美国国家科学院院刊。2008年2月5日；105(5): 1516–1521.
MicroRNA-126调节血管细胞粘附分子1的内皮表达
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约书亚·T·门德尔
‡儿科，
¶分子生物学和遗传学，以及
§约翰霍普金斯大学医学院遗传医学研究所，马里兰州巴尔的摩，邮编21205
查尔斯·洛温斯坦
*细胞和分子医学计划
以下部门†医学，
‖病理学，以及
*细胞和分子医学计划和
以下部门†医学，
‡儿科，
‖病理学，以及
¶分子生物学和遗传学，以及
§约翰霍普金斯大学医学院遗传医学研究所，马里兰州巴尔的摩，邮编21205
编辑：Richard A.Flavell，耶鲁大学医学院，康涅狄格州纽黑文，2007年12月12日批准
作者贡献：T.A.H.、J.T.M.和C.J.L.设计的研究；T.A.H.、M.Y.和M.F.进行了研究；T.A.H.、J.T.M.和C.J.L.分析数据；T.A.H.和C.J.L.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持性数字
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摘要
活化内皮细胞表达的粘附分子在调节白细胞向炎症部位的转运中起着关键作用。静止的内皮细胞通常不表达粘附分子，但细胞因子激活内皮细胞表达粘附分子如血管细胞粘附分子1（VCAM-1），其介导白细胞粘附内皮细胞。我们现在发现内皮细胞表达微小RNA 126（miR-126），其抑制VCAM-1的表达。用减少miR-126的寡核苷酸转染内皮细胞可增加TNF-α刺激的VCAM-1表达。相反，miR-126前体的过度表达增加了miR-126的水平，并降低了VCAM-1的表达。此外，降低内源性miR-126水平会增加白细胞对内皮细胞的粘附。这些数据表明，microRNA可以调节粘附分子的表达，并可能提供额外的血管炎症控制。
关键词：炎症、一氧化氮、白细胞、动脉粥样硬化
粘附分子在白细胞运输中起着关键作用。选择素及其糖蛋白配体介导白细胞沿着内皮细胞滚动，这是白细胞运输的第一步(1——4). 随后，细胞因子和趋化因子激活白细胞和内皮细胞表达细胞间粘附分子及其整合素配体，进而介导白细胞与内皮细胞的粘附(5,6). 然后白细胞通过内皮细胞屏障迁移，并通过组织迁移到损伤部位。
血管细胞粘附分子1（VCAM-1）是一种由内皮细胞表达的细胞间粘附分子(7). 内皮表面上的VCAM-1通过与其α4β1整合素配体、极晚期抗原4（VLA-4；CD49d/CD29）相互作用介导白细胞粘附，后者在大多数白细胞和受刺激的中性粒细胞上表达(8). 尽管静息状态下的内皮细胞不表达VCAM-1，但用多种细胞因子或细菌产物治疗可诱导内皮细胞在4-12小时内表达VCAM-1.VCAM-1的表达被认为主要在转录水平上受到调节(9——11). 精细的细胞研究表明，一组转录因子相互作用，并与VCAM-1基因的5′侧翼区域相互作用，以调节VCAM-1的表达(9). 这些转录因子包括NF-κB、IFN调节因子-1（IRF-1）、Sp1和支架因子，如高迁移率I组（Y）[HMG I（Y）](10,11). 尽管VCAM-1的表达可以在转录后水平上进行调节，但其发生的机制尚未完全确定(12,13).
