生长板是软骨的一个特殊区域，确保长骨的纵向生长。生长板软骨细胞经历一个以增殖、生长停滞、成熟和肥大为特征的连续分化过程。最终，肥大的软骨细胞被骨取代。在增殖区，软骨细胞排列成6-8个细胞的列。Doods早在1930年就指出，软骨细胞垂直于生长骨骼的长轴分裂，必须经历广泛的运动才能排列成纵列(杜德1930). 然而，参与软骨细胞“旋转”的分子仍然未知。
软骨细胞完全被细胞外基质（ECM）蛋白质网络包围，因此缺乏细胞间接触。软骨细胞与基质分子的相互作用被认为与生长因子和细胞因子一起调节其增殖和分化。同样，软骨细胞上的ECM受体被认为可以调节细胞粘附和ECM分子在软骨中的正确超分子组装。
整合素是一类主要的细胞粘附分子，可介导此类细胞-基质相互作用。它们由α和β亚单位组成，结合ECM蛋白和反受体，并调节各种生物过程，包括ECM蛋白的超分子组装、细胞的粘附和迁移、细胞周期进展、细胞生存和分化(Bouvard等人，2001年;Brakebusch等人，2002年;海恩斯2002). 软骨细胞表达多种β1和αv整合素(洛伊瑟2000)，可以介导对软骨中发现的各种基质分子的粘附。
两项体外研究表明β1整合素在软骨发育和功能中具有重要作用。注射抗β1抗体抑制小鼠肢芽间充质细胞培养物软骨结节的形成(沙基拜1998)提示β1整合素在间充质冷凝或软骨细胞分化过程中是必不可少的。在鸡胸骨软骨的器官培养中，添加抗β1整合素的抑制性抗体导致胸骨生长减少、细胞尺寸减小、丝状肌动蛋白束组织紊乱、X型胶原沉积缺失以及细胞凋亡增加(Hirsch等人，1997年).
迄今为止，整合素对软骨细胞的这种关键功能尚未通过体内模型得到证实。软骨细胞表达的某些单个整合素亚基基因的构成性零突变小鼠在软骨细胞分化（α5，β1）之前具有致死表型，因此，关于它们在软骨细胞功能中的作用的信息很少。然而，由β1整合素缺乏的ES细胞产生的嵌合体小鼠含有一些突变的软骨细胞，这表明它们可以在体内缺乏β1整合素的情况下分化(Fässler and Meyer 1995年). 其他缺乏α1、α2、α6、αv、β3或β5整合素的突变小鼠没有表现出明显的骨骼表型（有关综述，请参阅Bouvard等人，2001年)表明在骨骼发育中没有或有多余的作用。
为了克服β1整合素缺乏小鼠胚胎致死的问题，我们培育了携带软骨特异性β1整合素基因。我们发现β1整合素突变体软骨细胞无法在生长板中形成柱，并且存在严重的增殖缺陷，影响细胞周期的几个阶段。
结果
软骨细胞缺乏β1整合素小鼠的产生
为了评估β1整合素在软骨内骨形成过程中的功能，我们将携带漂浮β1整合素基因（β1飞行/飞行;Potocnik等人，2000年)在小鼠II型胶原启动子的控制下表达cre重组酶的小鼠(第2a1-cre列;K.Sakai等人，2001年). 在子代中，cre介导条件β的消融1整合素等位基因并激活无启动子lacZ公司第二个下游插入报告基因液氧磷站点（有关详细信息，请参阅Brakebusch等人，2000年;Potocnik等人，2000年).Col2a1克/β1流量/重量小鼠没有表现出异常。全贴装X-gal染色法第2a1-cre列/β1液体/重量胚胎显示出漂浮β的缺失1整合素基因输入第2a1列表达软骨生成组织和非软骨生成组织。在胚胎第10.5天（E10.5），在所有的硬化瘤中观察到强烈的LacZ活性，其中包含椎体原基的前体细胞(). 在E12.5，软骨前生成区域以及轴向和阑尾骨骼的软骨生成成分显示LacZ活性（数据未显示）。
删除β的1整合素突变体的基因和大体形态。(A类)用X-半乳糖全染色法证明β1整合素基因在E10.5胚胎杂合子中的cre介导的缺失1整合素等位基因和第2a1-cre列转基因。请注意体节中强烈的LacZ活性。(B类)E11.5发育中脊柱的β1整合素免疫染色（IHC）和X-gal染色。在野生型（w）中，β1整合素在前脊椎（pv）的软骨前凝集区高表达，而突变型（m）前脊椎缺乏β1整合素表达，表现出较强的LacZ活性。(C类)新生儿胫骨（NB）β1整合素免疫染色显示，突变生长板软骨细胞和软骨膜（p）无β1整合素染色。星号表示突变软骨膜中有一条β1-整合素阳性血管。(天)原代肋骨软骨细胞的FACS分析证实突变细胞上缺乏β1整合素和β1整合素相关α亚基（α1、α5和α6）。(E类)Alizarin-red和alcian-blue双骨骼染色分别用于骨骼和软骨组织，显示突变小鼠中存在所有骨骼元素。前肢的近距离观察表明，长骨[（h）肱骨；（r）桡骨；（u）尺骨]较短且较宽。(F类)9周龄时的X射线分析显示，与对照组相比，突变体的尺寸进一步缩小，前凸轻微。(插图)近距离观察后肢显示骨骼变宽，但骨密度没有明显变化。
第2a1-cre列/β1液体/重量雄性与携带两个游离β的雌性杂交1等位基因或一个floxed和一个构成null（n）等位基因(Fässler and Meyer 1995年).Col2a1克/β1飞行/飞行和Col2a1克/β1液体/液体后代发生软骨发育不良，并且在表型上彼此无法区分。因此，我们将这两种类型的小鼠称为突变型（m）小鼠。E11.5突变小鼠的免疫染色显示，椎体前浓缩区的β1整合素几乎完全丢失，而lacZ活性也很强(). 在E12.5，发育中的未来长骨软骨原基仍显示非常微弱的β1整合素免疫染色（数据未显示），而在E14.5和E17.5，骺和生长板软骨细胞和软骨膜细胞完全缺乏β1整合素表达(; 数据未显示）。Northern和FACS分析进一步证实了β1整合素的丢失。原代软骨细胞的RNA样本没有β特异探针的信号1整合素（未显示数据）。分离肋骨软骨细胞的FACS分析显示，突变细胞表面的β1整合素和β1整合素相关α亚基（α1、α2、α5和α6）丢失(; 数据未显示）。突变软骨细胞上αvβ3的表达水平不变().
