减轻体重是基因敲除对小鼠的常见影响
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1 ,1和1 1美国费城莫内尔化学感官中心
通讯作者。 收到日期：2007年7月4日；2008年1月8日接受。
版权©2008 Reed等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
在小鼠基因组的一个小区域中寻找肥胖候选基因的过程中，我们注意到许多基因被敲除后会影响体重。为了确定这是基因敲除的一般特征还是偶然发生，我们调查了杰克逊实验室小鼠基因组数据库中的敲除小鼠菌株及其表型。并非所有菌株的体重都可用，因此我们还通过联系负责基因敲除菌株的随机调查人员样本来获得体重信息。
结果
我们将每个基因敲除小鼠菌株分为（1）与对照组小鼠相比，（2）更轻和更小，（3）更大和更重，或（3）相同的重量。我们排除了在生命早期死亡的基因敲除菌株，尽管这种致命性通常与小胚胎或体型缩小有关。根据1977年基因敲除菌株的数据集，我们发现31%的活基因敲除小鼠菌株体重比对照组轻，另有3%的小鼠体重比对照鼠重。
结论
在大约三分之一使用基因敲除小鼠的实验中，体重可能是一个潜在变量，在解释实验结果时应考虑体重，例如在高血压、药物和激素代谢、器官发育、细胞增殖和凋亡、消化、心率或动脉粥样硬化的研究中。如果我们假设我们调查的敲除基因具有代表性，那么预测超过6000个基因会影响小鼠的大小。体重是高度遗传的，许多数量性状基因座已在小鼠中绘制出来，但“多基因”对于可能导致这种复杂性状的数千个基因座来说是不够的。
背景
体重控制的机制无疑是复杂的，但很少有人尝试准确评估其复杂程度。为了测量体重谜题中的片段数量，我们试图估计涉及的基因数量。一种方法是逐个研究敲除所有小鼠基因对体重的影响。酵母和蠕虫也有类似的作用，但对老鼠来说，这可能要几年甚至几十年后才能实现[1,2]. 因此，我们将重点放在现有信息上：小鼠基因组数据库（MGD），这是一个由Jackson实验室创建和维护的敲除菌株及其表型的数据库[三,4]. 在小鼠中，约有10%的已知基因已无效，研究了等位基因的影响，结果保存在本在线简编中。我们对MGD进行了一项调查，目的是估计小鼠中影响体型的基因比例。
结果
数据集包含1977年淘汰菌株的信息。在具有体重信息的活的敲除菌株中，与参考组相比，65.5%的菌株体重无差异，31.3%的菌株体重减轻，3.1%的菌株体重增加（【方法中的EQ2】；表，图). 这些差异并不是由于遗传背景混合或同源岛屿造成的，因为在统一遗传背景下的敲除小鼠体重表型发生率略高于在混合背景下的小鼠（38%对32%）。
与对照组相比，具有三种体重结果之一的存活小鼠敲除菌株的比例：增加、减少或不变。左边的图表显示了从在线数据库（小鼠基因组数据库）中提取的数据，该数据库描述了小鼠敲除菌株的特征，右边的图表总结了通过电子邮件进行的调查，调查人员最初没有描述敲除菌株体重，但在询问时提供了信息。
表1
| 类别 | KO菌株（N） |
| 不可行 | 542 |
| 无BW信息 | 1078 |
| BW相同 | 234 |
| BW减少 | 112 |
| BW增加 | 11 |
| N总菌株 | 1,977 |
大约一半的条目包含体重信息，27%的条目涉及不可行的菌株[EQ3 in Methods]。虽然“非活性”敲除菌株通常有小胚胎或新生儿，但这些并不包括在体重减轻的总数中。一些基因被多次敲除，但我们是否包括或排除这些多重敲除菌株对结果影响不大。在我们通过电子邮件进行的105次后续调查中，43名调查人员提供了信息，使我们能够对敲除菌株的体重进行分类，39名调查人员没有回应，12个电子邮件地址无法送达，11名调查人员回应但无法提供关于小鼠体重的具体信息，或者根据我们的定义，基因敲除菌株被确定为无效。在43个可用的应答中，9个敲除菌株减轻了体重（21.0%），2个菌株增加了体重（4.6%），其余菌株的体重没有差异（74.4%）。这些频率与MGD（X）调查中获得的频率没有差异2(2)=2.1，NS）。2000年或之后研究的敲除菌株在体重或生存能力方面没有与之前研究的菌株不同的趋势（p>0.05）。
假设我们调查的六条染色体的敲除株MGD中包含的信息代表了小鼠基因组中25613个基因[5]，我们估计6916个基因是不可或缺的【25613个基因×0.27，不可或缺的基因比例】，5852个基因在无效时降低体重【18697个可有可无的基因×0.313，降低体重的可有可无的基因比例】，580个基因增加体重[18697个可有可无的基因×0.031，可有可有的基因增加体重的比例]。
讨论
小鼠基因的无效等位基因通常会减少但有时会增加体重，这一观察并不新鲜[6]. 然而，据我们所知，以前没有研究过基因敲除对小鼠体重的一般影响，因为这些类型的敲除研究是为了解决有关特定基因的特定研究问题。为了公正地评估基因敲除对体重的总体影响，我们阅读了六条染色体上每个敲除基因的小鼠基因组数据库记录，并记录了关于体重的评论。基于此分析，我们估计6000多个基因可能影响小鼠的体型。在具有不必要的空等位基因的基因中，约30%导致小鼠体重减轻，另有3%导致相对于具有完整基因的小鼠体重增加。基因组偏向于体重增加，增加体型的基因是减少体型的基因的10倍。这一观察结果与小鼠“精力充沛”以促进正能量平衡的说法一致[7].
