透明质酸寡糖通过Toll样受体4激活树突状细胞

材料。

MAPK抑制剂SB203580、PD 98059、Wortmann、Herbimycin A和CAPE购自Alexis Corporation。LPS来自明尼苏达沙门氏菌Re-595，马流产沙门氏菌，或如前所述制备粗细胞壁提取物(22).

多粘菌素B，一种取代钙的阳离子抗生素²⁺从钙生物化学中获得的阴离子磷脂。单克隆抗人TLR-4抗体用于FACS^®上述浓度的分析和封闭研究(23).

HA片段的制备。

用于临床应用的HMW-HA（HEALON™）内毒素含量<0.1 ng/mg，由Amersham Pharmacia Biotech提供。如前所述，通过酶消化产生小的HA碎片产品（sHA）(5). 消化和分离后，制备1 mg/ml sHA储备溶液，其中含有<0.1 ng/ml LPS，通过鲎试剂（LAL）测定确定。对于实验用途，将其稀释至最终浓度20–50μg/ml，50μg/ml浓度下的最大估计内毒素含量为0.005 ng/ml。

人类DC的制备。

健康献血者的软毛外套是从德国弗莱堡弗莱堡大学医学中心输血医学系获得的。在无内毒素的Ficoll-paque plus™梯度（Amersham Pharmacia Biotech）上分离白细胞，并在冰上与非激活、非阻断的抗人CD14单克隆抗体（克隆26IC；美国型培养物收集）孵育45分钟。细胞在PBS中清洗数次，然后与适当的次级抗鼠MACS孵育^®-珠子（Miltenyi Biotech）。CD14号机组⁺使用VS柱MACS通过磁性细胞分选来纯化细胞^®系统™（Miltenyi Biotech）。流式细胞仪测定分离的单核细胞纯度>90%。单核细胞（5×10⁶将每个孔的细胞）接种到6孔平底板（Costar）中，并在37°C、5%CO下培养₂在RPMI 1640（GIBCO BRL）中加入5%无内毒素人血清白蛋白（拜耳诊断）、GCP/GMP质量1000 U/ml GM-CSF（Leukomax™；诺华公司）和100 U/ml IL-4（由Schering-Plough提供），持续4天。流式细胞术测定，CD14单克隆抗体在培养第3天从单核细胞的细胞表面完全消失。

小鼠骨髓衍生DC的生成。

DC是按照Inaba等人的方法生成的(24)，略有改动。骨髓取自C57BL/6小鼠的胫骨和股骨(n个= 4). 细胞在10点重新悬浮⁶每毫升cRPMI 1640细胞（GIBCO BRL）和40 ng/ml GM-CSF和100 ng/ml IL-4（均为PromoCell）。在培养第3天和第5天喂食细胞，用含有GM-CSF和IL-4的新鲜cRPMI替换每个孔中一半的培养基。第三天，轻轻旋转平板后，将非粘附细胞吸出。第6天，轻轻移液收集松散粘附的细胞，包括DC。DC清洗一次，并在～5×10的条件下重新悬浮⁵cRPMI中每毫升细胞数。将等分的细胞悬液（8 ml）置于一个14-ml锥形底管（Becton Dickinson）中，下垫2 ml 14.5%的metrazamide（Boehringer Ingelheim），并在室温（22°C）下以600×克收集低浮力密度细胞，清洗两次，然后重新悬浮使用。流式细胞术测定Iab阳性细胞的纯度>70%

TNF-α酶联免疫吸附试验。

在指定的时间点收集来自未刺激、LPS-或sHA-刺激DC的上清液，以测定TNF-α的含量。ELISA分析是根据制造商的说明（Becton Dickinson）进行的，并在630 nm的消光条件下在M（M） _第页5000 ELISA阅读器，并使用Bio-Linx™软件（均为Dynatech）进行分析。