软骨中β1整合素缺失导致严重软骨发育不良
大多数突变小鼠出生后不久死于呼吸窘迫。新生小鼠比对照组矮()～50%患有腭裂。在223个突变后代中，只有3个存活并发展为进行性侏儒症().
E17.5胚胎的全贴装骨骼染色显示，突变体中同时存在骨骼和软骨(). 他们的长骨变短变宽了(). 突变体中未发现颈椎骨化中心，表明矿化延迟（数据未显示）。
组织学分析显示，突变长骨的软骨原基在E13之前看起来正常（数据未显示）。E14.5时，突变肱骨的长度明显缩短()肥大细胞带减少，原基中部的矿化和血管化延迟(). E17.5时，突变骨骼严重缩短(). 胫骨半长度显著缩短（17.2%，第页<0.01），生长板与骨干中部的距离（43.2%，第页<0.001），骨髓带长度（45%，第页<0.001），以及肥厚带的长度（15%，第页与对照组相比，突变体中观察到<0.05）。静止区的长度在突变体中显著增加（10%，第页<0.05），而增殖区长度和生长板总高度相似。
野生型（wt）和突变型（m）小鼠软骨内骨形成的组织学分析。(A类-D、 E、G、H、J)番红花橙van Kossa染色。(F、 I、K、L)托利丁蓝染色。(A类-天)在E14.5，突变肱骨（hu；C类)与野生型肱骨相比，肱骨中央肥厚区（h）明显缩短(A类). (B类)高倍镜显示原发性骨化中心的血管侵犯，野生型的骨领和末端肥大软骨细胞基质矿化。(天)相反，突变体中未观察到血管形成，矿化仅限于骨膜。(E类-J)E17.5时，变异肱骨干骺端大大缩短，有明显的小梁和骨环(H（H）). 野生型生长板软骨细胞的典型柱状排列(F类)在突变体中是杂乱无章的(我). (F、 插入)两个旋转软骨细胞（箭头所示）。在突变生长板中(我)，软骨细胞并排放置（箭头和插入)数量较少。末端肥大软骨细胞的纵隔在突变体中显示出较少且呈片状的矿物质沉积(J)与野生型相比(G公司). (K、 L（左）)6周龄小鼠胫骨的生长板（gp）形态。突变体中的生长板变宽，缺乏柱状组织（L），并含有双核软骨细胞（箭头所示）。
突变骨骼的生长性能下降与生长板的严重紊乱有关(). 在正常生长板中，增殖的软骨细胞是扁平的，在细胞分裂过程中，它们的有丝分裂像总是垂直于骨长轴。两个子细胞呈半圆形，并排位于腔隙中，通过广泛的细胞形状变化和腔隙内的旋转运动再次变成盘状(，参见插图；杜德1930). 在β1-null生长板中，大而圆的软骨细胞也显示垂直于长轴的有丝分裂像（数据未显示），但它们的形状没有改变，并排停留，无法相互滑动并形成柱状(（见插图）和钙化的纵隔(). 突变软骨细胞的这种异常旋转运动导致生长板变宽，纵向生长减少（图。,). 此外，软骨细胞的数量减少，而突变生长板各区域软骨细胞之间的细胞外间隙大大增加().
少数突变小鼠存活下来。他们患有严重的侏儒症，9周龄时骨骼缩短了40%(). 对3周龄突变小鼠的组织学分析显示，骨骺中次级骨化中心的形成延迟，生长板肥大区减少（数据未显示）。皮质骨看起来正常，但原发性海绵状骨的小梁长度减少（数据未显示）。与对照组相比，6周龄时，突变生长板完全紊乱并变宽(). 经常检测到大的无细胞基质区域和双核软骨细胞().
突变软骨细胞表现出粘附和扩散缺陷
因为大多数软骨ECM分子通过同源整合素结合软骨细胞(洛伊瑟2000)β1整合素突变骨的生长板异常可以用软骨细胞基质相互作用的完全或部分丧失来解释。对人和牛软骨细胞的几项研究表明，整合素α1β1、α2β1和α10β1是II型胶原的受体；层粘连蛋白的α1β1和α6β1；纤维连接蛋白（FN）的α5β1、αvβ3和αvβ5；以及αvβ3和αvβ5。为了研究β1整合素介导的软骨细胞与ECM的相互作用，我们对正常和突变小鼠肋骨笼中新分离的软骨细胞进行了粘附试验(). 突变细胞完全失去了粘附II型胶原和层粘连蛋白的能力。虽然突变软骨细胞对纤维连接蛋白的粘附减少了约55%，但它们正常粘附于玻璃体凝集素。用卵磷脂和抗局灶黏附（FA）蛋白抗体（paxillin、zyxin、vinculin）染色显示传播减少，但正常肌动蛋白应激纤维和卵黄凝集素上突变细胞的FA形成减少(; 数据未显示）。突变细胞在纤维连接蛋白上的扩散明显减少，呈现圆形外观。他们显示出较少且较薄的应力纤维，并显示出外周肌动蛋白染色增加。正常软骨细胞形成FA，FA均匀分布于细胞内。突变软骨细胞的FA较少，主要集中在细胞外围().