我们假设内源性microRNA（miRNA）分子调节VCAM-1的表达和血管炎症。miRNA是一种小的非编码RNA，在转录后调节靶基因。这些内源性表达的miRNA分子在细胞核中转录为长初级转录物（pri-miRNA），核酶Drosha进一步将其加工成较短的前体物种（premiRNA），然后通过Ran-GTP-依赖性核输出因子exportin-5从细胞核输出(14——16). 一旦进入细胞质，前体RNA被细胞溶质酶Dicer加工成成熟的20-24-nt miRNA物种，与RNA诱导沉默复合物（RISC）形成复合物，并通过与3′-UTR中互补序列的结合抑制靶转录物的表达(17). miRNA通过两种不同的机制调节基因表达：如果miRNA精确匹配其靶序列，则mRNA被Ago2-RISC降解；然而，如果miRNA与其靶基因不匹配，则mRNA翻译被Ago1-RISC阻断(18). 因此，我们寻找可能调节粘附分子的内皮细胞表达的miRNA。
我们发现一种特殊的miRNA，即miRNA 126（miR-126），在内皮细胞中选择性表达。生物信息学分析表明，VCAM-1是miR-126的潜在靶点。我们现在发现内源性miR-126抑制VCAM-1的表达，从而减少白细胞与内皮细胞的相互作用。我们的数据表明，miRNA可以调节血管炎症。
结果
我们使用微阵列测量内皮细胞中miRNA的表达（参见材料和方法). 简言之，对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的总RNA进行大小分级，用荧光染料标记，并与微阵列芯片杂交(n个= 3). 在微阵列芯片上的500个miRNA探针中，鉴定出26个miRNA在HUVEC中表达最高(). 最常表达的miRNA是miR-126。
表1。
| MicroRNA名称 | 相对表达式 | 标准偏差 |
|---|
| miR-126型 | 1.3 | 0.1 |
| miR-23a型 | 0.8 | 0.1 |
| miR-23b | 0.8 | 0 |
| miR-22型 | 0.6 | 0.1 |
| miR-221型 | 0.6 | 0.2 |
| miR-16型 | 0.5 | 0.1 |
| miR-103型 | 0.5 | 0.1 |
| 第7页 | 0.4 | 0.1 |
| miR-21型 | 0.4 | 0.2 |
| miR-221型 | 0.4 | 0.1 |
| miR-107型 | 0.4 | 0.1 |
| miR-100型 | 0.4 | 0 |
| let-7a | 0.4 | 0.1 |
| miR-27a型 | 0.4 | 0 |
| miR-26a型 | 0.3 | 0 |
| miR-24型 | 0.3 | 0 |
| miR-20a型 | 0.3 | 0 |
| miR-17-5 | 0.3 | 0.1 |
| miR-181基因 | 0.2 | 0.1 |
| miR-106a型 | 0.2 | 0.1 |
| miR-29a型 | 0.2 | 0.1 |
| miR-130a型 | 0.2 | 0 |
为了探讨miR-126的生物学作用，我们首先定义了其在内皮细胞中的表达。我们从多种小鼠器官中获取RNA，并通过Northern分析对其进行miR-126表达分析。miR-126在小鼠肺和心脏组织中高表达，在大脑、肝脏和肾脏中也低表达(A类). 研究miR-126在原代人内皮细胞和其他细胞系中的表达，我们发现来自静脉、动脉、皮肤和大脑的内皮细胞都表达miR-126( B类和C类). 然而，其他细胞系如血管平滑肌细胞或白细胞系则不然。
内皮细胞表达miR-126。(A类) (上部)从各种小鼠组织中获取总RNA，并通过Northern印迹分析miR-126 RNA(下部)总RNA的溴化乙锭染色(B类) (上部)从不同类型的细胞中获取总RNA，并通过Northern blotting分析miR-126 RNA(下部)总RNA的溴化乙锭染色(C类)从不同类型的细胞中获取总RNA，并通过定量RT-PCR分析miR-126 RNA(D类)用AS寡核苷酸或premiR-126寡核苷酸转染HUVEC，然后培养3天。将1 ng/ml的TNF-α添加16 h。收集总RNA并通过Northern印迹分析miR-126 RNA水平(上部)溴化乙锭染色(下部).
接下来，我们试图改变内皮细胞内源性miR-126的水平。为了降低内皮细胞miR-126，我们用反义miR-126-寡核苷酸（AS-miR-126）转染HUVEC，并通过Northern印迹法测定miR-126。AS-miR-126降低内源性miR-126 RNA(D左). 为了增加内皮细胞的miR-126，我们将RNA前体转染到HUVEC中的miR-26（premR-126）。PremR-126显著增加miR-126 RNA(D右侧).
