各种流行病学研究表明，饮食中的脂质与疾病的发展有关系(斯诺登等, 1984;焦万努奇等, 1993). 此外，越来越多的证据表明，影响CaP风险的不仅是脂肪的数量，还有脂肪摄入的类型。ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6 PUFA）已被证明可以促进CaP，而Omega 3(ω-3） 海洋食物中的PUFA可能抑制肿瘤发生(诺里什等, 1999).

前列腺癌倾向于转移到轴向骨骼的骨髓基质（BMS）。发生CaP骨转移的男性几乎总是会在没有并发疾病的情况下死于疾病，骨转移的临床表现与死亡之间的中间时间为18个月(乔治，1988). 通过内皮细胞侵入BMS的机制是一个复杂的多步骤过程，利用在体外入侵室。这些在体外模型不仅可以研究内皮细胞迁移的机制，还可以确定特定的BMS引诱剂。将PEC导向BMS的刺激机制的确切性质目前尚不清楚，尽管已经确定了一些成分。CXCR4/SDF-1信号通路是PEC侵袭的有力刺激物(泰奇曼等, 2002;太阳等, 2003). 然而，与人类BMS相比，它只是整体刺激的一小部分(雄鹿等, 2005). BMS是一个富含油脂的环境，富含各种油脂，包括ω-6 PUFA、亚油酸（LA）（4.1±0.84%至15.3±2.9%）和花生四烯酸（AA）（2.5±0.9至9.52±0.4%）(苏米达，1965年;德尼佐等, 1998;德尼佐等, 1999).

前列腺上皮的研究已经证明了脂质/细胞相互作用的重要性。马马拉基斯等(2002)表明与良性疾病患者相比，CaP患者的脂肪组织和前列腺组织中AA水平降低ω-3二十二碳六烯酸（DHA）和ω-3 : ω-6 PUFA比率。脂肪细胞/上皮细胞的相互作用已被证明可诱导前列腺增生(德田等, 2003)和乳房(拉希米等1994年)癌细胞系在正常乳腺发育中起重要作用(桑加尼等, 1999).

Omega-6 PUFA，尤其是LA代谢产物AA，与前列腺癌进展有关(洪恩等1994年;诺里什等, 1999)，刺激增殖，抑制凋亡(Ghosh，2004年). 这些作用是由环氧化酶-2（COX-2）产物前列腺素E的增加介导的2（前列腺素E2）(休斯·福福德等, 2005)以及脂氧合酶（LOX）产物5和12（S）-HETE（羟基二十碳四烯酸）。5-羟基二十碳四烯酸已被证明能诱导PC-3增殖(奥弗拉赫蒂等, 2002)通过激活孤儿核受体ROR，DU145和PC-3中5-LOX表达缺失α，已证明可抑制AA和LA的增殖作用(莫雷蒂等, 2004). 12（S）-羟基二十碳四烯酸不诱导PC-3增殖，但诱导内皮细胞侵袭（血管生成），导致增殖增加体内(聂等, 1998).

AA的刺激能力可以通过添加ω-3 PUFA、二十碳五烯酸（EPA）和DHA。这可能是由于ω-3 PUFA通过竞争性抑制COX和LOX通路来修饰AA生物合成衍生的前列腺素和二十烷酸(卡马利等, 1987).罗斯（1997）使用恶性乳腺和PEC显示，EPA和DHA不仅通过竞争Δ4去饱和酶阻断了LA的AA合成，还通过直接竞争COX和LOX酶阻断了AA的前列腺素和HETE合成。

流行病学数据表明ω-3 : ω-6 PUFA对确定转移性CaP的风险至关重要。这是我们第一次展示在体外数据表明，AA是人类BMS转移性PEC的关键引诱剂，并且通过添加ω-3个PUFA。

材料和方法

材料

所有试剂均购自Sigma-Aldridge（英国普尔），AA、5-HETE和12（S）-HETE除外，后者由英国MP生化公司（英国伦敦）提供。所有脂肪酸的含量均为10 mg ml−1在乙醇中。所有组织培养基和马血清均来自Invitrogen（英国佩斯利），但Labtech International Ltd（英国东苏塞克斯郡乌克菲尔德）提供的胎牛血清（FCS）除外。组织培养塑料、Matrigel®基底膜基质和8μm细胞培养插入物来自Becton Dickinson Labware（美国新泽西州）。Iwaki石英基35毫米培养皿由英国斯塔福德郡的Bibby无菌公司提供。Oil Red O来自VWR International Ltd（英国莱斯特郡）。抑制剂NS-398来自Alexis Corp，MirrIR载玻片来自Keveley Technologies（美国俄亥俄州）。