淋巴细胞制备/T细胞增殖试验。

脾淋巴细胞的分离方法是，先用10毫升注射器的背面将器官切碎，然后将其放入一个60微米的尼龙网细胞过滤器中。通过添加赖氨酸溶液（0.15 M NH）去除红细胞₄氯，1 mM KHCO_三，0.1 mM钠₂-将EDTA调节至pH值7.2）5分钟。用磁珠标记的抗CD4单克隆抗体通过阴性选择去除剩余APC⁺在4°C下持续45分钟，然后进行磁电池分选（MACS^®; Miltenyi Biotech）。流式细胞术显示CD4的纯度⁺细胞>85%，IA表达细胞<1%。细胞对PHA刺激没有反应。从CD4中取出磁珠⁺通过CD4检测载体和磁性细胞分选（MACS）培养细胞^®; Miltenyi生物技术公司）。纯化CD4⁺cRPMI 1640中的细胞在10⁵圆形96-well板（Costar）中每孔的细胞数以及5×10^三每孔异基因DC并在37°C、5%CO下培养₂.第4天，1μCi/孔^三[H] 在培养的最后18小时添加胸腺嘧啶核苷（Amersham Pharmacia Biotech）。最后，将平板收集到96 well玻璃纤维滤板上，并使用TopCountβ计数器（全堪培拉-帕卡德）通过液体闪烁光谱测定放射性。

免疫染色和流式细胞术。

DC与原代单克隆抗体在4℃孵育30分钟，然后清洗，并用适当的FITC-标记的次级单克隆抗体染色。为了测定细胞活力并排除死细胞，添加1μg/ml碘化丙啶（Sigma-Aldrich）。5×10个样品⁴使用FACScan™和CELLQuest™研究软件（均为Becton Dickinson）对细胞进行分析。

Western Blot分析法测定p42/44和p38-MAPK的磷酸化形式。

使用磷酸化形式的激酶抗体，通过Western blot分析检测p42/44 MAPK（ERK1/2）和p38 MAPK的激活形式。在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂原钒酸钠（1 mM）和磷酸甘油酯（50 mM）混合物的冰镇RIPA缓冲液（150 mM NaCl，0.1 mM Tris-HCl，pH 7.2，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，5 mM EDTA）中，通过超声处理从未经处理的细胞和用sHA或LPS培养的细胞中提取的提取物对于Western blot分析，100μg细胞提取蛋白在SDS/12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并在硝化纤维过滤器上电泳。在含有0.2%吐温20和5%低脂牛奶的PBS中，在室温下将斑点封闭1小时。然后在4°C下与识别非磷酸化形式的p42/44 MAPK或p38 MAPK，或双磷酸化形式（Thr-202/Tyr-204）p42/44MAPK或（Thr-180/Tyr-182）p38MAPK（新英格兰生物实验室）的兔多克隆抗体孵育过夜。然后将印迹清洗五次，并在室温下与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）孵育1小时。进一步洗涤后，用增强化学发光检测（ECD）试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）开发印迹。p42/44 MAPK或p38 MAPK的条带在将印迹暴露于Kodak RX胶片后显现。

核提取物和EMSA的制备。

NF-κB寡核苷酸（Promega）用γ标记-³²[P] ATP（3000 Ci/mmol；Amersham）和T4多核苷酸激酶（Promega）。DC核提取物的制备如前所述(25). 简而言之，使用高盐洗涤剂缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.9，Totex；350 mM NaCl；20%[wt/vol]甘油；1%[wt/vol]NP-40；1 mM MgCl）制备总细胞提取物₂; 0.5 mM乙二胺四乙酸二乙酯；0.1 mM EGTA；0.5毫米DTT；0.1%PMSF；和1%抑肽酶）。通过离心收集细胞，在冰镇PBS（Sigma-Aldrich）中清洗一次，然后再悬浮在四个细胞体积的Totex缓冲液中。在冰上放置30分钟后，以13000×克温度为4°C。测定上清液的蛋白质含量，并将等量的蛋白质（10–20μg）添加到含有20μg BSA（Sigma-Aldrich）、2μg poly（dI dC）（Boehringer Mannheim）和2μl缓冲液D的反应混合物中⁺（20%mM Hepes，pH 7.9，20%甘油，100 mM KCl，0.5 mM EDTA，0.25%NP-40，2 mM DTT和0.1%PMSF），4μl缓冲液F（20%Ficoll 400，100 mM-Hepes、300 mM KCl，10 mM DTD和0.1%PSF），以及100000 cpm（切伦科夫）的³²[P] -标记的寡核苷酸，最终体积为20μl。样品在室温下孵育25分钟。使用γ标记NF-κB寡核苷酸（Promega）-³²[P] ATP（3000 Ci/mmol；Amersham Pharmacia Biotech）和T4多核苷酸激酶（Promega）。样品在6%丙烯酰胺TBE凝胶上分离，凝胶干燥后进行放射自显影。