突变原代软骨细胞的粘附和扩散异常。(A类)粘附试验。突变软骨细胞缺乏对II型胶原（CII）和层粘连蛋白I（LN）的粘附，对纤维连接蛋白（FN）的黏附减少，对卵磷脂（VN）的正常黏附。数字代表平均附着力；误差条代表SD(B类)扩散分析。突变软骨细胞在纤维连接蛋白上的扩散受损，肌动蛋白应激纤维减少，FA蛋白（paxillin，zyxin）的募集减少。在玻璃体凝集素上，突变软骨细胞的扩散受影响较小。(C类)骨骺软骨软骨细胞中肌动蛋白分布的共焦显微镜观察。野生型软骨细胞显示出均匀的皮质染色。突变细胞显示出间断的肌动蛋白分布。
接下来，我们评估了体内的细胞骨架组织。用指骨肽染色的组织切片的共焦显微镜显示，野生型软骨细胞中的皮质肌动蛋白环均匀，而在突变细胞中肌动蛋白分布呈点状(). 波形蛋白和微管蛋白的免疫染色未显示野生型组织和突变组织之间的可检测差异（数据未显示）。
β1整合素控制胶原纤维组装
接下来，我们在超微结构水平上分析了胶原蛋白原纤维的组织。E17.5和6周龄肢体软骨的电子显微镜检查()发现突变生长板中胶原纤维分布异常。E17.5时，静息区的纤维密度正常（数据未显示），但区域间的纤维密度降低()和区域/细胞周基质()增殖区和肥大区（数据未显示）。在6周龄时，在突变软骨的所有区域都观察到纤维密度显著降低的区域(; 数据未显示）。此外，原纤维的直径有不寻常的变化，趋向于形成平行的原纤维束而不是原纤维网络(; 数据未显示）。
胶原网络的组织依赖于β1整合素。(A类-天)正常和突变生长板软骨基质室的电子显微照片。(A、 B类)区域间基质中胶原纤维密度降低(A类)以及在区域/细胞周隔室中(B类)在新生儿期的突变增殖区。(C类)在6周时，增生区经常出现胶原纤维网络稀疏且无组织的区域。(天)注意突变体组织休息区的纤维直径异常大。(E类-G公司)缺失小鼠骨骼发育正常纤连蛋白软骨中的基因。(E类)免疫染色显示基质中缺乏纤维连接蛋白第2a1-cre/FN列飞行/飞行4周龄小鼠。(F类)血毒素-ChromotropIIR染色显示突变小鼠的生长板结构正常。(G公司)对9个月大的小鼠进行的X射线分析表明，突变体的骨骼正常。
研究表明，培养的成纤维细胞表面纤维连接蛋白的α5β1依赖性组装调节胶原沉积和纤维组装(Velling等人，2002年). 由于β1缺陷软骨中的异常胶原网络可能是生长板结构异常的原因，我们研究了FN在软骨中缺乏FN表达的小鼠软骨内骨形成过程中的作用。FN突变小鼠通过杂交获得第2a1-cre列纤维连接蛋白漂浮小鼠(T.Sakai等人，2001年). 令人惊讶的是第2a1-cre列/FN公司飞行/飞行小鼠发育正常，没有出现骨骼异常。软骨中纤维连接蛋白表达的丧失通过多克隆抗纤维连接蛋白抗体的免疫染色显示，该抗体检测所有纤维连接蛋白同种型(). 2个月龄前生长板和关节软骨的组织学研究()一只9个月大的突变小鼠的X射线分析()显示骨骼正常，表明纤连蛋白在软骨内骨形成过程中没有限速作用。
软骨分化受损
为了研究β1-整合素缺陷软骨细胞的分化特性，我们进行了Northern印迹、免疫组织化学、原位杂交分析和组织化学测试，使用E17.5的软骨生成、血管生成和成骨标记物。与β1整合素（包括II型胶原、纤维连接蛋白和基质蛋白-1）相互作用的基质蛋白的免疫染色(; 数据未显示）显示突变软骨无明显异常。类似地，其他软骨基质蛋白（如聚集蛋白聚糖和tenascin-C）的分布没有改变（数据未显示）。然而，我们发现X型胶原蛋白的沉积，通常在肥大区和前肥大区表达，深入到突变软骨的增殖区().
长骨发育分化事件分析。(A类)在E17.5对胫骨进行II型胶原（Col2）和X型胶原（Col10）免疫染色。X型胶原（肥大和前肥大软骨细胞的标志物）的沉积延伸到突变生长板的增殖区。(B类)原位杂交胶原蛋白II(第2a1列),X型胶原蛋白(第10a1列),印度刺猬(Ihh公司)、和PTH/PTHrP受体(Ppr公司). 在野生型中，第2a1列在增殖区（p）和前高营养区（ph）强烈表达，在肥厚区（h）表达较少，第10a1列在肥厚区和前肥厚区，以及Ihh公司和PP-R型在前高营养区。在突变体中第2a1列正常，而第10a1列在肥厚区减少，在前肥厚区变宽。的表达式Ihh公司和PP-R型在前高营养区也变宽了。(C类)的表达式第1-3页和Bmp2型胫骨E15.5处。鉴于Fgfr1、Fgfr2、和Bmp2型正常Fgfr3级在突变软骨中上调。(天)来自E17.5肢体软骨分离的初级软骨细胞的总RNA的Northern杂交。的表达式第2a1列、第9a1列、和苦参素1(材料1)突变软骨细胞中没有改变。的表达式Fgfr3级增加，而第10a1列突变软骨细胞减少。
E17.5软骨细胞分化标记物的原位杂交()显示出强大第2a1列突变和野生型小鼠生长板增殖区和前增生区的mRNA表达。的表达式第10a1列定义为野生型和突变型中的肥大区和前肥大区。然而，在突变生长板中，肥厚区的长度减少，而前肥厚区长度增加(). 与野生型相比，突变生长板组织与前营养标记的杂交印度刺猬(Ihh公司)和甲状旁腺激素/甲状旁腺素相关肽受体(Ppr公司)还显示了一个增宽且无组织的前增生区，其中含有较少的软骨细胞().