抗体

小鼠抗人泛细胞角蛋白、尼罗河红和DAB片剂来自Sigma-Aldridge（英国普尔）；DAKO Ltd（英国剑桥）的兔抗鼠生物素化抗体和Vector Laboratories（美国加利福尼亚州）的Vectastain Elite ABC试剂盒。

细胞培养

PC-3细胞系(凯恩等1979年)在火腿F12（Sigma）和7%FCS中培养，并在37°C的5%CO湿化环境中生长2在空中。在知情同意（ProMPT LREC 02/ST/122）的情况下，从常规肾手术中取出的供取用的人肋骨中培养骨髓基质，并使用以下方法准备组织培养(库蒂尼奥等, 1993). 培养物在33°C和5%CO中生长2在空气中放置4-5周，直到观察到造血活性区域。

共培养实验

将骨髓基质培养物进行胰蛋白酶消化，以相同的细胞密度重新接种到岩崎石英基35 mm培养皿中，然后放置14天重新建立。骨髓基质培养基替换为含有500个PC-3细胞/皿的培养基。共同培养物在37°C下培养48小时，然后固定在4%多聚甲醛中。

免疫细胞化学

固定后，用冰镇甲醇渗透共培养物，用10%的兔血清封闭，然后用0.3%的过氧化氢封闭。将共培养物与小鼠抗人泛细胞角蛋白按1:200孵育，然后与生物素化兔抗小鼠按1:400孵育。然后添加亲和素DH和生物素化辣根过氧化物酶H的复合物，并与DAB底物形成复合物。脂肪细胞用油红O染色。简单地说，在60%异丙醇中冲洗培养物，然后在0.5%油红O和60%异丙酚溶液中培养10分钟。在新鲜的60%异丙酸中培养分化几分钟，然后用水冲洗。

Brightfield体积分析

对油红O染色的PC-3和脂肪细胞进行颜色分析。使用蔡司AxioVert 35对焦平面进行可视化M（M）采用C-Apochro×63 1.2NA水浸物镜，在亮场照明下。连接了一个步进电机（美国纽约州卢德尔电子公司），可以对焦点进行精细控制（0.2微米步进）。然后使用ImageJ图像分析软件将图像累积到堆栈中(拉斯班德，2005年). 聚焦深度算法以灰度级应用于体积的每个颜色分量，然后将体积合并以形成数据的颜色体积。然后在Imaris（位平面）中查看图像，并生成数据的横截面视图。

傅里叶变换红外显微镜

前列腺骨转移石蜡包埋切片是从同意的患者中分离出来的，安装在MirrIR载玻片上，用Citroclear脱蜡，然后在空气干燥前进行20分钟丙酮治疗。6.25的高分辨率FTIR显微光谱图μ使用Perkin-Elmer聚光光谱仪和16×1 MCT线阵探测器在快速扫描模式下采集骨髓组织的m像素分辨率。4000–748厘米波数范围内的中红外光谱−1以反射模式收集。背景扫描记录在8厘米处−175次扫描的光谱分辨率，而样本扫描记录在8厘米处−160次扫描的光谱分辨率。傅里叶变换红外显微光谱图像使用Spotlight版本1.0.1进行处理。

侵入试验

使用以下描述的方法评估PC-3侵袭雄鹿等(2005). 简单地说，将Matrigel-coated细胞培养插入物放置在含有1 ml DMEM/0.1%无脂肪酸BSA的24孔板中，其中含有普通组织培养塑料（TCP-阴性对照）、BMS（阳性对照）或不断升高的AA、DHA、EPA、5-HETE、12（S）-HETE、15（S）-HETE和前列腺素E浓度2（第2页）。8时添加COX-2抑制剂NS-398μM（M）PC-3细胞在RPMI 1640培养基中饥饿24小时，接种于1×105然后将每个插入物在37°C下培养18小时，然后将插入物固定并用2%的结晶紫染色，并根据制造商的说明使用网格线进行计数。

流式细胞术检测PC-3细胞对AA的摄取

PC-3细胞在RPMI 1640培养基中血清饥饿24小时，胰蛋白酶化并于10时置于RPMI无血清培养基加或减AA中μM（M）浓度为2×105 细胞/ml。细胞在37°C和5%CO的条件下培养2在空气中放置180分钟，然后用5μM（M）尼罗河红5分钟。使用配备200 mW 488 nm氩离子激光器的FACS Vantage SE进行分析。使用线性放大法测量560-565nm范围内黄/金的发射。30分钟内对所有细胞进行分析。