TLR-4和TLR-2 mRNA表达评估。

如前所述，对人类TLR-4的RT-PCR分析进行评估(26). 根据制造商的说明，使用法玛西亚快速准备试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）从单核细胞衍生DC中分离出总RNA。使用Superscript II逆转录酶（GIBCO BRL）从5μg总RNA合成cDNA。使用Taq-DNA-聚合酶（GIBCO BRL）在94°C/1 min、72°C/2 min、55°C/3 min条件下对产物进行30次PCR扩增。用于人类TLR-4的正向和反向PCR引物为5′-TGGATACGTTCCTTATAAG-3′和5′-GAATGGAGGCACCCCTTC-3′，扩增产物为506 bp。如前所述，使用TLR-2底漆(27)：5′-TATCGTCTTCCTGGTTCAAGCC-3′和5′-AACAGACACAGAGACAGCGCAGAC-3′，扩增产物为1452 bp。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析等分的PCR反应产物（25μl）。

皮肤器官培养。

C57BL/10ScSn野生型（TLR）含有表皮和乳头状真皮的全厚皮肤^+/+)和TLR-4^−/−C57BL/10Cr小鼠（每组三只）是通过耳朵软骨外表皮片的机械分解获得的。将耳罩漂浮在添加了RPMI 1640的6孔板（Greiner）上，添加或不添加30μg/ml sHA或100 ng/ml LPS。24小时后，从各组收集迁移到培养基中的细胞，并用FITC-共轭CD11c和Ia双重染色^B类PE结合单克隆抗体。FACS公司^®如上所述进行分析。从一个孔中获得的所有细胞（5–6×10⁵细胞）进行分析，发现大的、高度CD11c和Ia^B类-阳性细胞被视为DC，并使用CELLQuest™软件（Becton Dickinson）计算百分比。

sHA治疗DC对TNF-α的诱导是时间和剂量依赖性的。

我们之前已经表明，sHA刺激的DC分泌大量的促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α和IL-12，并且sHA诱导的DC成熟是TNF-α依赖性的(5). 为了进一步表征sHA诱导的TNF-α表达的时间和剂量依赖性，我们使用RT-PCR分析sHA治疗人类DC后TNF-βmRNA的表达。观察到TNF-αmRNA的快速诱导，用25μg/ml sHA或100 ng/ml LPS刺激DC后4小时即可检测到TNF--αmRNA(图2A） ●●●●。与LPS诱导的相比，sHA诱导的TNF-α表达在该剂量下更持久(图2A） ●●●●。当用不同浓度的sHA刺激24小时后分泌到培养基中的TNF-α蛋白总量通过ELISA进行定量时，TNF-β产生有明显的剂量反应，50μg/ml sHA产生高达4 ng/ml(图2B和C）。sHA诱导TNF-α的动力学显示，共培养4-5小时后开始较晚，12小时后达到近峰值水平，24小时后略有增加。这种效果取决于浓度，因为10μg/ml sHA足以诱导显著的TNF-β生成，而在浓度>20μg/ml时观察到饱和(图2C） ●●●●。相比之下，100 ng/ml LPS诱导TNF-α的速度更快，30分钟后产生大量TNF-(图2B） ●●●●。我们得出结论，TNF-α响应是测量sHA诱导DC成熟度的一个非常敏感的参数，因此在进一步的实验中它被用作主要的读出系统。

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图2。

分析DC对sHA刺激的TNF-α生成。（A和B）用25μg/ml sHA或100 ng/ml LPS处理人类单核细胞衍生的第4天树突状细胞，持续指定时间。刺激后，收集（A）细胞并制备RNA用于TNF-α特异性RT-PCR，收集（B）无细胞上清液并用TNF-βELISA进行分析。虚线表示对LPS的响应，实线表示对sHA的响应。数据表示三份数值的TNF-α平均释放量；pg/mg总蛋白±SD。（C）DC与指定浓度的sHA或100 ng/ml LPS孵育24 h，收集无细胞上清液，并使用TNF-αELISA进行分析，如上所述。

