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《实验医学杂志》。2005年12月19日；202(12): 1691–1701.
数字对象标识：10.1084/jem.20050915
PMCID公司：项目经理2212968
PMID：16365148

多柔比星诱导肿瘤细胞死亡的半胱氨酸蛋白酶依赖性免疫原性

诺埃利亚·卡萨雷斯,1 玛丽·奥·佩基尼奥特,1 安托万·泰斯尼尔,1 弗朗索瓦·吉林赫利,2 圣芬罗,2 纳撒利·查普特,2 伊丽莎·施密特,三 艾哈迈德·哈马,1 桑德拉·赫瓦斯·斯图布斯,4 米歇尔·奥贝德,1 Frédéric Coutant餐厅,1 迪迪埃·梅蒂维尔,1 伊芙琳·皮查德,5 皮埃尔·奥古里尔,6 杰拉德·皮尔龙,5 卡门·加里多,三 劳伦斯·齐特沃格尔,2和吉多·克罗默1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

全身抗癌化疗具有免疫抑制作用，主要导致非免疫原性肿瘤细胞死亡。这里，我们表明，即使在没有任何佐剂的情况下，因蒽环类药物而死亡的肿瘤细胞也能引发有效的抗肿瘤免疫反应，抑制接种肿瘤的生长或导致既定肿瘤的消退。虽然antracyclins和丝裂霉素C都通过caspase激活诱导细胞凋亡，但只有蒽环素诱导的免疫原性细胞死亡是免疫原性的。通过Z-VAD-fmk抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或转染杆状病毒抑制剂p35不能抑制阿霉素（DX）诱导的细胞死亡，但抑制了几种啮齿动物肿瘤模型中死亡肿瘤细胞的免疫原性。树突状细胞（DC）或CD8耗竭+T细胞在体内消除了对DX处理的凋亡肿瘤细胞的免疫反应。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制抑制DX杀伤细胞被DC吞噬的能力，但对其诱导DC成熟的能力没有影响。体外DX治疗后，新切除的肿瘤变得具有免疫原性，肿瘤内接种DX可在免疫活性小鼠中触发已建立肿瘤的消退。这些结果描述了一种生成癌症疫苗和刺激体内抗肿瘤免疫反应的程序。

非手术癌症治疗的彻底和永久成功取决于靶向所有肿瘤细胞，包括癌症干细胞，或者理论上取决于直接切除一部分肿瘤，并伴有“旁观者效应”，即免疫系统识别、攻击和根除剩余的肿瘤细胞，包括癌症干细胞。然而，不幸的是，大多数广泛使用的细胞毒性抗癌药物都会产生免疫抑制副作用。更糟糕的是，化疗诱导的主要细胞死亡类型是凋亡，凋亡通常被认为是免疫沉默的（导致免疫系统忽视），甚至是耐受性的（积极下调特定的抗肿瘤免疫反应；参考文献1和2). 因此，即使在最初的治疗成功后，患者通常也无法产生临床相关的抗肿瘤免疫反应，并最终死于逃避化疗的肿瘤细胞变异。

尽管细胞凋亡本身在负责细胞死亡的程序性信号事件方面是不均匀的(三,4)在形态学上，它被定义为一种均匀的细胞死亡，伴随着染色质浓缩（固缩）和核碎裂（核流变）发生在完整的质膜内(5,6). 因此，它不同于在死亡过程中早期破坏质膜的坏死。在生物化学术语中，凋亡经常伴随着半胱氨酸激酶的一个特定亚群，即半胱氨酸蛋白酶的激活(4). 由于细胞凋亡是一个生理过程，每秒在人体内产生数百万个细胞，因此推测这种类型的细胞死亡发生时不会发出“危险信号”，从而引发生产性免疫反应(7). 凋亡细胞会躲避免疫识别，因为它们会被快速识别并以有效的方式默默吞噬。因此，凋亡细胞的识别/吞噬缺陷破坏了自身耐受并触发了自身免疫反应(8–10). 此外，凋亡细胞通过抑制免疫刺激性细胞因子（例如巨噬细胞产生白细胞介素1β，树突状细胞产生白细胞介素12；参考文献11和12)，通过刺激免疫抑制因子的产生（例如转化生长因子；参考13)和/或通过诱导抗原特异性免疫耐受(14–16). 然而，与这个概念形成明显对比的是，树突状细胞可以在体外捕获凋亡的肿瘤细胞，并在MHC I类分子上捕获来自内部死亡细胞的交叉呈现抗原，以供CD8识别+体内T细胞，从而引发生产性免疫反应(2,17–22)，包括临床试验(23). 凋亡肿瘤细胞与坏死肿瘤细胞免疫原性的系统比较尚不明确(24–27)然而，这表明肿瘤细胞的性质和/或死亡诱导刺激会影响实验结果(1).

由于这些不确定性和未知性，我们决定探索通过化疗诱导免疫原性肿瘤细胞凋亡的可能性。在这里，我们证明蒽环类药物能够在体外、体外和体内诱导免疫原性细胞死亡。这些数据可能对具有免疫原性的化疗方案的设计具有深远的影响。