这项调查是一项观察性研究，这种方法的注意事项值得考虑。一个局限性是几乎一半被调查菌株缺乏信息；然而，我们初步认为，缺乏信息不会对结果产生明显的偏差。无论是MGD中的数据还是通过随访调查获得的数据，结果的模式都是相似的。另一个需要考虑的问题是，基因并不是随机挑选出来进行敲除的，而是由研究人员出于自己的目的将其作为“家庭手工业”[8]. 因此，我们强调MGD中列出的10%的基因不太可能是所有基因的代表性样本。然而，我们评估了随时间的变化，发现表型频率（体重或致死率）没有变化。第一个基因敲除菌株的体重表型没有明显的趋势。我们将所有在断奶后没有存活下来的敲除菌株排除在减重类别之外。许多致命毒株在发育过程中都很小，如果我们把它们包括在减轻体重的基因估计中，“体重基因”的数量就会高得多。这个决定是保守的，因为可以合理地假设，虽然特定基因的无效等位基因可能是致命的，但同一基因的亚型可能是可行的，但体重会减轻。这些观点共同表明，这里报道的结果很可能低估了体重基因的数量，而不是高估了体重基因数量。
我们对小鼠正常发育所必需的基因数量的估计比其他人要多。例如，淘汰老鼠项目[9]一项旨在建立基因敲除小鼠菌株知识库和数据库的国际努力估计，15%的基因是不可或缺的，而我们在本次调查中确定的这一比例为27%。我们的估计值几乎是苍蝇、蠕虫和酵母可比值的两倍[10-13]. 小鼠的基因可能比苍蝇、蠕虫或酵母更脆弱，因此小鼠的无效突变可能更重要；或者，如前所述，在小鼠中选择敲除基因可能会使结果偏向于最不可或缺的基因。这也可能是因为要求小鼠在断奶前存活增加了不可或缺的基因的比例，超过了蠕虫、苍蝇和酵母的比例，而它们的发育期没有可比性。
本研究中要考虑的另一个问题是小鼠的饮食，以及这可能会如何加剧或掩盖体重影响。研究体重和肥胖的研究人员通常会尝试喂食能量密集型饮食，如果空等位基因在小鼠首次接受标准饮食测试时没有影响。如果敲除小鼠在喂食这种饮食时体重没有增加，它们被视为“对饮食性肥胖有抵抗力”。值得知道的是，如果喂食高脂肪饮食，有多少非专门用于研究肥胖的敲除小鼠菌株在体重上会有所不同。在酵母中，系统地去除每一个基因，并用各种营养物质和饲养条件进行测试，表明多达40%的缺失基因的酵母菌株具有生长表型[14]. 同样，如果喂食高热量饮食，与对照组小鼠相比，更多的小鼠敲除菌株可能改变了体重。
这项调查的结果表明可以影响小鼠体重，而不是影响实际发生的自然等位基因数量做影响体重。人们可能会怀疑，如果普通小鼠中没有自然出现的同等严重程度的等位基因，那么将带有人为空等位基因的基因称为“体重”基因是否合理。“体重基因”这一定义的实用性在一定程度上取决于所解决的特定科学问题。对于网络生物学家来说，这种逐个基因敲除的方法不仅有效，而且可取。无效（或严重亚形态）等位基因的存在不如该基因是否以某种方式参与体型的发育或维持重要。然而，遗传学家可能会发现“体重基因”这一特殊概念很麻烦：如果一个基因在小鼠群体中不是等位基因，那么研究体重遗传的人可能对它没有兴趣。这两种观点可以通过理解任何可以在实验室中无效的基因都可能在小鼠群体中有一个可比较的等位基因来调和，因此问题被简化为一个等位基因频率问题；即，空等位基因多久出现一次并持续存在？目前，我们无法估计自然等位基因和影响小鼠群体体型的基因数量，但这项调查确实为具有无效等位基因的单个基因数量设定了上限。
这些数据的含义超出了基因网络和个体体型差异的问题。相当大比例的基因敲除小鼠产生的目的是为了了解特定的特征，它们会受到体重改变及其后果的副作用。如果没有适当的控制，这些结果可能会混淆简单的解释；这些结果归因于该基因的特定效应，而可能是由于与低体重相关的一般效应。研究人员已经敏锐地意识到这类问题，并开发了几种方法来补救它，例如有条件和/或组织特异性淘汰。对敲除基因表达的更多控制是否会减少对体重的总体影响尚不清楚。不管基因敲除技术的进展如何，小鼠中任何自然出现的空等位基因都会像这里研究的基因敲除菌株一样发挥作用：基因在其表达的所有组织中都是空的，并且在每个发育阶段都会是空的。