旋转圆盘共焦显微镜观察PC-3细胞对AA的摄取

将PC-3细胞接种到石英底35 mm培养皿上，并生长到半汇合状态。在使用前，细胞在RPMI 1640培养基中血清饥饿24小时。在显微镜上进行可视化之前，将培养基更换为RPMI无血清培养基（无酚红）和5μM（M）尼罗河红。细胞在位于蔡司Axiover 200上的PerkinElmer Ultraview上可视化M（M）带有一个完整的环境室，加热物镜设置在37°C。尼罗河红队使用488nM（M）激光和细胞每5分钟拍摄一次，持续2小时z（z）-轴和组合以提供连续序列。

统计

所有值均以平均值±标准偏差表示。所有分析均使用双尾Student’st吨-测试。显著性阈值设置为P（P）<0.05。

结果

恶性PEC在BMS脂肪细胞中的定位和脂质摄取

德田等(2003)表明人类PEC与脂肪细胞相互作用在体外从而增加PEC的增殖和分化。因此，我们使用傅里叶变换红外显微镜（FTIR）对人类前列腺骨转移瘤进行了化学计量分析，以确定前列腺癌是否与BMS内的高脂区域相关体内.图1显示了用苏木精和伊红染色的人类前列腺骨转移的连续切片，或用傅里叶变换红外光谱进行化学计量检查。光谱图显示了组织内蛋白质和脂质信号的位置，蓝色代表最低信号，红色代表最高信号。脂烃信号的强度分布（使用3007到2978 cm之间的ν带区域−1)显示出与前列腺骨转移相关/周围的强烈脂质信号，表明PEC摄取脂质或与BMS内的高脂区域相关。我们之前在人类长期骨髓培养中共同培养PEC的研究中也观察到了这一现象(冗长的等, 1997;冗长的等, 1998;斯科特等, 2000;雄鹿等, 2002;雄鹿等, 2005)恶性人类PEC在脂肪细胞附近形成集落（未发表的发现）。

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在骨髓转移中，PEC定位于富含脂质的区域。前列腺骨转移的傅里叶变换红外显微镜化学计量分析。血红素和曙红染色切片（H&E）显示骨转移。正方形勾勒出由FTIR分析的序列截面的区域，如明场图像所示。亮场显微照片中较亮的阴影位置描绘了CaP细胞。脂烃峰面积（3007 cm−1至2798厘米−1)强度图像显示切片内的脂质定位。蛋白质图像（1729厘米−1至1485厘米−1)揭示了CaP细胞和造血骨髓之间的边界。比例尺=100μ米。

因此，我们假设恶性PEC可能向脂肪细胞迁移并利用其所含的脂质。为了验证这个假设，将PEC系PC-3接种到融合长期人类BMS上(图2A-D)或原发性前列腺基质(图2E和F). 然后分别用DAB和油红O开发的抗泛细胞角蛋白染色，观察PC-3细胞和脂滴。图2A和B说明PC-3细胞向高脂区迁移并在其周围形成集落。对脂质滴周围/附近PC-3细胞的高分辨率亮场显微镜观察表明，PC-3细胞从BMS周围区域摄取脂质(图2C和D). 通过PC-3/BMS共培养的亮场容量分析证实了这一观察结果。图2D显示了用抗泛细胞角蛋白和油红O双重染色的PC-3细胞的去卷积图像，Z平面数据采集于0.2μM（M）步骤。沿着x个和年轴是将脂滴一分为二的正交数据平面，确定其在PC-3细胞内的位置。

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PC-3细胞在BMS共培养中定位于脂肪细胞并吸收脂质。5 × 102PC-3细胞与原代长期人BMS共同培养，用抗全细胞角蛋白染色观察，DAB（棕色）显影。骨髓脂肪细胞和脂滴通过0.5%油红O染色进行可视化。使用蔡司AxioVert 35拍摄图像M（M）带C-无铬×63 1.2 NA浸水物镜。(一个——C类)与BMS共同培养的PC-3细胞的Brightfield显微照片显示PC-3定位于骨髓脂肪细胞和脂质摄取。(D类)去卷积亮场图像显示PC-3细胞质内的脂滴定位。x个和年面板显示沿白色十字线的正交数据平面。(E类——如果)PC-3细胞与原代人前列腺成纤维细胞共培养的Brightfield显微照片。

前列腺基质缺乏脂质中心，PC-3细胞不聚集，在基质内表现为孤立的细胞，细胞质内没有油红O染色的脂滴(图2E和F).