结果

凋亡癌细胞接种小鼠模型

根据FACS分析结果，用阿霉素（DX）或丝裂霉素C（MC）处理结肠癌CT26细胞株可杀死该细胞株(图1A） 尽管细胞死亡的表型表现不同。DX和MC均诱导caspase激活(图1B） 和染色质凝聚(图1、C和D)，但只有MC导致末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）-可检测的DNA片段(图1C） ●●●●。当与DX联合使用时，广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-fmk（DXZ）延缓细胞死亡(图1A） ，减少caspase激活(图1B） 染色质凝集减弱(图1D） 。然而，与未经处理的对照组相比，DXZ处理的细胞表现出强烈的克隆形成存活率降低，表明大多数细胞在体外经历了延迟的半胱天冬酶非依赖性死亡(图1E） 与之前的报道一致，DX在caspase抑制剂存在的情况下可以杀死细胞(28,29). 此外，与未经治疗的对照组相比，DX-和DXZ处理的细胞接种到无胸腺细胞后产生肿瘤的时间明显延迟数值/数值老鼠(图2A） ●●●●。将DX-、DXZ-或MC处理的细胞接种到同基因、免疫活性的BALB/c小鼠中，未发现肿瘤生长(图2B） ●●●●。为了探索死亡或垂死细胞的假定免疫原性，将BALB/c小鼠用活的CT26细胞接种到一侧，同时将DX-、DXZ-或MC处理或坏死（冻融[F/T]）细胞注射到另一侧。在这个治疗方案中，只有DX治疗的细胞，而不是DXZ-、MC-或F/T-治疗的细胞在第30天将活细胞肿瘤发生的频率降低了约45%，在第120天降低了约30%(图2C） ●●●●。这种保护程度是在不添加任何佐剂的情况下获得的。它也与培养基中存在的外源性抗原（FCS）无关（未描述）。用DX处理的CT26细胞攻击后未发生肿瘤的动物（15个中的5个）受到保护，不受第二次接种活CT26细胞的影响，但对不相关的鼠乳腺癌TS/a（TSA）肿瘤不能免疫(图2D） 。类似地，用DXZ或MC处理的CT26细胞激发后未发生肿瘤的动物的孤立病例（分别为28个和16个CT26细胞中的2个）在用活性CT26细胞重新激发后（未描述）未发生肿瘤，这表明这些治疗（DXZ和MC）可以获得长期抗肿瘤免疫，尽管与DX治疗的肿瘤细胞相比，其疗效要低得多。接种DX处理过的细胞保护的动物脾脏T细胞，当注射到原始受体时，可以转移有效的抗肿瘤免疫(图2E） ●●●●。值得注意的是，在用活肿瘤细胞攻击之前，通过预防性注射DX处理的细胞，肿瘤疫苗接种的效果可以提高到80%。无论免疫时间表如何，DX处理的细胞确实比DXZ、MC或F/T处理的电池提供了更高程度的保护(图2F） ●●●●。此外，在将活肿瘤细胞注射到另一侧前1周预防性接种死亡细胞的实验环境中，DX处理的细胞比γ射线照射后死亡的CT26细胞更具免疫原性（图S1，可在http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20050915/DC1). DX以外的其他蒽环类药物，如柔红霉素和伊达柔比星，也会诱导免疫原性细胞死亡(图2G） ●●●●。因此，死亡的肿瘤细胞可以引发有效的抗肿瘤免疫反应。我们想知道蒽环素的化学性质是否足以解释DX处理细胞的免疫原性。因此，用MC杀死CT26细胞，然后用DX处理15分钟，使DX在细胞中的结合水平与用DX培养24小时杀死的细胞相似(图3A） ●●●●。然而，与DX杀死的细胞相比，DX延迟治疗并没有改善MC杀死的肿瘤细胞的低免疫原性(图3B） ●●●●。因此，解释DX治疗肿瘤细胞免疫原性的是细胞杀伤模式，而不是DX本身的存在。

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CT26细胞中诱导的不同细胞死亡模式的体外表征。（A） 用材料和方法中规定的指示试剂对体外处理的细胞进行FACS分析。ZVAD、Z-VAD-fmk。数字表示细胞百分比（X±SD，n个=5）在每个象限。（B） 对按A处理的细胞进行免疫印迹分析。对细胞提取物进行活化caspase 3（Casp3a）、HMGB-1和HSP-70的免疫检测。（C） 用DAPI（蓝色）对细胞进行TUNEL染色（绿色）。TUNEL百分比+细胞（X±SEM，n个=3）已确定。（D） 透射电子显微镜。显示了具有代表性的显微照片。显示染色质凝集的凋亡细胞被标记为“A”（E）。按照A中所示的试剂处理过的细胞被清洗和电镀，以确定存活克隆的频率，将未处理细胞的控制值定义为100%。结果代表了三个独立的实验。

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不同细胞死亡类型的免疫原性。（A） DX-和DXZ处理的细胞在努/努老鼠。在中处理的单元格图1皮下注射（3×106/鼠标）。（B） 免疫活性BALB/c中DX-和DXZ处理的细胞的肿瘤演变。注意，MC-或F/T处理的小鼠也没有形成肿瘤。（C） DX处理的肿瘤细胞的免疫原性作用。将BALB/c小鼠一侧的活体肿瘤细胞注射到另一侧，另一侧注射DX-、DXZ-、MC-或F/T处理的细胞，并监测肿瘤的演变。（D） DX处理细胞诱导的持续、特异性抗肿瘤免疫。用120天后仍无肿瘤的DX处理的CT26细胞免疫的动物或年龄匹配的对照小鼠，用CT126细胞或无关的TSA肿瘤细胞系进行攻击。（E） DX处理细胞诱导的抗肿瘤免疫过继转移。BALB/c小鼠静脉注射107来自原始对照动物或用DX处理的CT26细胞免疫的动物的脾细胞保持无瘤状态（如B和D），然后皮下注射5×105肿瘤细胞。（F） 抗肿瘤疫苗接种时机的影响。CT26细胞按图1与活肿瘤细胞同时注射（与C中的同时注射）或在活肿瘤细胞激发前1周注射一次（预防性免疫；n个=每组15人）。（G） 用其他蒽环类药物替代DX。动物注射用柔红霉素（DA）或依达比星（ID）处理过的CT26细胞，而不是DX或仅PBS（CO），同时注射到对侧的活CT26细胞的生长如C所示。所有数字代表三到六个独立实验。*，与对照组（CO）相比，P<0.05。请注意，肿瘤的生长曲线只显示到伦理准则要求杀死动物的水平。