sHA介导的DC激活需要p38-MAPK和P42/44-MAPK活性以及NF-κB的核转运。

研究表明，LPS诱导DC成熟涉及p38 MAPK和p42/44 MAPK的磷酸化(13). 为了测试MAPK通路的激活是否也参与sHA诱导的DC成熟，我们通过Western blot分析DC裂解物中的p38和p42/44 MAPK。在sHA处理（而非HMW-HA处理）后，与这些MAPK的总含量相比，p38和p42/44 MAPK在1-2小时内迅速磷酸化(图3A和B）。然后，我们研究了导致DC成熟的TNF-α生成是否需要p42/44 MAPK激活。用30μg/ml sHA或100 ng/ml LPS刺激的DC与不同浓度的特定激酶抑制剂预孵育7 h。具体而言，如前所述，使用了PD98059（阻断p42/44 MAPK）、SB-203580（p38-MAPK的选择性抑制剂）、Herbimycin a（src-like蛋白酪氨酸激酶抑制剂）和Wortmanin（磷脂酰肌醇（PI）3-激酶抑制剂）(28–31). ELISA分析显示，与每种不同的MAPK抑制剂预孵育后，TNF-α的生成呈剂量依赖性降低，而沃特曼没有影响，这表明p38和p42/44 MAPK，而不是PI3-激酶参与sHA诱导的信号通路(图3C） ●●●●。由于PI3-激酶的激活与细胞内钙储存的控制有关，后一项发现与我们的结果一致，即sHA治疗DC不会引起Fura标记分析的细胞内钙流量（数据未显示）。

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图3。

sHA介导的DC成熟需要p38-MAPK和P42/44-MAPK磷酸化。（A和B）在指定的时间内，用50μg/ml sHA、100μg/ml HMW-HA或100 ng/ml LPS处理人类单核细胞衍生的第4天树突状细胞。使用针对磷酸化激酶（顶部）或细胞总激酶含量（底部）的单克隆抗体进行免疫印迹。所示为（A）p38 MAPK和（B）p42/44 MAPK的斑点。（C） 在MAPK抑制剂PD98059（p38）、SB 203580（p42/44）、Herbimycin A（src-like tyrosine kinases）或Wortmannin（PI3-激酶）的指示浓度存在下，用30μg/ml sHA或1 ng/ml LPS刺激DC的上清，7小时后采集上清，并通过ELISA筛选其TNF-α含量。数据表示三个重复井的平均TNF-α释放量；pg/mg总蛋白±标准偏差。

为了确定sHA诱导的DC成熟是否涉及NF-κB向细胞核的易位，对细胞核提取物进行了EMSA。如所示图4A、 sHA以时间依赖的方式诱导NF-κB活化，早在sHA治疗后30分钟就获得了显著的信号。此外，与特异性NF-κB抑制剂CAPE合用可剂量依赖性地抑制DC产生TNF-α的能力及其对HLA-DR的上调(图4B和数据未显示），在20μg/ml的浓度下观察到几乎全部的抑制作用。正如预期的那样，LPS促进了NF-κB从细胞液中的释放，与LPS孵育30分钟后观察到强烈的NF-κ的B信号(图4A） ●●●●。总之，这些数据表明p38和p42/44 MAPK的磷酸化以及NF-κB的核转位是sHA诱导DC产生TNF-α的先决条件。

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图4。

sHA诱导的DC成熟依赖于NF-κB。（A） 用HMW-HA（30μg/ml）、sHA（30微克/毫升）、LPS（10 ng/ml）或未经处理的DC制备核提取物。通过EMSA分析每个核提取物中总共10μg的蛋白质的NF-κB活性。箭头表示特定的NF-κB带。（B） 7小时后，在NF-κB抑制剂CAPE的指示浓度下，用30μg/ml sHA（白色条）或10 ng/ml LPS（黑色条）刺激DC的上清，并通过ELISA筛选其TNF-α含量。数据表示三个重复井的平均TNF-α释放量；pg/mg总蛋白±标准偏差。

TLR-4参与人树突状细胞分泌sHA介导的TNF-α，并在刺激后下调。

TLR-4家族，特别是TLR-4复合物，最近被描述为参与细菌感染期间树突状细胞的LPS依赖性激活(13). 我们研究了TLR-4是否也参与sHA诱导的DC活化。抗TLR-4单克隆抗体HTA125能够阻断TLR-4结扎(23). 因此，我们分析了这种抗体对DC对sHA产生TNF-α的影响。人DC与10μg/ml HTA125 mAb预孵育30分钟，之前显示该浓度可有效阻断TLR-4结扎(23)，能够减少这些细胞在长达7小时内sHA诱导的TNFα释放，正如LPS所发现的那样(图5A） ●●●●。较高浓度的HTA125（20μg/ml）或较长的预孵育时间60min可以在一定程度上增强阻断作用(图5A） ●●●●。这些结果首次证明TLR-4参与sHA诱导的DC的细胞内信号传导和成熟。