PC-3细胞摄取AA在体外

休斯·福福德等(2005)结果表明，在白蛋白载体存在的情况下，PC-3细胞在2.5小时后可以检测到AA的摄取。为了确定在没有载体的情况下从其环境中摄取脂质的速率，我们用10μM（M）无蛋白AA。图3AI和II显示AA存在时的脂肪细胞和PC-3细胞，用5μM（M）尼罗红，通过荧光显微镜观察。脂肪细胞密集地堆积着黄色的脂滴。这些也在PC-3细胞中观察到，尽管频率低得多。共焦成像证实了这一观察结果(图3A III)通过3D共焦显微镜验证了脂滴的内部化和定位(图3A IV). 荧光脂质染色的使用使PC-3细胞对AA的摄取能够随着时间的推移进行监测(图3B). PC-3细胞与10μM（M）AA，固定并用5染色μM（M）尼罗河红在不同的时间点。用流式细胞仪测定PC-3细胞的细胞数和AA摄取量，然后用旋转圆盘荧光显微镜实时观察。花生四烯酸被PC-3细胞迅速吸收，最大细胞数为67.71±4.72%，在30分钟时吸收AA。此后，AA阳性细胞数稳步下降，给药90分钟后仅有30.73±1.73%的PC-3细胞染色阳性。最大摄取量出现在45分钟时，与对照组的几何平均差为62.83±16.39(P（P）=0.019），该数字再次随时间下降。时间推移旋转圆盘显微镜也实时证实了这一现象(补充图1).

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PC-3细胞迅速占据ω-6 PUFA AA来自微环境。(一个)用荧光黄/金尼罗红染色（488 nm激发-565 nm发射）观察AA负载后（I）骨髓脂肪细胞或（II）PC-3细胞的脂质含量。（三） AA脉冲PC-3细胞的高分辨率共焦假彩色图像。（四） 共焦3D浮雕图像显示PC-3细胞细胞质内的脂滴定位。(B类)尼罗红染色后血清饥饿的PC-3细胞摄取AA后随时间的FACS分析；（一） 图描绘了AA摄取超时的人群染色阳性百分比，（II）图显示了由几何荧光平均值确定的PC-3细胞的AA摄取超时水平。

的影响ω-3和ω-6 PUFA入侵

Omega-6 PUFAs，尤其是AA，与晚期CaP的风险增加有关，这种风险可以通过增加ω-3个PUFA。因此，我们试图确定AA、DHA和EPA通过合成基底膜Matrigel刺激PC-3侵袭的能力，并将其刺激迁移的能力与人类BMS进行比较。

PC-3细胞在AA、DHA或EPA剂量递增的情况下培养过夜，并通过台盼蓝排除法评估细胞活力。只有100个μM（M）显示了DHA(图4A)暴露18小时后，对PC-3培养物的整体细胞活力产生影响，将活力降低至88.56±5.4%（尽管这没有达到统计显著性(P（P）=0.168)).

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欧米茄-3和ω-6 PUFA不会降低PC-3细胞的活力，但只有AA诱导细胞侵袭。(一个)显示AA、DHA或EPA剂量增加对PC-3细胞活力的影响的图表（通过台盼蓝排除法测定）(n个=2). (B类)显示AA浓度增加刺激效应的直方图(C类)EPA和(D类)DHA对18小时内通过Matrigel侵入PC-3数量的影响。数据表示每个视野的平均细胞数加上四个独立实验产生的标准误差条(n个=4).

为了确定ω-3和ω-6 PUFA诱导PEC侵袭，将指数增长的PC-3细胞接种到Matrigel-coated细胞培养插入物上，高于TCP、人类BMS或递增剂量（5-100μM（M）)AA、DHA或EPA。在37°C和5%CO下18小时后2计数侵袭细胞数。花生四烯酸浓度⩽50μM（M）被证明是入侵的有力刺激因素(图4B)，浓度为⩾5μM（M）诱导BMS发生类似程度的侵袭（5μM（M）AA；P（P）=0.17). 即使存在雄激素，花生四烯酸也不会诱导LnCaP或PNT2-C2细胞系侵袭(补充图2).

相比之下，EPA和DHA(图4C和D)在TCP背景水平以上未显著诱导入侵(P（P）⩾0.05），10除外μM（M）EPA可诱导PC-3细胞侵袭性轻微但无显著增加（418.5±45.2与380.3±39.6;P（P）=0.347). 二十碳五烯酸浓度⩾50μM（M）与TCP相比，诱导侵袭PC-3细胞数量减少（325.9±35.2和283±21.6与50时为380.3±39.6μM（M）和100μM（M））尽管这些减少并不显著(P（P）=0.576和P（P）分别为0.144）。DHA含量为5μM（M）浓度a细胞侵袭性无显著降低（260.8±33.8与380.3±39.6;P（P）=0.098）。

ω-3抑制ω-6-刺激PEC侵袭

AA的增殖潜能被添加ω-3个PUFA(洪恩等1994年;罗斯，1997;诺里什等, 1999). 我们试图确定ω-3 PUFAs对富含AA的环境会降低诱导入侵水平。图5A和B显示了向含有10μM（M）AA作为刺激物，并与TCP和BMS进行比较。

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添加ω-3 PUFA抑制ω-6诱导PC-3侵袭。直方图显示了(一个)EPA或(B类)DHA通过Matrigel入侵PC-3的时间为18小时到10小时μM（M）AA.数据表示每个视场的平均细胞数加上三个独立实验产生的标准误差条(n个=3).