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DX对凋亡肿瘤细胞免疫原性的贡献。（A） DX并入CT26细胞。肿瘤细胞在没有或存在DX的情况下治疗24小时图1，并通过评估FACS中DX特异性红色荧光来测量DX并入细胞的情况（左）。或者，CT26细胞通过在MC中长时间培养而被杀死（如图1)然后在培养、清洗和DX掺入测定的最后15分钟内选择性添加DX（右）。（B） DX在体内的免疫效果。在预防性环境中皮下注射A（DX、MC或MC加DX）中处理的细胞（如图2F） 1周前，用另一侧的生命CT26细胞进行激发，然后监测肿瘤生长。

半胱氨酸蛋白酶依赖的DX诱导细胞死亡的免疫原性

如上所示，DX诱导免疫原性肿瘤细胞死亡。然而，与广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-fmk（DXZ）联合治疗可消除DX治疗的免疫原性潜力(图2、C和F). 当Z-VAD-fmk被具有窄谱作用的化学相关半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂（如Z-DEVD-fmk（针对半胱氨酸蛋白酶3））取代时，获得了类似的抑制效果，而分别针对半胱酶6和2的Z-VQID-CHO或Z-VDVAD-CHO（未描述）则没有此类效果。Z-VAD-fmk不能改善DX处理的CT26细胞的克隆形成存活率(图1E） 也没有减少发出红色荧光的DX在细胞中的掺入（图S2，可在http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20050915/DC1). 确认半胱天冬酶而非其他蛋白酶被Z-VAD-fmk抑制(30)标记高免疫原性（DX）和低免疫原性死亡（DXZ）之间的差异，我们用杆状病毒caspase抑制剂p35稳定地转染CT26细胞，p35是一种在体外和转基因模型中具有高度特异性、不可逆caspase抑制作用的蛋白(31,32). 与Z-VAD-fmk类似，p35延迟DX诱导的细胞死亡(图4A） ，但没有恢复DX处理的细胞的体外克隆原性(图4B） ●●●●。表达p35的肿瘤细胞在体外用DX治疗并接种到免疫活性小鼠后，未能形成肿瘤。然而，与仅转染载体的DX处理对照组相比，p35转染DX处理的CT26细胞未能诱导抗肿瘤免疫反应(图4、C和D). 免疫CT26野生型肿瘤的动物在接种表达p35的活性CT26细胞后也未能发生肿瘤，这表明p35不会干扰免疫系统的效应臂（未描述）。因此，两种不同的caspase抑制方案（Z-VAD-fmk的药理方案和p35的遗传和细胞自主方案）对DX处理的肿瘤细胞的免疫原性具有相似的效果。

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半胱氨酸蛋白酶抑制剂p35对免疫原性的抑制。（A） FACS分析仅转染载体（Neo）或p35的CT26细胞，单独培养或在DX存在下培养图1A.数字表示细胞的百分比（X±SD，n个=5）在每个象限。（B） Neo或p35转染细胞未经治疗（100%值）或接受DX治疗后的克隆形成存活率。（C和D）将新转染、DX处理或p35转染DX处理细胞同时注射到对侧的动物体内CT26肿瘤的演变。请注意，只有新表达的DX处理细胞具有肿瘤免疫性（P<0.01）。

树突状细胞在濒死肿瘤细胞诱导免疫反应中的关键作用

为了理解为什么DX诱导的细胞死亡具有免疫原性，我们用死亡或死亡细胞挑战DC，并测量其反应。DX处理的CT26细胞被所有CD11c吞噬+/IA公司d日+DC亚群（CD11b+B220型+DC输入图5A和CD8α+未描述DC）存在于脾脏中，而非免疫原性（活的、DXZ、MC或F/T）CT26细胞被DC忽略(图5，A和B). 相反，几种濒临死亡的肿瘤细胞（DX、DXZ和F/T，但不是MC）具有诱导DC成熟的能力，如共刺激分子CD80和CD86的表达增加以及MHCⅡ类的诱导(图5C） ●●●●。可溶性DX本身没有激活CD86(图5C） 或CD80（未描述）在骨髓衍生DC中的表达，当使用浓度导致部分DC凋亡时(图5D） 。此外，Z-VAD-fmk不抑制DX处理的CT26细胞的DC介导的吞噬作用(图5E） ●●●●。因此，MC、DX和DXZ处理的细胞对树突状细胞的差异作用不能归因于可溶性DX或Z-VAD-fmk的携带。体内接种后，经DX处理但未经DXZ处理的CT26细胞引发细胞毒性T细胞反应(图6A） ●●●●。DX合法的免疫原性效应需要一个完整的细胞免疫系统，因为数值/数值当小鼠受到DX处理的CT26细胞的攻击时，未能产生有效的抗肿瘤免疫反应(图6B） ●●●●。类似地，CD8的选择性耗竭+体内注射特异性单克隆抗体可消除DX处理细胞刺激的抗肿瘤免疫反应(图6C） ●●●●。因此，NK细胞对于DX处理的细胞诱导的抗肿瘤免疫反应是不可或缺的，而CD8+此响应需要个单元格。在其他肿瘤相关模型中获得了表明CTL重要性的额外数据。注射OVA转染的B16F10黑色素瘤细胞可诱导OVA特异性CD8的局部募集+T细胞，识别Kb/SIINFEKL四聚体进入同基因C57BL/6小鼠引流淋巴结（以及细胞产生IFN-γ），前提是注射的细胞用DX预处理(图7，A–C). 然而，当接种物经过DXZ或MC处理，或当DX处理的细胞通过冻融而坏死时，这种反应会减弱(图7，A–C). 确定CD11c的影响+针对体内免疫应答的树突状细胞，将白蚁毒素注射到转基因C57BL/6小鼠中，该转基因小鼠在树突状体内特异性表达白蚁毒素受体（在CD11c启动子的控制下；参考文献33）。载体注射对照动物募集CD8+对OVA-衍生的K具有TCR特异性的T细胞b/SIINFEKL表位进入引流淋巴结，但DC缺失的动物在注射凋亡的OVA转染的B16F10细胞后没有这样做(图7D） 。这些数据证实，DX处理的细胞在刺激细胞毒性免疫反应方面特别有效，并且这种反应是由DC介导的。