计算机分析表明miR-126可能是VCAM-1表达的负调控因子（参见材料和方法). 为了确定miR-126调控的潜在mRNA转录物，我们搜索了计算机数据库（人类miRNA靶点、计算生物学中心、纪念斯隆-凯特琳癌症中心）。生物信息学分析表明，VCAM-1是miR-126的潜在靶点。miR-126与人类VCAM-1转录物3′-UTR内的一个区域序列相似，延伸至604至625(A类). 特别是，miR-126的前6 nt可以形成与VCAM-1 mRNA转录物的相同义序列互补的碱基对，在VCAM-1 3′-UTR内从619延伸到625。此外，另外10 nt的miR-126可以在VCAM-1转录本的604和617内进行基本配对。
miR-126通过靶向miR-126-结合位点抑制基因表达。(A类)miR-126与VCAM-1 3′-UTR中的一个区域部分互补。(上部)VCAM-1 mRNA和miR-126的示意图。(下部)VCAM-1 3′-UTR中miR-126的序列及其潜在匹配位点。(B类)互补miR-126结合位点被插入pMIR-Report质粒上荧光素酶报告子的下游，并转染到HEK293细胞中，其中含有不同浓度的前体R-126(n个=3±SD；*，P（P）<0.01（0 nM vs.20 nM预混R-126）。(C类)将VCAM-1 3′-UTR中发现的部分互补miR-126结合位点（或突变结合位点）插入pMIR-Report质粒上荧光素酶报告子的下游，并转染到HEK293细胞中不同浓度的前体R-126(n个=3±SD；*，P（P）<0.001（0 nM vs.30 nM预混R-126）。
为了探讨miR-126对mRNA表达的影响，我们首先构建了一个包含共有miR-126-结合位点的报告载体：我们合成了一个编码荧光素酶cDNA的质粒，其中包含3′-UTR内miR-126的反义序列，将该报告质粒转染到HEK293细胞中，无论是否含有前体R-126，并测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。转染该构建物的HEK293细胞表达荧光素酶(B类). 前体R-126转染HEK293细胞降低荧光素酶表达(B类). 这些数据表明，miR-126可以调节包含确切miR-126-结合位点的转录物的表达。
为了探索miR-126调节VCAM-1 mRNA翻译的能力，我们创建了额外的报告载体。这些质粒包含VCAM-1 3′-UTR中发现的内源性21-nt-miR-126-结合位点或相应的带有乱序种子序列的21-nt序列。[VCAM-1 3′-UTR中的miR-126-结合位点仅是miR-126的部分补充，并不完全匹配(A类).] 转染这些结构的HEK293细胞表达荧光素酶(C类). 将premiR-126转染到HEK293细胞会降低野生型的表达，但不会降低突变结构的表达(C类). 综上所述，这些数据表明miR-126通过VCAM-1 3′-UTR中的miR-126-结合位点调节VCAM-1的表达。
接下来，我们试图确定miR-126对VCAM-1表达的影响。为了降低miR-126水平，我们用AS-miR-126寡核苷酸转染HUVEC 3天，然后用TNF-α刺激转染细胞16小时，然后用免疫印迹法测定VCAM-1的表达。TNF-α如预期诱导VCAM-1表达(A类). 转染AS-miR-126寡核苷酸导致VCAM-1表达的剂量依赖性增加，而不影响其他粘附分子，如细胞间粘附分子1（ICAM-1）[B类和支持信息（SI）图5]. 相反，miR-126前体的过度表达导致VCAM-1表达减少(C类). 免疫印迹定量显示，AS-miR-126使VCAM-1表达增加约20%，而premiR-126则使其减少约20%(D类). 此外，premiR-126使细胞表面VCAM-1表达降低约10%(E类).