接下来，我们分别使用明胶酶B（MMP9）和内皮细胞表面标记物endomucin的免疫组织化学染色来研究软骨-骨转换和血管侵袭前沿。突变体的软骨骨连接处的横隔和骨小梁表面观察到正常的MMP9沉积（数据未显示）。突变体中的血管系统也与对照组无明显区别，对照组显示血管正常侵入末端肥大软骨细胞区（数据未显示）。最后，碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性染色分别显示成骨细胞和破骨细胞数量正常（数据未显示）。
软骨内骨形成受各种信号分子调节，包括成纤维细胞生长因子（FGF）和骨形态发生蛋白（BMP）家族成员（有关综述，请参阅Karsenty和Wagner 2002). 测试Fgf受体1-3，Bmp2、和英国标准普尔4受β1整合素缺失的影响，我们使用特定的mRNA探针对E15.5胫骨切片进行原位杂交。的表达式Fgfr2，Bmp2、和英国标准普尔4在软骨膜细胞中，野生型和突变型组织无法区分(; 数据未显示）。同样，Fgfr1级在突变小鼠的软骨膜和肥大软骨细胞中以正常水平表达(). 然而，令人惊讶的是，在所有分析的组织样本中，我们发现Fgfr3级突变软骨的表达(). E17.5原代软骨细胞mRNA的Northern杂交进一步证实了这一观察结果(). 的表达式第2a1列、第9a1列、和马特1在突变RNA样本中没有变化()，而第10a1列减少，这与突变生长板中较小的肥厚区一致().
软骨细胞增殖逐渐减少，凋亡增加
测试软骨元件的尺寸是否减小Fgfr3级表达与软骨细胞增殖减少和/或存活有关，我们在不同发育阶段进行了溴脱氧尿苷（BrdU）掺入、细胞周期和凋亡分析。使用BrdU分析()，我们在E14.5处的对照和突变生长板中发现了类似数量的增殖软骨细胞。在后期，我们观察到突变胫骨增殖区中BrdU阳性细胞的百分比逐渐减少。新生儿期减少25%，3周龄减少60%。6周龄时，突变生长板几乎完全缺乏增殖细胞。
野生型（wt）和突变型（m）小鼠软骨细胞增殖和凋亡分析。(A类)BrdU掺入法分析软骨细胞增殖。图中显示BrdU标记的细胞核从E14.5到6周龄逐渐减少。误差条代表S.D.星号，表示控制型和野生型之间的统计显著差异(*,P（P）< 0.05;**,P（P）< 0.01). (B类)图中显示了在不同阶段通过免疫染色评估的野生型和突变生长板中cyclin-D阳性细胞的百分比。(C类)显示新生儿和6周龄胫骨TUNEL和裂解caspase-3（cl.casp-3）阳性软骨细胞百分比的图表。(天)蛋白质印迹显示酪氨酸残基861（pY）处FAK的酪氨酸磷酸化水平降低861)和397（pY397). 重新检测FAK总量。(E类)FAK激活减少与p130cas和paxilin招募减少无关。用针对FAK、FAK-Tyr 397（pY397）、p130cas、paxillin和phospho-paxilin（p-paxillin）的抗体通过Western blotting分析FAK免疫沉淀物。(F类)MAP激酶活性的Western blot分析。突变细胞新生期磷酸化Erk1和Erk2水平明显正常。6周时，在野生型样本中检测到磷酸化Erk2，但在突变样本中未检测到。重新检测了总Erk的斑点(G公司)ILK表达水平和GSK3α/β磷酸化形式的分析。突变体中ILK和磷酸化GSK3α/β水平正常。(H（H）)新生儿原代软骨细胞凋亡的生化分析。裂解caspase-3（cl.casp-3；上面的面板）和磷酸化Akt-Thr 308和Ser 473的水平(降低面板）在突变体中与野生型相比没有显著差异。重复印迹未分离caspase-3（ucl.casp-3）和总Akt。
通过免疫组织化学对控制G1进展的D型细胞周期蛋白（细胞周期蛋白D1、D2和D3(). 与对照组相比，突变生长板中的细胞周期蛋白D阳性细胞在新生儿期减少了10%，在3周龄时减少了20%。6周时，在突变生长板中几乎未检测到细胞周期蛋白D阳性细胞。新生原代软骨细胞提取物的蛋白质印迹也证实了细胞周期蛋白D表达的减少，而M型细胞周期蛋白（细胞周期蛋白A和B）的水平没有显著变化（数据未显示），表明G1/S转换延迟。
通过细胞周期素依赖性激酶（CDK）的活性实现G1期和G1/S转换检查点的进展，并由CDK抑制剂（CKI）负调控。软骨细胞表达几个属于Cip/Kip（p21）的CKICip1号机组，第27页基普1，第57页基普2)或墨水4（第16页墨水4a，第18页墨水4c，第19页墨水4d)家庭(Beier等人，1999年)，其中一些被激活Fgfr3级信号(Su等人，1997年;Li等人，1999年). 因此，我们分析了E17.5野生型和突变型长骨中p16、p21、p27和p57的表达(). 在野生型中，所有CKI均在含有有丝分裂后分化软骨细胞的前增生区和肥大区强烈表达，而在含有循环细胞的增殖区表达较低。虽然β1缺失生长板显示p27和p57表达正常，但p16和p21阳性细胞的数量显著增加(). p16的标记指数（阳性细胞数与细胞总数相关）在对照组为14%±3.4%，在突变组为32%±2.8%。p21在对照区和突变增殖区的标记指数分别为11%±2.6%和18.5%±3.1%(). 有趣的是，这种增加仅限于增殖区，而在骺软骨中未观察到().