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死亡肿瘤细胞对树突状细胞的影响。（A和B）Flt3L注射小鼠脾脏DC对DX-、DXZ-或MC处理的细胞（用CMTMR染色）的体外吞噬作用。典型的FACS图如A所示，纯化DC亚群（绿色）吞噬的死亡肿瘤细胞（红色）的共焦图像如B所示。（C）LPS（阳性对照）和死亡或死亡的CT26细胞诱导脾DC的DC成熟。A和C中的百分比值是三个独立测定值±SD的平均值。（D）Z-VAD-fmk未能抑制DC对DX处理的CT26细胞的吞噬作用。在显示浓度的Z-VAD-fmk存在下，将D中生成的DC与两倍多的DX处理的CT26细胞孵育90分钟，并且含有死亡或死亡CT26细胞的DC的百分比如a中所示。（E）DX未能激活DC。以LPS作为阳性对照或以指定浓度的DX和凋亡细胞（膜联蛋白V）的频率激活骨髓来源的DC+)和CD86+细胞通过免疫荧光和细胞荧光分析进行检测。A和C–E中的百分比值是三次独立测定±SD的平均值。

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由死亡肿瘤细胞诱导的免疫效应物的特征。（A） 免疫小鼠中DX-和DXZ处理细胞的CTL反应。对只接种PBS（CO）、DX处理的CT26细胞或DXZ处理的CT26-细胞的动物脾脏T细胞进行测试，以检测其对免疫显性H2L脉冲的同基因细胞的裂解能力d日-限制性CT26衍生肽SPSYVYHQF。左侧显示了单个小鼠的典型CTL反应，右侧显示了平均值。R和NR分别指应答者和非应答者。*，与对照组（CO）相比，P<0.01。（B） 裸鼠未能对DX处理的CT26细胞产生免疫反应。野生型或努/努BALB/c小鼠接种DX处理的CT26细胞1周后，将活CT26细胞注射到对侧，监测无瘤生存率。（C） CD8的要求+而非NK细胞的抗肿瘤免疫反应。野生型BALB/c小鼠在用垂死（DX处理）和活（未处理）的CT26细胞攻击前3-4天，每隔1周腹膜内注射CD8或NK标记物asialo-GM1特异性的消耗抗体到相对的侧翼。

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特异性CTL和DC对DX处理的肿瘤细胞免疫反应的贡献。（A） CD8的百分比+表达TCR的淋巴结细胞与H-2K表达的OVA衍生肽SIINFEKL相互作用b用肽加佐剂（P+A）或DX、DX F/T（用DX和F/T处理的细胞）、DXZ-、MC-和F/T-处理的B16-OVA细胞激发后5天（三个实验）。（B） 特定CD8的绝对数+每个淋巴结的细胞数如A所示。值为X±SD(n个= 3). （C） 用SIINFEKL在同一实验中进行体外培养后测得的IFN-γ产生。对照值＜50 pg/ml。（D）DC耗竭对特异性T细胞积聚的影响。在树突状细胞中特异性表达白蚁毒素（DT）受体的转基因小鼠，单独用PBS或消耗树突状公司的白蚁毒素剂量进行预处理。然后用DX处理的B16-OVA细胞将小鼠激发到食物垫中。48小时后恢复引流淋巴结，并进行染色以同时检测CD8和OVA肽特异性T细胞受体。显示了具有代表性的FACS象形图，数值为X±SD(n个= 3).

DX合法凋亡在几种肿瘤模型中具有免疫原性

一次性皮下注射DX处理的CT26细胞可有效防止同时静脉注射肿瘤细胞引起的肺转移(图8A） ●●●●。在这个系统中，MC处理的细胞和F/T细胞效率低下。冻融DX处理的CT26细胞（DX F/T）可消除其免疫原性效应，与Z-VAD-fmk共培养可部分降低DX效应(图8A） ●●●●。在静脉注射未经DX处理的CT26细胞之前，注射两次DX处理CT26细胞，则抗转移效果完全(图8B） ●●●●。在下一轮实验中，我们确定了观察到的肿瘤疫苗接种效果是否是一种普遍现象。当用B16F10细胞替换CT26细胞时，我们发现如果DX治疗并注射到C57BL/6小鼠（未描述）中，该黑色素瘤细胞系具有免疫原性。B16F10A2/gp100黑色素瘤细胞在HLA I A2类背景下呈现来自人类gp100肿瘤抗原的肽(34). 同样，在表达HLA的“人源化”小鼠中，用DX进行体外治疗，然后皮下注射细胞，能够对随后的B16F10A2/gp100活肿瘤细胞攻击产生显著的保护作用。A2转基因(图8C类；参考文献34和35). 作为一项副作用观察，这种人源化小鼠在很大程度上缺乏NKT细胞（NK1.1+TCRα/β+CD4细胞+; 图S3，网址为http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20050915/DC1)表明DX处理的肿瘤细胞诱导的抗肿瘤免疫反应不需要NKT细胞。因此，DX处理的死亡肿瘤细胞在人类MHC背景下具有免疫原性。此外，近交系BDIX大鼠接种了同基因PROb结肠癌(36)可以通过注射DX处理的肿瘤细胞来保护，并且通过同时用DX和Z-VAD-fmk预处理肿瘤细胞，这种作用再次受到抑制(图8D） 。总之，该癌症免疫方案适用于一系列不同的肿瘤、物种和MHC背景。