EPA和DHA都是AA刺激入侵的有效阻滞剂。二十碳五烯酸和DHA，浓度⩾5μM（M）完全抑制了对10的入侵μM（M）AA诱导的侵袭程度与TCP相似（776.8±74.1与858.7±55.1;P（P）=0.396和723.7±68.1与858.7±55.1;P（P）=0.154，与5的TCP相比μM（M）EPA和DHA）。

PGE2恢复ω-6在存在ω-三

确定ω-3抑制AA诱导的恶性PEC侵袭，我们用10μM（M）AA被20封μM（M） ω-3 PUFA和试图通过添加AA代谢物5-HETE、12（S）-HETE、15（S）-HETE和PGE2恢复入侵。所有AA代谢物通过Matrigel基底膜刺激PC-3细胞侵袭的能力都被滴定，并在随后的实验中以最佳浓度使用（数据未显示）。

图6A–C显示添加AA脂氧合酶产物、5-HETE、12（S）-HETE和15（S）-HETE对PC-3侵袭10μM（M）AA在DHA或EPA（20μM（M）). 尽管5-HETE(图6A)自身未诱发入侵（748.7±43.3与719.6±43.4（5-羟乙基纤维素与TCP），P（P）=0.64），添加100 nM（M）5-HETE至AA被20阻止μM（M）EPA诱导PC-3侵袭显著恢复（931.3±68.4与719.6±43.4;P（P）=0.00457），与EPA控制相比。尽管增加了100 nM（M）5-HETE至AA被20阻止μM（M）与DHA对照组相比，DHA诱导的PC-3侵袭不显著（844±52.4与719±43.4;P（P）=0.1425).

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DHA和EPA通过阻断前列腺素E抑制AA诱导的侵袭2合成。显示AA代谢物5-HETE（100 n）影响的直方图M（M）)，12（S）-HETE（300 nM（M）)，15（S）-HETE（1μM（M）)或PGE2（10ng/ml）通过Matrigel恢复PC-3细胞对AA的侵袭（10μM（M）)通过增加20个μM（M）EPA、DHA或COX-2抑制剂NS398。数据表示每个视场的平均单元数加上六个独立实验生成的标准误差条(n个=6).*=P（P）值⩽0.05与ω-3控制；**=P（P）与TCP控制相比，值⩽0.05；***=P（P）与AA相比，值⩾0.05。

15（S）-羟基二十碳四烯酸(图6B)与TCP相比，诱导PC-3细胞侵袭（769±38.7与641.8±29.8;P（P）=0.016），在EPA阻断的AA（803.3±67.6）存在的情况下，PC-3侵袭部分恢复与584.5±44.6,P（P）=0.0222，与EPA阻断AA控制相比）。然而，添加15（S）-HETE并没有释放被DHA阻断的系统(P（P）=0.4887与DHA对照组相比）。12（S）-羟基二十碳四烯酸类15（S）-HETE(图6C)PC-3自身入侵，诱导802.6±30.4与691±38.6细胞入侵(P（P）=0.0333（与TCP相比）。与5-HETE和15（S）-HETE一样，12（S）-HETE只能释放EPA诱导的侵入性阻滞，导致935.9±49.6与774.8±40.3细胞浸润(P（P）=0.01944），与EPA控制相比。

前列腺素E2被证明是PC-3侵袭的有力刺激物，10 ng ml−1诱导类似AA水平（915.42±64.5与997.8±55.5;P（P）=0.3431). 添加10 ng ml−1PGE2至入侵阻断系统，有10个μM（M）AA作为主要刺激物，20μM（M）EPA、DHA或8μM（M）NS-398阻止入侵(图6D)导致AA诱导的侵袭完全恢复（997.8±55.47与1022.8±84.7 (P（P）=0.8042), 911.8±46 (P（P）=0.2452），974.3±14(P（P）=0.6841）对于AA与EPA+PGE2、DHA+PGE_2和NS-398+PGE_3）。