β1阴性增殖软骨细胞中细胞周期抑制剂p16和p21的表达增加，Stat1和Stat5a的核移位。(A类)E17.5野生型（wt）和突变型（m）生长板中细胞周期抑制剂的免疫组织化学。突变增殖区（p）中p16和p21的表达选择性增加，而p27和57的表达与野生型相似。（ph）前高压带；（h） 肥厚带。(B类)显示生长板增殖区和骺软骨中细胞周期抑制阳性细胞百分比的图表。误差条代表S.D.星号，表示控制型和野生型之间的统计显著差异(*,P（P）< 0.05;**,P（P）< 0.01). (C类)Stat1和Stat5a的免疫染色表明突变增殖区的核移位增加（箭头）。
一些报告表明，FGF信号升高促进Stat1（转录1的信号转导子和激活子）和Stat5a/Stat5b的核移位，进而调节CKI，包括p16和p21（有关综述，请参阅奥尔尼茨和玛丽2002). 为了测试β1缺失生长板中Stat蛋白移位是否增加，我们进行了Stat1和Stat5a免疫染色。而Stat1在野生型增殖软骨细胞中的表达微弱且局限于细胞质()，突变体生长板中的细胞质染色增加，一些软骨细胞显示出清晰的细胞核染色(). 此外，10.5%±2.8%的野生型软骨细胞显示Stat5a1的核移位。突变软骨细胞的这一数值增加到17%±3.2%().
为了研究其他β1-整合素依赖的信号通路是否也有助于缺陷软骨细胞的增殖，我们分离了原代软骨细胞并分析了信号分子的活性。用识别在特定酪氨酸残基（pY）磷酸化的黏着斑激酶（FAK）的抗体进行免疫印迹861和pY397)在新生儿的突变样本中显示FAK激活显著降低(). 令人惊讶的是，FAK磷酸化的降低与p130Cas或paxillin向FAK募集的减少无关()表明p130Cas和paxillin介导的下游通路在β1整合素缺乏的软骨细胞中不受影响。用细胞外信号调节激酶（Erk1和Erk2）抗体进行的Western blot分析显示，它们在新生儿期的激活状态没有明显差异。然而，在6周时，在野生型中检测到激活的Erk2，但在突变样品中未检测到().
整合素链接激酶（ILK）与β1整合素细胞质结构域相关，小鼠软骨特异性ILK公司基因缺失也显示软骨细胞增殖减少，表现为G1/S转换缺陷(Grashoff等人，2003年). 为了测试β1缺失软骨细胞中ILK功能是否发生改变，我们分析了ILK的表达以及糖原合成酶激酶3-β（GSK3b）和蛋白激酶B/Akt（Akt）的磷酸化状态，这两种有争议的靶蛋白建议通过ILK的激酶活性进行修饰(Brakebusch和Fässler 2003). 我们发现对照组和突变组提取物中ILK水平相似(). 此外，突变软骨细胞显示GSK3-β的正常磷酸化()和Akt().
使用TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法）分析组织切片上的细胞死亡，并对裂解的caspase-3进行免疫染色(). E17.5对照小鼠在形成关节表面和胫骨软骨骨接合处发现凋亡细胞（数据未显示）。在突变体中，在骨骺和生长板软骨中发现TUNEL或裂解caspase-3阳性细胞区域（数据未显示），尽管凋亡细胞的数量低于1%(). 6周时，通过TUNEL和caspase-3免疫染色在突变生长板中检测到凋亡软骨细胞，其数量增加到3%(). 与组织切片中观察到的非常低的凋亡率一致，我们发现与对照组相比，突变细胞提取物中的凋亡标记caspase-3的激活没有升高().
缺乏β1整合素表达的胞质分裂缺陷
尽管G1/S转换存在缺陷，但FACS对初生新生软骨细胞DNA含量的分析表明，与野生型相比，突变小鼠的G2/M数量增加了6%，G0/G1细胞数量减少了14%(). G2/M期软骨细胞的积累以及突变生长板中双核细胞的存在表明胞质分裂缺陷。为了进一步研究缺陷，我们在超微结构水平上分析了软骨细胞的形态和细胞核轮廓。生长板各区域的新生突变细胞的大小增加，增殖软骨细胞的形状为球形而非扁平(). 突变软骨细胞的细胞核形状异常，异色区染色强烈(). 野生型多核软骨细胞的数量＜0.2%，而突变体的多核软骨细胞数量在4%至8%之间，这取决于生长板的地带性(). 大多数是双核的()，但偶尔也观察到具有三个或四个细胞核的软骨细胞。突变体中双核细胞的频率随年龄增加而增加。在6周龄的生长板中，我们在突变组织中发现约30%的细胞具有两个细胞核，而在对照切片中，双核软骨细胞的百分比<1%。总之，这些数据表明β1整合素缺乏的软骨细胞的胞质分裂受损。
β1-整合素缺乏的软骨细胞在G2/M期积累，显示出较高的双核化率。(A类)新生野生型和突变型初级软骨细胞细胞周期分布的FACS分析。(B类)电子显微照片显示E17.5野生型（wt）和突变型（m）胫骨生长板休息区（RZ）、增殖区（PZ）和肥大区（HZ）的软骨细胞形态。注意突变生长板每个区域软骨细胞的圆形和增大的大小。突变细胞常染色质减少，经常出现双核化。(C类)图显示E17.5处野生型和突变软骨区中多核软骨细胞的百分比。误差线代表S.D(*,P（P）< 0.05;**,P（P）< 0.0001). (天)β1整合素在卵裂沟中的定位。分离的野生型原代软骨细胞进行肌动蛋白和β1整合素免疫染色。DAPI染色显示DNA。
细胞分裂需要F-肌动蛋白/肌球蛋白收缩系统的临时组装，称为分裂沟，其中包含许多其他蛋白质，包括α-肌动蛋白和塔利班(Fujiwara等人，1978年;Bellissent-Waydelich等人，1999年)为了检测β1整合素是否位于卵裂沟中有助于细胞分裂的位置，我们对培养的野生型软骨细胞进行了FITC-柱状体蛋白和抗β1整合素抗体的双重染色。在前期，染色质浓缩成染色体；中期，染色体沿赤道平面排列；后期早期，染色单体分离，染色体移向相反的纺锤极；在FA处检测到β1整合素，类似于间期细胞（数据未显示）。在后期和末期，当肌动球蛋白收缩环形成时，卵裂沟中阴茎倍体蛋白和β1整合素都被强烈染色().