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在不同的啮齿动物模型中接种DX处理的黑色素瘤或结肠癌细胞的抗肿瘤疫苗。（A） 将活CT26细胞静脉注射到动物体内后观察到的无转移小鼠的百分比，这些动物同时注射了仅含载体（CO）的细胞或产生的死亡肿瘤细胞，如图1未经治疗的对照组发生46±22个转移（X±SD，n个= 46). （B） 静脉注射活CT26细胞前14天和7天用DX处理的CT26细胞进行两次免疫的效果。A和B中的数据来自三个独立实验。*，与对照组（CO）相比，P<0.001。（C） 将DX处理的B16A2细胞两次注射到HLA转基因小鼠体内。A2用活B16A2细胞挑战对侧腹前1周和2周。*，与对照组（CO）相比，P<0.05。（D） 同时皮下注射死亡（DX-或DXZ治疗）肿瘤细胞的方案适用于受到PROb细胞攻击的BDIX大鼠。*，与对照组（CO）相比，P<0.001。这个实验已经重复了三次，得到了类似的结果。

免疫原性细胞凋亡的体内外诱导

我们研究了是否需要用培养为已建立细胞系的死亡细胞免疫动物，或者利用切除的肿瘤是否可行（人类癌症患者就是这样）。在BALB/c小鼠中生成CT26肿瘤，然后在含有DMSO的培养基中冷冻一步后，选择性地进行手术切除和酶解，在体外用DX治疗，并用作抗肿瘤疫苗(图9A） ●●●●。如果在体外培养过程中添加DX，这种体外去除/体外治疗会引发有效的抗肿瘤免疫反应，尽管冷冻保存的细胞比新回收的肿瘤细胞效率低。DX的省略降低了疫苗的效力(图9A） ●●●●。作为该体外/体内疫苗生成方案的替代方案，我们将DX注射到可触及（>125 mm三)BALB/c小鼠皮下建立CT26肿瘤。使用这种瘤内化疗方案而不是静脉化疗（未描述），我们在40只动物中有16只（40%）实现了疾病稳定或肿瘤完全消退(图9B） ●●●●。我们无法解释为什么一些动物没有表现出治疗效果，其他动物表现出肿瘤生长延迟，而其他动物则完全治愈。对这种异质性的一种可能解释是肿瘤局部浸润的变化，而这种变化逃避了宏观检查。当DX与Z-VAD-fmk联合注射或DX被MC替代时，我们只观察到肿瘤生长延迟，没有稳定的疾病或肿瘤退化(n个= 15;图9B） ●●●●。对DX处理的CT26细胞表现出完全治疗反应的动物的再次挑战未能产生肿瘤(图9C） 表明该治疗方案诱导了持续的抗肿瘤免疫。重要的是，DX注射到肿瘤中未能在数值/数值老鼠(图9D） 表明免疫系统参与了DX注射液对免疫活性小鼠的有益作用(图9B） ●●●●。当我们研究携带PROb癌的BDIX大鼠肿瘤内注射DX的效果时，我们再次发现DX注射的治疗效果仅在免疫功能正常的大鼠中观察到（而不是在运动动物中），并且其效果被Z-VAD-fmk的联合注射所消除(图9E） ●●●●。局部注射MC对免疫活性大鼠和无胸腺大鼠的PROb肿瘤生长也有类似的延迟作用(图9E） ●●●●。这些发现证实了DX导致免疫原性肿瘤细胞死亡，而MC导致体内非免疫原性（或免疫原性较低）细胞死亡的观点。

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体内外诱导免疫原性细胞死亡。（A） 接种新鲜切除或冷冻保存的CT26肿瘤细胞的小鼠肿瘤的演变，这些肿瘤未经治疗（CO）或接受DX治疗。（B） 瘤内化疗对免疫活性BALB/c小鼠接种CT26结肠癌细胞生长的影响。先前接种了活CT26细胞的BALB/c小鼠在接种肿瘤细胞后~14天，一旦可接触到DX、DXZ或MC，就接受肿瘤内注射（箭头），并监测肿瘤生长。虽然一些DX治疗的动物肿瘤生长正常(n个=12）或肿瘤生长的简单延迟(n个=12），其他动物表现出稳定的疾病(n个=7）或肿瘤完全消退(n个= 9). （C） 通过肿瘤内注射DX（如B）或年龄匹配的对照（CO）小鼠与活CT26细胞治愈的动物的再激发。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。（D） 肿瘤内注射DX未能在数值/数值携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠。除了动物免疫缺陷外，实验按B进行。（E） PROb大鼠结肠癌模型的瘤内注射。免疫功能或数值/数值携带PROb肿瘤的BDIX大鼠接受DX、DXZ或MC瘤内注射，并监测肿瘤生长。