在本次调查过程中，我们没有尝试量化敲除小鼠菌株相对于对照组小鼠的体重变化程度，这是此类调查方法的一个值得注意的局限性。对于某些基因敲除菌株，小鼠的体型较小是显而易见的，而且研究人员通常没有量化这种减少，他们报告说，与对照组相比，这些小鼠“较小”或“发育迟缓”。在某些情况下，重量差异以野生型的百分比报告，例如，“比对照小鼠小10%”，但没有进行统计测试。大约十分之一的影响体重的基因在缺失时产生了较大而非较小的小鼠，这一结果提供了对负反馈基因数量的粗略估计。一项精确的测量将要求用标准化的数据收集程序对所有敲除小鼠菌株进行评估。
另一个警告是，基因敲除的所有影响不一定都是由于无效基因本身造成的。用于构建这种结构的胚胎干细胞系通常来自129个小鼠菌株中的一个，产生的敲除菌株通常是C57BL/6J（B6）和129个DNA的嵌合体[15]. 一些研究人员建议利用敲除菌株的这一特性来定位QTL[16]但这种情况给小鼠敲除研究的解释带来了问题。如果无效等位基因处于混合遗传背景，则尚不清楚敲除组和野生型组之间观察到的任何性状差异是由于无效基因本身还是由于背景基因型。即使在广泛回交之后，侧翼DNA的一个有影响力的“同源足迹”仍然存在[17]. 这一点与体重研究特别相关，因为用于构建敲除小鼠的常见菌株中有许多QTL[18-21]. 然而，我们发现基因背景一致的敲除菌株有轻微的较高的与遗传背景混合的人相比，体重变化率。因此，这些类型的影响不太可能解释本次调查中观察到的敲除小鼠体重变化的大部分。
我们对这项调查的兴趣始于我们评估基因作为连锁峰值下的候选基因，并注意到具有体重表型的敲除基因比我们预期的要多得多。复杂遗传学中的一个问题是，显著的连锁峰在多大程度上由一个具有大效应等位基因的基因组成，或者由许多具有较小效应的基因组成。这些调查结果并没有解决这个难题，但它们确实表明，最初关于敲除菌株通常会减轻体重的观察是准确的。这一认识使我们重新评估了多个基因导致一个QTL峰值的可能性。此外，如果敲除时约三分之一的活基因减少或增加体重，那么仅敲除实验可能无法提供令人信服的证据来验证QTL分析所建议的体重候选基因。了解体重是如何由这个基因网络决定的，是一个巨大的挑战。第一步是确定问题的规模，这项调查已经初步回答了这个问题。
结论
与对照组小鼠相比，有百分之三十一的活基因敲除小鼠株体重减轻，百分之三体重增加，表明基因敲除鼠株的体重变化很常见。从这些结果推断，与其他方法相比，更多的基因对小鼠体重有贡献。
方法
数据库记录的提取和编码
本研究中使用的数据是通过对MGD的查询和对研究人员的电子邮件调查获得的，这些研究人员保存了关于敲除小鼠的信息，但在原始报告中没有提及体重。条目摘自MGD表型和等位基因子数据库，2006年8月15日。我们将搜索范围限定为随机染色体子集（1、2、7、16、18和19）上的所有记录（定义如下）。敲除小鼠菌株的所有已发表表型信息最初由Jackson实验室的工作人员提取，并在数据库中编目，该信息的摘要称为记录。对于我们选择的子集中的每条染色体，我们读取了每个敲除菌株的每条记录，并且提供的关于体重的信息由我们中的一个人编码（MPL）。如果菌株是双基因敲除，如果无效等位基因干扰了相邻基因，或者如果菌株是杂合的，即具有一个完整的和一个无效的等位基因，则将其排除在考虑范围之外。
由于该数据库捕获了个别研究人员提供的信息，因此有关体重和体型的信息的程度和类型在不同的记录中有所不同。最终名单上的每一个敲除菌株（N=1977）被分为五类：（a）不活动，（b）体重没有变化，（c）体重减轻，（d）体重增加，或（e）没有体重信息。因为这种分类依赖于关于不同类型信息的决策，所以这里我们提供了分类决策的详细描述，以便其他研究人员可以重复此分析。