讨论
在每次分裂后，软骨细胞相互迁移并占据单独的腔隙，其中包含大量ECM蛋白。在这里，它们形成许多细胞-基质相互作用，主要由整合素介导。在本文中，我们报告了一个Cre/液氧磷-β的介导性缺失1整合素软骨细胞中的基因导致严重的软骨发育不良，围生期死亡率很高。软骨发育不良在出生后进行，其特征是生长板变形，包含畸形软骨细胞，无法排列成柱状，细胞数量减少，胶原纤维网络异常。增殖减少与G1进展缺陷和胞质分裂有关。
β1整合素-ECM相互作用对生长板结构至关重要
β的删除1整合素硬化瘤细胞中的基因既不影响其向耳弦周围区域的迁移，也不影响其凝集和随后向椎体软骨细胞的分化，这表明β1-整合素介导的细胞-基质相互作用对这些过程不是必需的，也可以被其他细胞粘附分子有效地补偿。
据先前报道，抗β1整合素抗体干扰培养的肢芽间充质向成软骨细胞的冷凝和分化(沙基拜1998). 由于我们在长骨软骨原基形成过程中观察到β1的表达仍然很微弱，我们不能排除β1整合素对阑尾骨骼的初始分化很重要的可能性。
成软骨细胞分化后形成骨化中心和生长板。骨干中的初级骨化中心和骨骺中的次级骨化中心形成，但在β1表达缺失时显著延迟。延迟的原因尚不清楚。一种可能的解释是基质蛋白的异常沉积和肥大的延迟，这与我们在生长板中观察到的情况类似。长骨两端形成生长板，负责软骨内骨化。它们的软骨细胞排列成柱状，并在骨髓之前变得巨大或肥大，软骨在骨髓中被移除并沉积。这些柱状物来源于休息区的单个圆形软骨细胞(杜德1930). 软骨细胞的细胞分裂垂直于骨长轴。然后子细胞变平并移动，形成平行于骨骼长轴的细胞堆栈（参见补充视频1）。这些扁平的细胞堆被增殖区中的重复细胞分裂拉长。在β1-null生长板中，增殖的软骨细胞没有变平，仍然是大而圆的。虽然它们的有丝分裂图仍然垂直于长轴，但没有形状变化，只发生了部分运动。因此，突变软骨细胞没有排列成柱状，导致骨骼变宽，并阻止柱间形成明确的纵向间隔（见补充视频2）。因此，在突变体中，肥大区基质的矿化和小梁骨的形成受到严重损害。
软骨细胞形状异常及其形成柱体的运动受损，最简单的解释是β1缺失软骨细胞与周围基质的粘附不足，这对所有类型的形状变化都至关重要。事实上，从新生小鼠分离的β1-整合素缺乏软骨细胞未能粘附II型胶原和层粘连蛋白-1，与野生型细胞相比，粘附纤维连接蛋白的效率低50%。可以想象，与其他丰富的软骨蛋白（如珍珠糖、基质蛋白-1和软骨粘连蛋白）结合的β1整合素也会丢失或减少。
此外，整合素信号的丢失也可能导致表型。整合素-基质相互作用调节GTPases Rho家族成员的活性，进而重新排列细胞骨架。事实上，我们在体内突变软骨细胞中发现肌动蛋白网络紊乱，而中间丝和微管系统没有明显变化。在野生型细胞中，肌动蛋白均匀分布在质膜下，而在许多突变的软骨细胞中，其分布更为分散。当我们分离出正常和突变软骨细胞并将其镀在FN上时，我们观察到扩张严重缺陷，应力纤维形成减少，病灶接触越来越少，表明肌动蛋白重排和FA形成在缺乏β1整合素的情况下受到严重干扰。突变的原代软骨细胞显示FAK的激活显著降低，已知FAK通过Cas/Crk、paxillin或PI3-K激活Rac1（有关综述，请参阅Parsons等人，2000年). 由于FAK-相关的Cas和paxillin的数量正常，这些途径在体内软骨细胞中似乎不依赖整合素。由于从新生小鼠肋骨笼中获得的软骨细胞数量有限，因此无法评估Rac1的活性。
β1整合素调节软骨细胞分化吗？
有报道称，抗β1整合素抗体阻断了鸡胸骨器官培养物中X型胶原的沉积，表明软骨细胞的最终分化是由整合素β1家族成员介导的(Hirsch等人，1997年). 我们发现X型胶原蛋白表达减少，但不是完全阻断。此外，我们在突变生长板中观察到较短的肥大区和较大的前肥大区，表明β1整合素在软骨细胞成熟和肥大中的复杂作用。
生长板中软骨细胞分化的调节在很大程度上尚不清楚，但通过Ihh/PTHrP信号传导的途径显然发挥了作用(Lanske等人，1996年;Vortkamp等人，1996年;圣雅克等人，1999年). 在发育完全的生长板中，Ihh由增生前软骨细胞产生，并通过关节周围细胞诱导PTHrP的表达。PTHrP从关节端扩散，作用于生长板中表达的PTH/PTHrP受体（PPR），在增生前区达到最高水平，并防止肥大。我们发现在突变生长板中Ihh公司和聚丙烯与野生型相比，用更少的细胞来划定更宽的前高营养区。这一观察表明软骨细胞成熟受到干扰，这可能是突变生长板中肥大区长度缩短的部分原因。然而，β1整合素如何参与分化尚不清楚。β1整合素-基质相互作用的缺失可能直接调节软骨细胞分化，或者这些变化也可能是突变生长板结构紊乱的间接结果。
控制软骨细胞肥大的其他信号通路也可能来自软骨膜。这些途径包括FGFs、BMPs、TGFβs及其受体（有关综述，请参阅Karsenty和Wagner 2002;Vortkamp 2001年). 尽管β1整合素软骨膜细胞中的基因被删除Fgfr1、Fgfr2、Bmp2、和英国标准普尔4β1整合素对这些软骨膜标记物的表达没有明显作用。
β1整合素控制G1/S转换Fgfr3级
整合素信号在细胞生长控制中起着重要作用。β1缺乏的软骨细胞在体内增殖减少，出生后更为严重。这种增殖受损与Erk活化减少和细胞周期蛋白D表达减少密切相关，表明细胞周期中G1/S转换受损。我们的一些观察结果可能导致这种G1细胞周期缺陷。首先，FAK活性降低可能有助于Erk磷酸化降低和软骨细胞生长减少。
其次，Ihh是另一个重要的参与者，除了在软骨细胞分化过程中发挥显著作用外，还可以调节软骨细胞增殖。Ihh显示从增生前区扩散到增殖区(Gritly-Linde等人，2001年)，通过调节细胞周期蛋白D1的表达，至少部分支持软骨细胞增殖(St-Jacques等人，1999年;Long等人，2001年). 我们发现Ihh公司表达紊乱，突变生长板中含有较少的细胞。随着年龄的增长，细胞外间隙逐渐增加可能导致Ihh扩散受损，导致Ihhh信号受损，细胞周期蛋白D1表达降低，从而导致软骨细胞增殖减少。或者，Ihh信号可能依赖于完整的β1整合素信号，如神经元细胞中Shh的信号所示(Pons等人，2001年).