讨论

细胞凋亡通常被认为是一种免疫沉默甚至耐受性死亡方式(8–16,37). 挑战这一观点的是，已有研究表明，吉西他滨诱导血凝素表达的AB1间皮瘤细胞凋亡可以激活体内CD8 T细胞，从而引发有效的抗肿瘤免疫反应(38). 同样，OVA转染的B16F10肿瘤的局部γ射线照射可以增加抗肿瘤免疫效应细胞的生成及其向肿瘤部位的转运(39). 目前的数据表明，一些但不是所有化疗诱导的凋亡方案都能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。尽管蒽环类药物（尤其是我们用作模型药物的DX）在体外诱导免疫原性细胞凋亡(图2–4和​和66–8)，体外(图9A） 和体内(图9，B–E)MC公司(图2,​,3,三,​,55C、 6A、7A、8A和9B）诱导免疫原性细胞死亡的效率相对较低。在MC-杀伤细胞中掺入DX不能替代DX从头开始的治疗(图3)强调了宿主细胞（而非蒽环素的化学性质）对免疫原性表型的贡献。含有相同比例死亡细胞的DX或MC处理细胞的制备(图1A） 注射后，DX和MC引起的细胞死亡的形态学方面相似(图1、C和D). 两者均伴有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活(图1B） 一些主要内源性佐剂如HSP70和HMGB-1的表达没有任何差异(图1B） 唯一的差异在于DNA的断裂程度，随着MC的增加，断裂程度更高(图1C） ●●●●。此外，DC吞噬MC处理的细胞的效率低于DX处理的细胞(图5A） ，从而强调了迄今为止未被怀疑的凋亡细胞在DC摄取方面的异质性(40). 重要的是，通过Z-VAD-fmk或转染p35抑制caspase激活大大降低了DX处理细胞的免疫原性，这一效应在多种不同的体内外肿瘤模型中都可以观察到(图2–9)也影响DC介导的识别和吞噬作用(图5A） ●●●●。然而，胱天蛋白酶激活不足以引发免疫原性细胞死亡，因为MC处理的细胞确实表现出胱天蛋白酶激活(图1B） ，是低效的抗肿瘤疫苗(图2). 因此，蒽环素处理细胞的特定因子组合、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活和尚待确定的抗原特性必须协同激发抗肿瘤免疫反应。冻融破坏DX处理的肿瘤细胞的膜完整性足以消除其免疫原性(图2F、 7、A-C和8A），这意味着完整的凋亡细胞或细胞体需要最佳抗原性。坏死细胞死亡的诱导通常通过几个循环（通常是三个或更多）的冻融来实现，而我们执行了一个单一的冻融循环，这一过程避免了细胞结构的严重液化。因此，与其他报告相比(41,42)，此处进行的冻融并没有导致DC对细胞的摄取(图5A） 也不参与免疫原性细胞死亡(图2C） ●●●●。不管这些机制细节如何，似乎凋亡诱导的特定方案决定了细胞死亡的免疫原性。显然，存在两种不同的凋亡亚类，一种是高度免疫原性，另一种是相对较少免疫原性。

DX处理的濒死肿瘤细胞被髓样和浆细胞样DC有效吞噬(图5，A和B)并能高效诱导抗原特异性CTL(图6A和7），这是抗肿瘤免疫反应所必需的(图6、B和C). 相反，NK细胞(图6C） 和NKT细胞（图S3）不是安装抗肿瘤免疫反应的严格要求，至少在这个实验环境中。因此，与其他实验系统相比，如病毒感染(43)，NK细胞对于DX处理的肿瘤细胞启动DC是不必要的。值得注意的是，肿瘤内注射DX可以引起化疗反应，其阳性结果需要完整的细胞免疫系统(图9、D和E). 同样，通过与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-fmk同时治疗，这些特性（树突状细胞吞噬DX处理的细胞，诱导抗原特异性CTL，以及通过瘤内注射DX诱发免疫反应）大大降低，与免疫原性降低相关。据我们所知，这是第一份表明caspase激活广泛需要用于诱导免疫原性肿瘤细胞死亡的报告。以前的报告已经描述了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活反而降低了肿瘤细胞的免疫原性潜力。因此，未能激活半胱天冬酶的PROb克隆（REGb）比亲本PROb系具有更强的免疫原性(44). 类似地，一个被操纵以稳定表达反义细胞色素的PROb克隆c（c）cDNA经历非典型凋亡，但没有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，但免疫原性增强(27). 另一个例子是，已有文献证明caspase可以破坏免疫显性表位，从而减弱对淋巴瘤细胞的免疫反应(45). 在易患自身免疫性糖尿病的NOD小鼠中，系统性caspase抑制减少了自发凋亡的β细胞对T细胞的启动作用(46)相反，局部caspase抑制可消除链脲佐菌素诱导的β细胞凋亡的耐受作用(37). 这里提供的数据直接说明了半胱氨酸蛋白酶激活的重要性，表明半胱氨酸酶激活可以改善濒临死亡的肿瘤细胞的抗原性。这指向了一个有趣的问题。caspase抑制剂的表达对某些肿瘤具有负的预后价值(47–49). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活失败可能不仅会以细胞自主的方式增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，而且会降低免疫原性死亡的概率，从而削弱宿主的抗肿瘤防御系统。

需要强调的是，蒽环素治疗的肿瘤细胞在没有任何佐剂或共刺激物的情况下观察到免疫原性作用。因此，佐剂的共同应用可能有望提高疫苗接种计划的有效性。作为一种令人着迷的可能性，我们的数据提出了一种在体内或体外诱导已建立肿瘤免疫原性细胞死亡的策略。这种简单的策略在治疗患者时是否有效，有待于未来解决。