只有EPA阻止入侵BMS

为了确定ω-3抑制恶性PEC对人类BMS的侵袭，在体外在EPA或DHA浓度不断升高的情况下，利用人类BMS作为入侵目标进行共培养检测(图7A和B). 二十碳五烯酸浓度⩾20μM（M）减少对BMS的侵袭（655.8±55.8(P（P）=0.04085）和535.3±44(P（P）=0.0003)与20和50时为796.2±21.4μM（M）与BMS相比，DHA的浓度高达100μM（M）(P（P）=0.2905（与BMS相比）。

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PC-3细胞对BMS的侵袭依赖于骨髓脂肪细胞和ω-6代谢。(一个)剂量增加（5–50）时PC-3细胞对BMS的侵袭μM（M）)美国环保局。(B类)剂量增加（5-100）时PC-3细胞对BMS的侵袭μM（M）)DHA。数据表示每个视场的平均单元数加上三个独立实验生成的标准误差条(n个=3). (C类)5周龄人类骨髓培养物的显微照片，在0.5μM（M）氢化可的松，显示存在造血中心和脂肪细胞，或在没有氢化可替松的情况下，显示基质发育和脂肪细胞缺失。(D类)PC-3细胞对BMS的侵袭，在存在或不存在0.5的情况下生长μM（M）氢化可的松（无HC），含或不含10μM（M）AA.数据表示每个视场的平均细胞数加上三个独立实验产生的标准误差条(n个=3).*=P（P）与BMS相比，值⩽0.05；**=P（P）与TCP相比，值⩽0.05。

AA恢复衰竭BMS的侵袭能力

探讨AA在刺激BMS侵袭中的潜在作用体内，在体外使用长期在氢化可的松存在或不存在的情况下生长的人类BMS构建共培养入侵模型，氢化可迪松对BMS中脂肪细胞的形成至关重要(图古德等, 1980)因此造血(德克斯特等1977年). 我们利用这些培养物作为无脂BMS的来源。图7C显示了5周龄人类BMS培养物的显微照片，这些培养物来自于在有或无0.5μM（M）氢化可的松。两种培养物都产生了相似的融合BMS成纤维细胞。然而，在没有氢化可的松的情况下，没有造血或脂肪细胞聚集的迹象。

然后，与正常BMS相比，评估氢化可的松耗尽的BMS作为入侵刺激物的能力，并测定AA恢复入侵的能力(图7D). 氢化可的松耗尽的BMS通过Matrigel弱刺激PC-3侵袭（838.6±59.6与688.5±61.1;P（P）=0.1096，与TCP相比），但与对照BMS相比是一种明显较弱的刺激(P（P）=0.0059). 添加10μM（M）氢化可的松耗尽的BMS中的AA恢复了该BMS诱导侵袭的能力，测量到的侵袭水平与正常BMS诱导的水平相当，还补充了10μM（M）AA（1280±43与1308±42.9;P（P）=0.655）。

讨论

饮食，尤其是PUFA在CaP中的作用一直是一个极具争议的话题，流行病学研究产生了关于ω-6和ω-3 PUFAs在CaP发病和进展中的作用。体外对这两个PUFA家族在CaP中的作用的研究为其作用的潜在机制提供了一些见解。基本代谢ω-6 PUFA LA导致AA的产生，在5（S）-HETE的情况下，其代谢产物可保护PEC免受凋亡和诱导增殖，在12（S）-HETE的情况下可诱导内皮细胞侵袭和血管生成体内导致形成更大的肿瘤。这些影响已被证明通过使用ω-3个PUFA(罗斯和康诺利，1999年). 在这项研究中，我们首次探讨了PUFAs在刺激BMS转移转移中的作用，因为前列腺癌对造血骨髓有已知的偏好。这项研究首次证明了ω-3 PUFAs对细胞迁移有抑制作用在体外从而可能发生转移。