第三，多种生长因子信号级联依赖于多种细胞类型中的整合素活性。这种协同作用的一个候选生长因子是FGF，它通过FGFR3发出信号，并在软骨内骨形成过程中负调控软骨细胞增殖（有关综述，请参阅Karsenty和Wagner 2002;奥尔尼茨和玛丽2002). 本构激活Fgfr3级突变会导致侏儒发育不良，如人类的软骨增生症、软骨发育不全（ACH）和促性腺发育不良（TD），而具有ACH突变的转基因会导致小鼠出现类似的缺陷。此外，来自TD患者和转基因小鼠的软骨细胞表达激活形式的Fgfr3级激活Stat蛋白（Stat1、Stat5a和Stat5b）并上调细胞周期抑制剂p16、p18、p19和p21的表达(Su等人，1997年;Li等人，1999年). 我们测试了Fgfr3级在β1突变生长板和原代软骨细胞中，发现Fgfr3级. This rise ofFgfr3级与Stat1/Stat5a的核转位增加以及β1-null生长板增殖区p16和p21的表达增加相关。这些数据首次表明，β1整合素通过调节Fgfr3级正常软骨细胞的mRNA水平Fgfr3级转录或通过降低Fgfr3级mRNA。
最后，ILK的软骨细胞特异性缺失可能结合β1整合素细胞质结构域，导致明显的增殖缺陷、细胞周期蛋白D水平降低、F-actin异常分布和细胞形状改变(Grashoff等人，2003年). 尽管在β1缺失的生长板中也观察到了这些缺陷，但一些关键发现表明，ILK活性和ILK介导的信号传导即使受到β1表达缺失的轻微影响。β1-null软骨细胞ILK水平正常，新生ILK-null软骨上皮细胞整合素表达正常，Ihh公司、和Fgfr3级(Grashoff等人，2003年; A.Aszodi、C.Grashoff和R.Fässler，未解释）。此外，ILK-null软骨细胞具有非常轻微的整合素介导的粘附缺陷，其排列成柱状的能力仅稍有减弱(Grashoff等人，2003年).
β1整合素调节软骨细胞的胞质分裂及其存活
细胞周期的第二个异常发生在M期。在胚胎发生期间，双核细胞的百分比显著增加，表明胞质分裂延长或流产。出生后双核软骨细胞的百分比进一步增加，达到6周龄小鼠细胞的30%。可以想象，细胞周期蛋白D表达的逐渐丧失和胞质分裂缺陷都有助于6周龄突变小鼠软骨细胞增殖几乎完全消失。
缺乏β1整合素的胞质分裂受损似乎是一种软骨细胞特异性缺陷，因为我们没有在其他β1缺陷细胞类型中观察到双核细胞，如ES细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或造血细胞。这可能是因为与其他细胞类型相比，分裂细胞之间的沟槽形成更依赖于软骨细胞中的β1整合素。结果表明，沟壑中含有大量与整合素相关的肌动蛋白结合蛋白，如α-肌动蛋白(Fujiwara等人，1978年)和塔林(Bellissent-Waydelich等人，1999年). 我们可以证明，β1整合素亚基定位于分裂软骨细胞的分裂沟，在那里它们可能有助于将F-actin环锚定在膜上，或者诱导收缩以完成细胞分裂。在软骨细胞以外的细胞中，这种锚定功能可能更多地依赖于ERM（ezrin radixin-moesin）蛋白，这些蛋白也在卵裂沟中富集(Sato等人，1991年).