（a）类包括断奶后不能存活的敲除菌株（不能存活）。被描述为“胚胎致死”的菌株，以及出生时活下来但出生后不久就死亡的小鼠，都属于这一类。我们还将出生时存活但在常规护理下存活至断奶的小鼠不到60%的菌株纳入这一类别。“大多数”一词被解释为超过60%，因此用“大多数小鼠在断奶前死亡”这一短语描述的菌株被归类为不能存活。有时，研究人员通过手动喂食或使用其他类型的支持物来延长小鼠的寿命，我们也将这些菌株归类为无效菌株。
有体重信息的其余存活小鼠菌株被分为（b）、（c）或（d）类。如果研究人员特别指出体重相同，或者如果他们报告小鼠正常或与相关对照小鼠无法区分，则将该菌株归类为（b）类。换句话说，如果研究人员报告说“敲除小鼠是正常的”，我们将该菌株列入（b）类。如果小鼠在发育过程中的任何时候体型较小，则该菌株属于（c）类。这是一个重要的观点，因为研究人员偶尔提到的一种模式是，基因敲除小鼠在早期很小，但随着年龄的增长，它们会赶上或接近赶上。第（d）类包括敲除小鼠的菌株，其平均大小大于参考组的小鼠。
为了减少错误，第二位研究者（DRR）对菌株的子集进行了分类，并对这些决定进行了比较，发现这些决定是一致的。我们还注意到（a）发表基因敲除表型报告的年份，以评估随着时间推移的致死模式和体重影响，以及（b）基因敲除菌株是否具有统一或遗传混合背景。
调查可能导致基因敲除效应估计偏差的缺失信息
研究人员制造基因敲除小鼠是为了解决通常和体型无关的特定研究问题，所以有时并没有提及体重。为了了解这些缺失的数据如何影响本次调查的结论，我们联系了这些调查人员中的一部分，要求他们提供有关体重的详细信息。我们随机选择了105只研究人员报告的活小鼠，但没有体重信息。我们通过MGD记录或互联网搜索获得了存款人的电子邮件地址。随后发送了一封电子邮件，简要解释了调查结果，并要求提供有关敲除菌株体重的信息。存款人的回复由我们中的一人（MPL）阅读，并按照上述策略进行编码。我们将原始MGD记录中报道的相同、减少或增加体重的敲除菌株比例与使用2经检验，以p<0.05为显著性标准。
估计基因敲除对体重的影响
首先，我们利用体重信息计算了活菌株的数量（N）[EQ1]。使用该值，计算体重不变（b）、减少（c）和增加（d）的活菌比例[EQ2]。计算（a）类（非活性）敲除菌株的比例[EQ3]，并将其用作不可或缺基因比例的估计：
我们利用这些比例推断出小鼠基因组，并估计零等位基因可以改变体重的基因总数。这些计算分两步完成，使用最近的小鼠基因组注释估计的已知基因总数[5]. 在EQ4A中，通过将已知基因的总数乘以非活性敲除菌株的比例（取自[EQ3]）来计算必需基因的比例。可有可无的基因数量是通过从基因总数中减去不可或缺的基因数量得到的[EQ4B]。在EQ5中，可有可无的基因数量（取自[EQ4B]）乘以减少体重的无效等位基因比例（取自[EQ2]）。对于增加的和不变的体重，也进行了类似的计算。
一个担忧是，数据库中列出的菌株并不具有代表性，因此存在偏见，因为最有趣的基因首先被敲除。为了确定是否随时间发生变化，我们使用了一个2对2000年之前发表的报告和2000年或之后发表的报告中每类小鼠的比例进行比较（这两组的记录数量大致相同）。
作者的贡献
MGT构思并设计了这些实验。MLP进行了实验。MLP和DRR分析了数据。MGT和DRR撰写了这篇论文。
致谢
资金由国家卫生研究院拨款DK-46791、AA-12715和DK-58797提供。霍华德·丹、苏珊·麦克拉奇和科林·弗莱彻为我们提供了关于小鼠基因组数据库的专家建议。Alexander A.Bachmanov、Gary K.Beauchamp、Claude Bouchard、Myles Faith、Mark I.Friedman、Amanda H.McDaniel、R.Arlen Price和Karen Teff对手稿发表了有益的评论。感谢回答我们电子邮件查询的调查人员的帮助。Patrick Nolan和Helmut Fuchs分享了未公开的信息，他们的帮助得到了认可。
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