miR-126抑制VCAM-1表达。(A类)TNF-α诱导HUVEC中VCAM-1的表达。用增加剂量的TNF-α刺激HUVEC 16小时，用VCAM-1抗体免疫印迹细胞裂解物。(B类)内源性miR-126降低VCAM-1蛋白水平，击倒miR-126。用对照寡核苷酸（AS-control）或miR-126反义寡核苷酸（AS-miR-126）转染HUVEC，敲低内源性miR-126.然后培养3天。采集总蛋白并通过VCAM-1免疫印迹分析。(C类)内源性miR-126降低VCAM-1蛋白水平，增加miR-126。用前体R-126寡核苷酸转染HUVEC以增加miR-126，然后培养3天。将1 ng/ml的TNF-α添加16 h。采集总蛋白并通过免疫印迹法分析VCAM-1。(D类)用30 nM AS-miR-126、premiR-126或对照寡核苷酸转染HUVEC，并用TNF-α刺激，免疫印迹如上所述进行。对信号强度进行量化，并与对照转染的细胞进行比较(n个=6±标准差；*，P（P）与对照组相比<0.03）。(E类)用对照寡核苷酸或premiR-126处理HUVEC，并用上述TNF-α刺激，用FACS测定VCAM-1的表达(n个=4±SD；*，P（P）< 0.01). (F类)miR-126不影响稳态VCAM-1 mRNA水平。用premiR-126转染HUVEC，用TNF-α处理3h，通过Northern blotting分析VCAM-1的总RNA。(G公司)miR-126不影响VCAM-1 mRNA的稳定性。用预处理R-126转染HUVEC，用TNF-α处理3h，然后暴露于放线菌素D。放线菌素D后不同时间分离RNA，并通过定量RT-PCR分析VCAM-1和GAPDH mRNA水平。
我们预测miR-126在翻译水平上调节VCAM-1的表达，因为VCAM-1在其3′-UTR中不包含与miR-126的精确匹配。为了证实这一预测，我们用前体R-126转染HUVEC 2天，然后用TNF-α刺激细胞3小时，并用Northern blot测定mRNA表达。前体miR-126不影响VCAM-1 mRNA的表达(F类). 此外，放线菌素D的实验表明，miR-126不影响VCAM-1 mRNA的半衰期(G公司和SI图6). 综上所述，这些数据表明内源性miR-126抑制VCAM-1蛋白表达，但不抑制内皮细胞中的mRNA水平。
为了探讨miR-126的功能相关性，我们测量了miR-126s对白细胞与内皮细胞粘附的影响。我们用前体R-126转染HUVEC，用TNF-α处理细胞，添加HRP-或2′，7′-双羧基乙基-5（6）羧基荧光素，乙酰氧基甲酯（BCECF-AM）标记的HL-60白细胞，清洗混合物，并测量白细胞与内皮细胞的结合。TNF-α增加白细胞与内皮细胞的粘附(). 前体R-126的过度表达降低了白细胞结合( A–C). 因此，miR-126的外源性表达降低了白细胞粘附。
miR-126抑制白细胞粘附体外. (A类)用前体R-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。将BCECF-AM标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C下培养45分钟，然后清洗。用荧光照相机拍摄粘附细胞。(B类)用前体R-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。将HRP标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C下培养45分钟，然后清洗。对粘附细胞进行裂解，并用分光光度计在A类450，然后校准为标准曲线(n个=2±SD；P（P）=0.1（0 nM vs.30 nM预混R-126）。(C类)用前体R-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。用VCAM-1抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(D类)用AS-miR-126或AS-对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。将HRP标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C培养45分钟，然后清洗。裂解粘附细胞，并通过分光光度计在A类450并校准为标准曲线(n个=3±SD；*，P（P）=0.02（0 vs.30 nM AS-miR-126）。(E类)用AS-miR-126或对照寡核苷酸转染HUVEC 2天，然后用TNF-α或对照处理6小时。用VCAM-1抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(F类)用TNF-α或对照组处理HUVEC 6 h。在37°C下，用VCAM-1、ICAM-1抗体或对照IgG孵育30 min。然后将HRP标记的白细胞添加到HUVEC中，在37°C下培养45分钟，然后清洗。将粘附细胞溶解，并用分光光度计在A类450并校准为标准曲线(n个=3±标准差；*，P（P）<0.02）。