癌细胞以特定位置的方式迁移的方式，尤其是前列腺癌等一些癌症对红骨髓的偏爱的原因尚不清楚。有许多潜在因素可能会产生影响，但目前还没有具体的已知机制。CXCR4/SDF-1轴被认为在此过程中至关重要(泰奇曼等, 2002;太阳等, 2003)但我们之前已经表明，这只是BMS产生的侵入性刺激的一部分(雄鹿等, 2005). BMS是一个富含油脂的环境，脂肪细胞的存在对造血过程至关重要(德克斯特等, 1977). BMS微环境的脂质相关研究表明，脂质成分由多种脂肪组成，包括油酸（35.2±4.9%）、棕榈酸（27.8±2.5）、棕榈油酸（8.1±2.7%）、硬脂酸（6.3±1.4%）和亚油酸（12.3±2.7–15.3±2.9%）(苏米达，1965年;德尼佐等, 1999). 花生四烯酸是LA的代谢物，也存在于BMS中，尽管BMS血浆中的浓度从2.5±0.9%到细胞成分中的9.52±0.4%不等(德尼佐等, 1998). 随着身体年龄的增长，脂肪组织/黄色骨髓的数量增加（每十年增加10%(康普斯顿，2002))脂肪细胞显著增加(麦尼埃等, 1971;罗兹曼等, 1989). 利用我们的共同文化在体外在BMS侵袭模型中，我们发现骨转移CaP细胞系PC-3积极寻找并向BMS的脂肪细胞富集区移动。在骨髓脂肪细胞存在的情况下，观察到PC-3细胞以时间依赖的方式主动摄取脂质(图1，​,22和​和3）。三). 脂类摄取的作用目前尚不清楚，但脂类可能被用作能量底物，以满足细胞加速代谢的需要，众所周知，这是转移性恶性细胞的特征，事实上，已经证明前列腺癌细胞与脂肪细胞相互作用。德田等(2003)表明PC-3/脂肪细胞共培养可诱导PC-3增殖和分化。LA转化为AA导致AA代谢产物PGE2、5-HETE、12（S）-HETE和15（S）-HETE的产生。PGE2和5-HETE均显示具有CaP增殖特性。研究人员休斯·福福德等(2005)证明⩽10μM（M）AA通过增加cPLA2和COX-2的表达，分别增加五倍和三倍，从而诱导PC-3增殖，随后PGE2水平增加。12（S）-羟基二十碳四烯酸还通过增加血管生成并随后减少坏死来增加前列腺肿瘤的生长，但它也被证明在CaP的转移过程中具有不同的作用，包括增强细胞运动(洪恩等1994年;高等, 1995). 与PGE2、5-HETE和12（S）-HETE不同，15（S）-HETE与良性前列腺组织相关。大多数CaP中15（S）-HETE的形成减少(沙佩尔等, 1999)作为PPARγ激动剂(沙佩尔等, 2001)，一种抑制乳腺增生的作用(米勒等, 1998)，冒号(布罗克曼等, 1998)和膀胱(布罗克曼等, 1998)癌细胞系。

LA及其代谢产物AA是正常BMS脂肪细胞脂质组成的主要成分(苏米达，1965年;德尼佐等, 1998;德尼佐等, 1999)前列腺癌患者的AA水平下降(马马拉基斯等, 2002)，我们试图测定脂质摄取率。在10的存在下培养PC-3细胞μM（M）AA和尼罗河红染色后迅速从当地环境中吸收PUFA（15分钟内），45分钟后达到最大吸收水平。AA水平随后随时间降低，表明AA代谢为PGE2(休斯·福福德等, 2005)或HETE。这种潜在的AA快速代谢，与患者数据相关(马马拉基斯等, 2002;法亚斯等, 2003)表明AA环氧化酶和脂氧合酶产物可能是癌症过程的重要组成部分。

该研究由(马马拉基斯等, 2002)还表明，尽管CaP和BPH患者前列腺组织中的AA降低，但脂肪组织中的AA水平没有显著差异。因此，我们假设富含脂肪细胞的BMS中AA的水平可能在CaP患者中保持，并作为转移性PEC的引诱剂。使用我们的内部在体外入侵检测结果表明，AA是一种有效的入侵刺激物，诱导的入侵程度与BMS相似。这一系列实验表明，AA比SDF-1更能刺激入侵(雄鹿等, 2005)这可能是BMS侵袭的主要信号，导致骨骼和骨髓代谢的特征性紊乱。

BMS发出的AA信号的重要性在我们的在体外利用在氢化可的松存在或不存在的情况下生长的初级人类BMS培养物的共培养模型(图7C和D).图古德等(1980)显示在没有氢化可的松的情况下培养的BMS中的间充质祖细胞不能分化为脂肪细胞。在没有脂肪细胞的情况下，BMS诱导PC-3侵袭，但其侵袭水平明显低于富含脂肪细胞的BMS。观察到的少量侵袭可能是由于BMS产生了其他因子，如SDF-1，之前已经证明SDF-1可以诱导PC-3的侵袭(雄鹿等, 2005). 添加10μM（M）AA完全恢复了无脂肪细胞BMS诱导PC-3侵袭的能力，表明AA具有诱导侵袭的潜能。