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图5。

TLR-4介导sHA刺激的人类DC产生TNF-α，并在激活后下调。（A） 抗TLR-4抗体抑制DC对sHA（左）和LPS（右）的反应产生TNF-α。用10或20μg/ml抗TLR-4 mAb HTA 125（如图所示）、匹配的IgG同型对照品（黑圈）或未经处理（白圈）对DC进行预培养30或60分钟。然后用30μg/ml sHA（左）或100 ng/ml LPS（右）刺激细胞，刺激时间为所示时间（h）。如前所述，采集上清液并通过ELISA筛选其TNF-α含量。数据表示三个重复井的平均TNF-α释放量；ng/mg总蛋白。（B） 用RT-PCR分析100 ng/ml LPS或30μg/ml sHA处理指定时间的人DC的总mRNA。顶部显示TLR-2，中间显示TLR-4调节，底部显示β-actin控制。（C） 通过FACS分析DC^®TLR-4的表面表达：未经处理的对照DC（实线）、HMW-HA处理的DC（30μg/ml；虚线）、sHA处理的DCs（30μg/ml；粗线）和LPS-处理的DC。点灰线：DC仅用二级抗体染色。显示了三个独立实验的代表。

为了进一步研究TLR与sHA诱导的DC成熟的关系，我们对TLR-4和TLR-2的表达进行了表征（后者是与细菌脂蛋白结合相关的受体；参考文献14)对sHA治疗的人类DC的反应。RT-PCR分析显示，TLR-4和TLR-2mRNA在未刺激DC的制剂中清楚表达。有趣的是，用20μg/ml sHA处理后，TLR-4和TLR-2 mRNA的表达在6-12小时内下调，而用sHA孵育12小时后没有检测到任何信号(图5B） ●●●●。当用FACS评估树突状细胞TLR-4蛋白的表面表达时，也得到了类似的结果^®分析。再次，我们观察到与sHA或LPS孵育24小时后受体显著下调(图5C） ●●●●。

从这些数据中我们得出结论，TLR-4参与sHA诱导的DC激活，TLR-2和TLR-4在sHA治疗的反应中下调。为了获得TLR-2和TLR-4可能参与sHA诱导DC成熟的更多直接信息，我们从TLR-2-和TLR-4-缺陷小鼠的骨髓中分离出DC，并分析sHA对这些细胞的影响。

TLR-4缺陷小鼠的DC对sHA刺激无反应。

小鼠菌株C3H/HeJ和C57BL10/ScCr由于TLR-4受体的突变或缺失而对LPS无反应(19). 我们使用这些小鼠进一步表征了TLR-4在sHA介导的DC刺激期间的功能。制备来自C3H/HeJ、C57BL/10ScCr和野生型小鼠的骨髓衍生DC，并进行免疫表型分析。我们发现TLR-4缺乏或野生型小鼠DC中MHC II类、共刺激分子B7–1/B7–2或CD11c的表达水平没有差异（数据未显示）。此外，突变小鼠的树突状细胞具有功能活性，因为它们与细菌粗细胞壁提取物共培养后产生大量TNF-α，这些提取物被证明可以激活TLR-4缺陷小鼠的巨噬细胞(17)，尽管这一数量低于野生型DC的产量(图6A） ●●●●。然而，虽然sHA剂量依赖性地刺激野生型DC产生TNF-α，但来自突变小鼠的DC对sHA刺激以及来自野生型DC的纯化LPS完全耐药马流产链球菌或明尼苏达州南部295兰特(图6A） ●●●●。接下来，我们研究了TLR-4突变小鼠的DC对sHA刺激的无反应性是否与其T细胞刺激功能在功能上相关。在标准MLR中，与野生型DC相比，sHA处理突变体小鼠DC的同种异体刺激能力显著降低(图6B） ●●●●。相比之下，HMW-HA对野生型和突变型DC的TNF-α释放或T细胞刺激能力均无影响，即使浓度为100μg/ml(图6). 由于TLR-4是LPS的主要受体，低至50 pg/ml的浓度被描述为激活骨髓单核细胞系的细胞(32)，我们希望排除本研究中使用的sHA制剂中内毒素污染的可能性。LAL分析显示，我们的1 mg/ml sHA储备溶液中的最大内毒素含量为0.1 ng/ml，在50μg/ml sHA浓度的整个分析过程中，最大可能污染为0.005 ng/ml。纯化LPS的滴定实验马流产链球菌结果表明，在我们实验中使用的培养条件下，树突状细胞对LPS浓度<0.2 ng/ml没有反应（数据未显示）。此外，通过在sHA刺激前用10μg/ml LPS抑制剂多粘菌素B预孵育DC进行阻断实验(图6C） ●●●●。多粘菌素B对sHA诱导的IA上调无影响^b条、B7-1或B7-2，但在同一实验中几乎完全抑制了LPS效应(图6C） ●●●●。