我们接下来测试内源性miR-126是否调节白细胞对内皮细胞的粘附。我们用反义寡核苷酸将HUVEC转染到miR-126，然后如上所述测量白细胞对TNF-α刺激细胞的粘附性。增加miR-126反义增加白细胞粘附( A类,D类、和E类). 通过使用阻断VCAM-1的抗体，我们确认了该试验中的白细胞结合依赖于VCAM-1(F类). 总之，这些数据表明内源性miR-126通过调控VCAM-1抑制白细胞粘附。
讨论
总结。
我们研究的主要发现是miR-126抑制VCAM-1的表达并限制白细胞与内皮细胞的粘附。我们的数据表明，miRNA可以调节粘附分子的表达并调节血管炎症。
VCAM-1的miRNA调控。
我们发现了一种控制粘附分子表达的途径。静止的内皮细胞不转录VCAM-1的mRNA，但促炎细胞因子如TNF-α激活转录因子NF-κB和IRF-1，从而诱导VCAM-1转录(9). VCAM-1的表达也可以被控制其mRNA稳定性的未知因素调节(12,13). 我们的研究确定了调控VCAM-1表达的机制：miRNA可以抑制VCAM-1的表达。因为静息状态下的内皮细胞表达miR-126，所以miR-126的正常功能可能是抑制静息状态细胞的炎症反应。
我们发现miR-126结合位点介导了miR-126-对VCAM-1表达的抑制。当miR-126结合位点与荧光素酶3′-UTR融合时，外源miR-126-抑制荧光素素酶的表达(B类). 此外，抑制幅度相对较大，因为它是miR-126和miR-126-结合位点序列精确匹配的结果。当外源miR-126的序列与VCAM-1 3′-UTR的miR-126-结合位点融合时，也抑制荧光素酶的表达。然而，由于这种内源性miR-126结合位点仅与miR-26部分互补，因此抑制程度相对较小(C类). 研究表明，miRNA通过两种不同的途径调节基因表达，从而解释了miR-126抑制程度的差异(18). miRNA与其靶点之间的精确匹配与RISC-Ago2形成复合物，从而降解mRNA。不精确匹配导致RISC-Ago1复合物，抑制mRNA翻译。
miR-126表达的调控。
miR-126的表达调控尚不清楚。特别是，控制miR-126表达的5′侧翼区域尚未确定。miR-126的5′侧翼区域可能含有反应元件，将其表达限制在包括内皮细胞在内的细胞亚群中。虽然我们的数据表明miR-126调节炎症途径，但我们的研究表明，TNF对miR-26的表达没有影响（数据未显示），这意味着miR-1265′侧翼区域不包含炎症转录因子的反应元件。
内皮细胞miRNA。
最近的研究已经确定了内皮细胞中表达的特异性miRNA。塞萨等。(19)使用微阵列鉴定HUVEC中miRNA的表达。在我们发现的内皮细胞中高表达的25个miRNA中，有10个由Sessa鉴定等。(19). 我们和Sessa鉴定的miRNA等。(19)包括miR-222、miR-221、miR-23a、miR-181a、miR107、miR-31、miR-103-1,2、miR320、miR-106和miR-22。另一项研究确定了12个miRNA在HUVEC中高度表达，我们也发现其中包括miR-126(20). 因此，这三项研究建立了一套在内皮细胞中表达的miRNA。
许多内皮细胞miRNA在其他细胞类型中单独表达。然而，这组miRNA可能是内皮细胞特有的组合。最近的一份miRNA图谱显示了多种细胞和组织的miRNA表达谱(21). 在这项研究中，大多数miRNA在各种组织中表达。但三分之一的miRNA在特定组织中以更高的特异性表达。miR-126对心血管组织具有高度特异性。我们的数据证实了这些研究：我们发现miR-126在心脏和肺部高度表达(). 此外，miRNA图谱显示miR-126在其他地方表达水平较低，包括造血组织、内分泌组织和生殖组织(21). 先前关于miR-126在各种组织中的报道可能仅仅反映了这些器官的血管。我们发现miR-126在内皮细胞中表达，但在血管平滑肌细胞和淋巴细胞中不表达().
miRNA在内皮生物学中的作用尚不清楚，内皮细胞内miRNA的许多单独靶点尚未确定。塞萨等。(19)通过敲低Dicer阻断全球miRNA，发现miRNA对内皮细胞增殖和脐带形成是必要的。此外，miR-221/222调节内皮细胞NOS表达和c-Kit表达。我们的数据通过识别调节VCAM-1表达的miRNA扩展了这些研究。我们还表明，miRNA可以针对内皮生物学的不同方面：miRNA可以调节血管炎症途径。未来的研究可能会确定内皮miRNA在内皮细胞内调节的一系列靶点和途径。
材料和方法
试剂。
HUVEC、内皮细胞基础培养基（EBM-2）和生长因子购自Lonza。RNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies或Ambion。来自Integrated DNA Technologies的反义miR-126（简称miR-126AS）序列如下：GCAUUAUUACUCACGUACGA。所有碱基均用2′-OMe修饰。用siPort NeoFX试剂或胺试剂（Ambion）转染HUVEC。VCAM-1单克隆抗体、ICAM-1单抗和对照IgG购自Santa Cruz Biotechnology。荧光素酶报告质粒购自Ambion。微阵列购自Combimatrix。定量RT-PCR试剂购自Applied Biosystems。
内皮miRNA分析。