Omega-3 PUFAs，尤其是海洋PUFAs、EPA和DHA，已被证明可以抑制前列腺癌和乳腺癌细胞的增殖在体外和体内.的作用方式ω-3 PUFA通过与AA竞争环氧合酶和脂氧合酶，导致产生代谢不活跃的产品，如Δ17-6-酮-PGF和TXB三（在中审查罗斯和康诺利，1999年). 此外ω-3 PUFAs与发展侵袭性/转移性CaP的风险降低有关(特里等, 2001;奥古斯森等, 2003). 流行病学证据表明ω-3个：ω-饮食中的比例为6，并且该比例的降低与侵袭性疾病的风险增加有关(罗斯和康诺利，1999年). 这在日本人和爱斯基摩人的饮食中最为明显，他们的饮食习惯是ω-3 : ω-由于鱼类摄入量高，比例为6。在过去的几十年里，这已经改变为一个更加西方化的低点ω-3 : ω-6饮食会增加双乳风险(温德牌手表等, 1991)和前列腺癌(拉尼尔等, 1976;拉尼尔等, 1996).

在这里，我们演示了ω-3多不饱和脂肪酸DHA和EPA是对AA入侵的强大抑制剂，能够以1:2的比例阻断入侵ω-3 : ω-6 (图5). 主要区块是通过添加10 ng ml COX-2生产PGE2−1PGE2至ω-3或NS-398 COX-2抑制剂阻断系统恢复PC-3侵袭水平(图6D). 在实验动物模型中，使用COX抑制剂（如非甾体抗炎药）或特定COX-2抑制剂（如塞来昔布、罗非昔布和NS-398）对PGE2生成的治疗性阻断显示出抑制肿瘤生长和转移的潜力(Dandekar和Lokeshwar，2004年;帕特尔等, 2005). 然而，在VIGOR和APC试验期间观察到COX-2抑制剂增加了心血管事件的风险后，人们担心克罗茨等, 2005;罗等, 2005). 与合成COX-2抑制剂不同，EPA和DHA可降低心血管疾病和心脏性猝死的风险(Holub和Holub，2004年;哈里森和阿比扬卡，2005年). 试验表明，早期给药1 g天−1 ω-3种PUFA补充剂可将心脏性猝死风险降低45%，总死亡率降低20%(马尔基奥利等, 2002)每天的剂量高达4克−1剂量可以耐受（请参阅哈里森和阿比扬卡，2005年). 因此，我们建议在饮食中使用DHA和EPA不仅可以影响增殖，还可以用于CaP的抗转移治疗。

数据表明，DHA和EPA也可能作用于参与入侵的不同途径。图5显示这两个5μM（M）DHA和EPA将PC-3的侵袭降低到与非定向迁移相似的水平，但添加脂氧合酶产物5、12（S）和15（S）-HETE显示出不同的恢复模式(图6). 在EPA存在的情况下，添加HETE能够部分恢复AA的侵袭作用，但不能消除DHA阻断。令人惊讶的是15（S）-HETE，由于15-LOX-2表达缺失，PC-3不是从AA中产生的，它在抑制ω-6-诱导PEC增殖(沙佩尔等, 1999;沙佩尔等, 2001)，部分恢复了EPA阻断的PC-3侵袭。然而，向被EPA或DHA阻断的系统中添加PGE2完全恢复了对AA或BMS的入侵ω-3种PUFAs抑制PC-3对原代BMS培养物的侵袭(图7A和B). 只有EPA能够阻止入侵BMS，尽管浓度较高（20-50μM（M）)比单一栽培入侵试验中观察到的要多。这可能是由于在共培养物中已经存在PGE2和HETE，这是由于ω-6个PUFA由BMS内的细胞组成。然而，在这个系统中，DHA无法阻止BMS的侵入性刺激，即使最终浓度为100μM（M）.

总之，我们提供了在体外支持流行病学数据的证据表明ω-3 : ω-6在确定CaP中转移性疾病的风险方面是至关重要的。花生四烯酸是PEC侵袭的有力刺激物，是将转移的PEC导向BMS形成骨转移刺激物的主要成分。正如流行病学数据显示的那样ω-3 : ω-6多不饱和脂肪酸，尤其是增加饮食中EPA的含量，可以通过阻止PGE2的产生来抑制转移过程，从而降低侵袭性疾病的风险。

致谢

这项工作得到了AICR 04-518拨款和MRC Northern ProMPT合作的支持。我们感谢CR-UK Paterson Institute组织学系的Gary Ashton和Caron Abbey对PC-3 BMS/前列腺成纤维细胞共培养进行油红O染色，感谢CR-UK-Paterson研究所细胞测量设施的Jeff Barry和Mike Hughes对FACS进行分析。

脚注

补充信息随附《英国癌症杂志》网站上的论文(网址：http://www.nature.com/bjc)

补充材料

补充图1a

补充图1b

补充图2

补充图形图例

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文章来自英国癌症杂志由以下人员提供英国癌症研究