材料和方法

细胞系和细胞死亡诱导。

CT26、PROb、B16F10、B16/F10.9-OVA和B16F10A2/gp100（转染gp100和HLA A2.1并在50μg/ml潮霉素和G418中筛选的B16F10-OVA细胞）细胞在37℃、5%CO下培养2在添加10%FCS、青霉素、链霉素、1 mM丙酮酸和10 mM Hepes的RPMI 1640培养基中加入DX 24小时（25μM用于CT26，30μM用于PROb，2.5μM用于B16F10及其衍生物），5μM柔红霉素24小时（GE Healthcare），1μM idarubicin 24小时（Aventis），30μM MC 48小时（Sanofi-Synthelabo），和/或100μM zVAD-fmk持续24小时（Bachem）。液氮中的一个冻融循环会导致坏死2和37°C水浴。仅用载体（Neo）或编码p35的pcDNA3.1载体稳定转染CT26细胞(31,32). 在一个实验中，将100μM DX添加到MC中培养2 d的细胞中15 min。通过评估配备氩激光的FACSVantage（Becton Dickinson）中的DX特异性红色荧光，测量DX在清洗（PBS中三次）细胞中的掺入。

细胞死亡分析。

用2.5μM DAPI（Invitrogen）染色10分钟后，对细胞进行胰蛋白酶化，并用FACSVantage进行细胞荧光分析，以测定细胞活力，并将膜联蛋白V与异硫氰酸荧光素（Bender Medsystems）偶联，以评估磷脂酰丝氨酸暴露(50,51). 使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）和配备相机（DC300F；Leica）的荧光显微镜（IRE2；Leica.）对细胞进行TUNEL分析（让其在聚赖氨酸涂层载玻片[O.Kindler GmbH]的PBS中粘附1小时，并用4%多聚甲醛固定30分钟）。对于电子显微镜，用乙酸铀和柠檬酸铅对细胞（在4°C下，在磷酸盐缓冲液中2.5%戊二醛中固定1 h，pH 7.4，清洗，然后在2%四氧化锇中再次固定，然后嵌入Epon中）和超薄切片（80 nm）进行染色，并在80 kV下用电子显微镜（902；Leo）进行检查。

免疫印迹分析。

在4°C下用冷PBS清洗细胞，并在含有50 mM Tris HCl、pH 6.8、10%甘油和2%十二烷基硫酸钠的缓冲液中溶解。用适当的辣根过氧化物酶标记的二级抗体（Southern Biotechnology Associates，Inc.）检测活化的caspase 3（稀释1/1000；细胞信号技术）、HSP70（稀释1/100；Stratagene）或2μg/ml HMGB-1（BD Biosciences）的一级抗体并通过增强化学发光（Pierce Chemical Co.）进行检测。使用抗actin或抗GAPDH（Chemicon）来控制等负荷。

抗肿瘤疫苗接种和体内肿瘤生长评估。

所有动物均保持在特定的无致病条件下，所有实验均遵循欧洲实验动物科学协会联合会指南。3 × 106将处理过的CT26细胞接种在200μl PBS中的皮下，接种到6周龄雌性BALB/c小鼠（Charles River Laboratories）的下腹部，而5×105未经处理的对照细胞接种到对侧腹(52). PROb细胞（3×106处理过的细胞和10个6对照细胞）皮下注射到同基因2月龄BDIX大鼠（Charles River Laboratories）和B16A2和B16F10（1.8×105处理细胞和3×104对照细胞）分别注射到6周龄雌性HHD2转基因小鼠（在Gustave Roussy研究所[IGR]动物设施饲养）和C57BL/6小鼠（Charles River Laboratories）。致瘤性试验，3×106将经处理或未经处理的CT26细胞皮下注射到数值/数值小鼠（IGR动物设施）。为了评估针对CT26的免疫反应的特异性，我们注射5×105或5×106CT26（分别用于标准方案或接种方案中免疫的小鼠）或106TSA细胞。每周使用卡尺评估对照侧的肿瘤。将肿瘤体积超过20%–25%的动物杀死。在一系列实验中，静脉注射来自原始或肿瘤保护BALB/c小鼠的脾细胞（即，分别将凋亡细胞和活CT26细胞皮下注射到左右两侧后，保持无瘤状态至少60天的小鼠）（107细胞）转化为6周龄雌性BALB/c小鼠，接受5×1051天后皮下接种CT26细胞。肺转移瘤是通过注射105CT26细胞同时注入尾静脉，皮下注射3×106处理过的细胞。20天后给小鼠注射印度墨水，杀死小鼠，并由三名独立研究人员以盲法用放大镜计数肺转移。对于原发性肿瘤的疫苗接种，皮下肿瘤用1.6 mg/ml胶原酶和350 U/ml脱氧核糖核酸酶在37°C下分离20分钟，用20μM DX治疗24小时，然后皮下注射3×106细胞。或者，将肿瘤冷冻（在含有10%二甲基亚砜的FCS中）为～1-mm三立方体在−80°C下解冻，解冻后以相同方式处理。在一系列实验中，BALB/c（野生型或数值/数值)携带可触及的CT26肿瘤或携带PROb肿瘤的大鼠（BDIX或裸鼠）（14天前通过注射106肿瘤细胞）接受单次瘤内注射MC（100μl的3-mM溶液）、DX（20μl的10-mM溶液，和/或Z-VAD.fmk（10μl的100-mM溶液）。CD8耗尽+或分别在死亡激发（DX处理）前4天，通过腹腔注射250μg抗CD8单克隆抗体（取自大鼠抗小鼠杂交瘤H35.17.2；美国型培养物收集）或抗asialo GM1单克隆抗体，获得NK细胞肿瘤细胞和注射活肿瘤细胞前3天（DX处理细胞后1周接种）。