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从HUVEC中获取总RNA。使用Microcon YM-100（Amicon）通过尺寸排除柱色谱分离≈20–30 nt的小RNA物种。Mirus使用Label IT miRNA标记试剂盒用Cy3荧光标记小RNA物种，并根据制造商的说明，由Combimatrix将其杂交到人类miRNA 4×2K微阵列。表达数据被归一化为最高表达miRNA的水平(n个= 3). 使用Axon GenePixTM 4200AL扫描仪和成像软件对数据进行可视化。我们使用计算机搜索miR-126的潜在信使核糖核酸靶点。(http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl计算生物学中心、纪念斯隆-凯特琳癌症中心）。
Northern Blot分析。
上述采集的总RNA在15%的TBE（90 mM Tris/64.6 mM硼酸/2.5 mM EDTA，pH 8.3）-尿素凝胶（Invitrogen）上运行，并转移到Nytran尼龙转移膜（Schleicher和Schuell）。A类32P探针由miRNA-126反义寡核苷酸合成（集成DNA技术），并根据制造商的说明使用UltraHyb试剂（Ambion）进行杂交。
miRNA实时PCR。
使用RNA Later（Ambion）从各种小鼠组织中获取总RNA。使用TRIzol试剂（Invitrogen）从组织中分离RNA。根据制造商的方案（Applied Biosystems），通过TaqMan miRNA测定分析miR-126的表达。
细胞培养和miRNA转染。
HUVEC取自Cambrex，并在添加了必要生长因子的EBM-2培养基中生长。通过使用1–3μl siPort NeoFx（Ambion）试剂，将0–40 nM的前体miR-126寡核苷酸（Ambio）或2′-OMe修饰的反义miR-126-寡核苷酸（Integrated DNA Technologies）转染到HUVEC中3天。
西方印迹法。
如前所述进行蛋白质印迹(22). 简而言之，HUVEC用Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）进行裂解、超声、煮沸、在7.5%Tris·HCl凝胶（Bio-Rad）上分馏，并转移到硝化纤维素膜上，该膜与VCAM-1、ICAM-1或GAPDH抗体杂交（圣克鲁斯生物技术）。
荧光素酶报告结构的生成。
将miR-126共有应答元件GCATTATATCACGGTACGA、VCAM-1野生型3′-UTR应答元件GTATAGTGCATGGTACG和VCAM-1突变型3′-UTR应答元件GTATAGTACTGCAGGCGGCGATG插入荧光素酶cDNA下游miRNA表达载体pMIR-REPORT的多克隆位点。根据制造商的说明，通过使用胺试剂（Ambion）或脂质内酰胺2000试剂（Invitrogen）将每个载体以及不同剂量的前体miR-126寡核苷酸（Ambio）转染到HEK293细胞中。细胞培养2天，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行分析。
VCAM-1实时PCR。
如上所述培养和转染HUVEC 2天，并用1 ng/ml TNF-α刺激3 h。然后用5μg/ml放线菌素D（Sigma）处理HUVEC 0、2、4、8和24 h。使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中分离RNA。根据制造商的说明（Applied Biosystems），通过TaqMan基因表达测定分析VCAM-1和GAPDH mRNA的表达。
HL-60细胞与HUVEC结合。
人类早幼粒细胞株HL-60是从美国类型培养物收集中获得的。用不同剂量的前体R-126或反义miR-126寡核苷酸转染HUVEC 2天。用TNF-α处理转染的HUVEC 6–8 h。用HRP标记HL-60细胞，并与转染的HUVEC孵育45 min。用无血清培养基多次清洗培养孔，并用1%Triton溶液溶解。添加3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物，在A类450为了定量粘附HL-60细胞的精确数量，使用已知数量的HRP标记HL-60电池构建标准曲线。
统计分析。
数据表示为平均值±SD。用t吨用方差分析测试多组之间的差异。值为P（P）<0.05被认为是显著的。
致谢。
我们感谢克雷格·弗莱彻博士（约翰·霍普金斯大学医学院）对白细胞粘附试验的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院R01 HL63706-04、R01 HL074061、P01 HL65608和P01 HL56091的支持；美国心脏协会拨款EIG 0140210N；Ciccarone中心；约翰和科拉·H·戴维斯基金会；克拉伦斯·P·杜德曼教授（C.J.L.）；国立卫生研究院拨款R01 CA120185和丽塔·艾伦基金会（J.T.M.）；以及细胞和分子医学项目的培训拨款（发给T.a.H.）。
工具书类
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