除了增殖缺陷外，我们还发现凋亡率略有但显著增加，这表明β1-整合素介导的胶原-软骨细胞相互作用支持软骨细胞存活。这一发现与之前的观察结果一致。首先，抗β1阻断抗体增加了类器官培养系统中胸骨软骨细胞的死亡(Hirsch等人1997). 第二，胶原酶处理悬浮软骨细胞培养物会增加细胞凋亡，而胶原酶消化培养物中I型胶原蛋白的加入会阻止细胞凋亡(曹等人，1999年). 最后，体内软骨中II型胶原表达的缺失也与软骨细胞凋亡的增加有关(Yang等人，1997年). 整合素可以通过激活Erk、FAK-Rac1-JNK途径或通过FAK和PI3K激活Akt来抑制程序性细胞死亡(Giancotti和Rouslahti 1999年). 在β1缺陷的软骨细胞中，我们观察到Akt活化没有变化，但磷酸化Erk和FAK的数量减少，这表明后两种信号通路最有可能导致凋亡增加。
胶原结合整合素调节II型胶原网络的组装
软骨中β1整合素表达缺失导致原纤维-胶原网络的超微结构异常。除了突变基质中的原纤维密度普遍降低外，我们还发现胶原原纤维的结构发生了显著变化。纤维直径不规则，有时甚至比正常纤维厚10倍。由于β1缺失的软骨细胞在体外未能粘附到II型胶原，因此胶原纤维网络紊乱似乎独立于胶原与细胞受体的结合。然而，这表明软骨细胞上β1整合素的表达对于形成典型的胶原纤维网络至关重要。
胶原蛋白可以结合纤维连接蛋白，一些报道表明纤维连接到蛋白网络可以作为新生成的胶原纤维的支架(Hedman等人，1982年;Velling等人，2002年). 然而，纤维连接蛋白基因软骨特异性缺失小鼠软骨的正常表型强烈反对这一假设。此外，纤维连接蛋白缺乏小鼠证明，由α5β1和αvβ3介导的软骨细胞与FN的粘附对软骨细胞的形状、运动、胞质分裂、分化或存活并不重要。
胶原蛋白网络密度降低可以用几种机制解释。首先，尽管第2a1列mRNA，由于突变软骨中的细胞较少，II型胶原沉积到基质中的量减少。其次，通过β1整合素取消的信号转导增加了基质金属蛋白酶（MMPs）的表达或活性，从而降低胶原蛋白的等级。我们在突变型和野生型长骨中观察到MMP-2、MMP-9和MMP-13水平没有差异，但我们不能排除其他MMPs的活性在缺乏β1整合素的情况下发生改变。然而，软骨-骨连接处的正常血管化和基质中胶原纤维降解产物的缺乏反驳了这些假设。胶原纤维密度降低可能导致β1突变小鼠软骨基质中可溶性物质扩散增加。这可能是X型胶原免疫反应异常扩张到增殖区的原因，也可能影响生长因子的功能。
材料和方法
抗体
在免疫学研究中，使用了以下抗体：对抗II型胶原、X型胶原、聚集蛋白、纤维调节蛋白、tenascin-C、COMP（有关详细信息，请参阅Aszodi等人，1998年); 珍珠糖(Costell等人，1999年); 苦参素-1、-2和-3(Aszodi等人，1999年); 内粘蛋白(Morgan等人，1999年); MMP2、MMP9和MMP13（取自英国诺维奇生物科学学院Gillian Murphy）；p16、p21、p57、Stat1和Stat5a（圣克鲁斯生物技术公司）；p27（细胞信号转导技术）、paxillin、phospho-paxilin、p130cas（转导实验室）；zyxin（取自德国布伦瑞克GBF于尔根·威兰德）；vinculin（西格玛）；β1整合素(Brakebusch等人，2000年); 和纤维连接蛋白(T.Sakai等人，2001年). 肌动蛋白用FITC-共轭指骨肽（Sigma）检测。流式细胞术中，使用鼠抗小鼠β1、β3、β5、α1、α2、α3、α5和α6整合素亚基（PharMinen）的单克隆抗体。对于蛋白质分析，兔抗FAK抗体（Santa Cruz Biotech）；FAK Tyr397和FAK Tryr861（生物资源国际）；Akt、Akt-Thr 308、Akt-Ser 473、ERK1/2、磷酸化-ERK1/2、磷化-GSK3α/β、未分离的caspase-3、裂解的caspase-3（均来自细胞信号技术）；cyclin-D1、cyclin-A、cyclin B（Upstate Biotechnology and Santa Cruz Biotech）；使用了ILK（转导实验室）。
初级软骨细胞的分离和测定
从新生或6周龄野生型和突变小鼠中分离出肋骨、骨骺和生长板软骨的软骨细胞。在补充有2%胎牛血清（FCS）和链霉素/青霉素的DMEM中解剖肋骨笼和关节。37°C下胶原酶（II型，沃辛顿）消化（DMEM/2%FCS中2 mg/mL）30分钟后，将粘附组织和软骨膜物理去除。软骨细胞使用新鲜胶原酶培养基在潮湿的大气中释放（5%CO）295%空气）持续2-4小时。
按照Fässler等人的描述，对正常和突变软骨细胞进行粘附分析(1995).
为了进行细胞扩散，将原代软骨细胞接种在补充有0.5%FCS的DMEM中，放在涂有纤维连接蛋白或玻璃体凝集素的8孔Lab-Tek室玻片上（Nalge Nunc International）。让细胞扩散3天，然后进行抗体染色。
对于流式细胞术，将初级软骨细胞与整合素亚基的初级抗体（见上文）孵育，然后与FITC-偶联次级抗体孵育并用FACSCAN流式细胞仪（Becton Dickinson）分析荧光。用丙碘染色和FACS进行细胞周期分析。
蛋白质分析
新鲜分离的软骨组织或初级软骨细胞在RIPA裂解液缓冲液中均质，在冰上培养30分钟，并在4°C下以10000 rpm离心5分钟。对于Western blot分析，将等分（10-20μg）的蛋白质提取物在还原样品缓冲液中煮沸，用SDS-PAGE分离，并印在PVDF膜上（Amersham International）。在室温下，用含有5%脱脂奶粉（TBST-M）的TBS-0.1%吐温20（TBST）封闭膜1小时，从而降低非特异性结合。将膜与一级抗体在TBST-M4°C下孵育过夜，在TBST-M中洗涤，并在室温下与适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育1h。用TBST强烈洗涤后，使用ECL检测系统（Amersham）制备免疫印迹。使用琼脂糖偶联的抗FAK抗体从RIPA提取物中免疫沉淀FAK（Upstate Biotechnology，克隆4.47）。
形态测量学
为了进行形态计量分析，对12只野生型和12只突变型动物的新生胫骨进行了处理，并在光镜和电镜水平上进行了研究。生长板区根据形态学标准和长骨内的地形定位进行评估(Hunziker等人，1987年). 区域长度分析如下(Cruz-Orive和Hunziker 1986). 为了实现体视学分析的最高效率，根据Gundersen和Jensen的说法，采用了系统随机抽样方案(1987). 为了估计每个区域中多核细胞在总细胞群中的百分比，在最终放大960倍的半薄切片上拍摄的阳性照片上计算显示多核现象的核轮廓的比例。