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图6。

来自TLR-4缺陷小鼠的DC对sHA刺激不敏感。（A） 骨髓来源的DC来自C3H/HeN（野生型）和C3H/HeJ（TLR-4突变型）或C57BL/10ScSn（野生类型）和C57BL/10ScCr（TLR-5突变型）。在培养的第6天，DC要么与含有LPS和其他物质（如脂蛋白）的100 ng/ml细菌细胞壁裂解物一起培养，要么与来自马流产沙门氏菌或米内索塔沙门菌菌株R595作为阳性和阴性对照。或者，添加10或50μg/ml sHA或100μg/ml HMW-HA。处理48小时后，通过ELISA筛选无细胞上清液的TNF-α含量。数据表示一式三份的孔的平均TNF-α释放量；pg/mg总蛋白±SD。（B）DC用A中描述的相同物质处理48 h，洗涤，并与10⁵DC/TC比为1:20的同种反应性T细胞。在第5天通过添加1μCi^三[H] 最后18小时的胸腺嘧啶核苷。结果显示为三个孔的每分钟计数（CPM）±SD。（C） 第6天，用30μg/ml sHA或100 ng/ml LPS培养C57BL/10Sn（黑条）或C57BL/10Cr（白条）骨髓衍生DC 24小时，和/或在刺激前1小时用10 mg/ml多粘菌素B（polyB）预处理。培养24小时后，对DC进行Ia染色^b条、B7-1和B7-2的表达并通过流式细胞术进行分析。结果显示平均荧光强度（MFI）。

sHA介导的DC刺激不依赖TLR-2的表达。

TLR-2是一种通过膜脂蛋白/脂肽激活巨噬细胞的受体伯氏疏螺旋体，梅毒螺旋体、和发酵支原体(14，33). 为了检测TLR-2是否在sHA诱导的DC成熟中发挥作用，TLR-2缺陷的DC(14)野生型小鼠是从骨髓中产生的。用LPS或sHA处理这些细胞，比较它们分泌TNF-α的能力。TLR-2缺陷的DC对LPS和sHA反应良好(图7A） ●●●●。这些数据在功能水平上得到了证实，因为在标准MLR中，sHA和LPS处理后突变体小鼠DC的异体刺激能力显著增强(图7B） ●●●●。综上所述，这些数据表明sHA介导的DC刺激依赖TLR-4而非TLR-2，因为DC中存在非功能性突变TLR-4受体不能支持sHA诱导的DC成熟，而TLR-2缺陷的DC对sHA的反应与野生型DC相似。

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图7。

sHA介导的DC刺激并不依赖TLR-2的表达。第6天骨髓-来源于C57BL/6或C57BL/6TLR-2的DC^−/−用指示浓度的高纯度LPS培养48小时马流产沙门氏菌或sHA。（A） 通过ELISA筛选无细胞上清液中的TNF-α含量。数据表示三个重复井的平均TNF-α释放量；pg/mg总蛋白±SD。（B）DC用A中描述的相同物质处理48 h，洗涤，并与10⁵DC/TC比为1:20的同种反应性T细胞。在第5天通过添加1μCi^三[H] 最后18小时的胸腺嘧啶核苷。结果显示为三个孔的每分钟计数（CPM）±SD。

这项工作得到了德国基金会的资助（DFG TE 284/2-1）。