评估特异性T细胞反应。

CTL对免疫显性CT26特异性AH1 H2L的反应d日-限制性肽（SPSYVYHQF；Neosystem；参考53)已确定。在注射凋亡细胞后10天，从免疫小鼠中分离脾细胞，并在有或没有5μg/ml AH1的情况下，在存在同基因辐照的原始脾细胞的情况下在体外重新刺激5天。细胞毒性活性在典型的体外5小时内测定51铬释放测定使用51负载50μM AH1肽的Cr-P815肿瘤细胞作为靶细胞(52). 比溶解率计算为100×（实验释放-自发释放）/（最大释放-自发释药）。通过向靶细胞中添加10%Triton X-405获得最大释放，并通过在单独培养基中培养靶细胞来测定自发释放。5-6周龄雌性C57BL/6小鼠（H-2b)将PBS和50μg OVA肽（H-2K）注射到两个脚垫中b-限制性，SIINFEKL，氨基酸257–264；Eurogentec）与不完全弗氏佐剂（Sigma-Aldrich）混合或106B16/F10.9-OVA细胞。脚垫免疫后5天处死动物，取出腘窝和腹股沟淋巴结并单独处理。通过无菌细胞过滤器（70μm；Becton Dickinson）均质和过滤器官，获得单细胞悬浮液。用于FACS分析，2×106细胞在室温下用四聚体OVA PE（Beckman Coulter）染色，然后用抗CD3-FITC和抗CD8-APC mAb（Becton Dickinson）染色。使用FACSCalibur细胞仪（Becton Dickinson）和CELLQuest Pro软件分析细胞。或者，105细胞在含有2%小鼠血清的完整培养基中培养，有或无40μg/ml SIINFEKL肽。3天后，收集上清液，并通过ELISA（OptEIA ELISA Kit；BD Biosciences）测定IFN-γ分泌。在一系列实验中，CD11c-GFP DT Kb老鼠(33)在将DX处理的B16/F10.9-OVA细胞注射到食物垫前48小时，腹腔内注射100 ng白喉毒素（或PBS作为载体对照）。

DC的启动和隔离。

小鼠每天腹腔注射10μg Flt3L（Immunex），连续10天。脾脏细胞与1μM CytoTracker Red–（CMTMR；Invitrogen）预培养的凋亡或坏死CT26细胞以1:1或5:1的比例共孵育2小时用于吞噬实验，或24小时用于成熟实验。然后用FITC-偶联抗体（Becton Dickinson）和APC结合的抗CD11c抗体，用FACS分析B220、CD11b、CD8α、MHC II类、CD40、CD80或CD86分子的特异性细胞。或者，CD11c+使用免疫磁珠（Miltenyi Biotec）纯化脾细胞，免疫磁珠与CMTMR标记的CT26细胞以1:1的比例共培养2小时。然后用B220、CD11b和CD8α（BD Biosciences）以及与Alexa Fluor 488（Invitrogen）偶联的山羊抗鼠抗体对细胞进行染色。使用配备63X物镜的显微镜（LSM 510；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）进行共聚焦显微镜检查。为了生成骨髓衍生DC，用添加10%热灭活FBS（Invitrogen）、2 mM的RPMI 1640培养基从C57BL/6小鼠的胫骨和股骨冲洗骨髓细胞我-谷氨酰胺、50μM 2-ME（Sigma-Aldrich）、10 mM Hepes缓冲液、pH 7.4（Invitrogen）和50μg/ml青霉素/链霉素（Invit罗gen）。在一次离心后，骨髓细胞在三氯化铵中重新悬浮2分钟，以溶解红细胞。再次离心后，骨髓细胞在106细胞/ml，培养基中添加100 ng/ml重组小鼠FLT3升（R&D系统），置于六孔板（Costar Corning）中。

统计分析。

数据以算术平均值±SD或百分比表示。所有统计分析均使用JMP软件（SAS Institute Inc.）进行。学生的t吨检验用于比较连续变量（肿瘤生长比较），卡方检验用于非参数变量（动物队列比较），对数秩检验用于Kaplan-Meier曲线。对于所有测试，统计显著性水平设置为0.05。

在线补充材料。

图S1显示了γ射线照射的凋亡CT26细胞在体内的免疫原性。在用活肿瘤细胞攻击之前，通过预防性注射γ射线照射的CT26细胞免疫小鼠。图S2是用PBS、单独DX（DX）或DX和z.VAD-fmk（DZ）处理24小时的CT26细胞的细胞荧光分析。图S3显示HHD2转基因小鼠中没有NKT细胞。从6周龄雌性C57BL/6和HHD2转基因小鼠中获得脾细胞，然后用CD4、NK1.1和TCRαβ抗体进行细胞荧光分析。图S1–S3位于http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20050915/DC1.

致谢

我们感谢Mathew Albert博士（法国巴黎巴斯德研究所）的有益讨论，感谢François Lemonnier博士（巴斯德研究院）提供转基因小鼠，感谢Abdelali Jalil博士（法国维勒朱伊夫古斯塔夫·罗西研究所）提供技术支持，感谢Guy Salvesen博士（加利福尼亚州拉霍亚伯纳姆研究所）为p35质粒提供技术支持。

G.Kroemer得到了国家癌症防治基金的特别资助，以及国家SIDA研究机构、欧洲共同体（活性p53，RIGHT）和Sidaction的资助。N.Casares和A.Tesniere拥有医学研究基金会的奖学金，M.O.Pequignot拥有Gustave Roussy研究所的奖学金。L Zitvogel得到了欧盟拨款Allosem和DC-THERA的支持。

作者没有相互冲突的经济利益。

笔记

使用的缩写：DX，阿霉素；DXZ、DX与Z-VAD-fmk相结合；F/T，冻融；MC，丝裂霉素C；TSA、小鼠乳腺癌TS/A；TUNEL，末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记。

N.Casares和M.O.Pequignot对这项工作做出了同等贡献。

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文章来自实验医学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社