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公共科学图书馆一号。2008; 3（1）：e1443。
2008年1月16日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0001443
预防性维修识别码：项目经理2175533
PMID：18197253

线粒体激酶复合物对介导类固醇生物合成中关键调节蛋白的ERK1/2依赖性磷酸化至关重要

塞西莉亚·波德罗索,1 丹妮拉·P·匡威,2 保拉·马洛贝蒂,1 亚历杭德拉·杜阿尔特,1 伊莎贝尔·诺伊曼,1 索莱达·加利,2 法比亚娜·科尼霍·马西尔,1 克里斯蒂娜·帕兹,1 玛丽亚·卡雷拉斯,2,3 胡安·波德罗索,2和埃内斯托·波德斯塔1,*
徐文清，学术编辑
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

众所周知，ERK1/2参与激素刺激的类固醇合成，但其确切作用和潜在机制尚不清楚。ERK1/2磷酸化和类固醇生成可能由cAMP/cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）依赖性和依赖性机制触发；然而，cAMP激活ERK1/2导致类固醇生成率最高，而表皮生长因子（EGF）的典型激活则没有。我们通过Western blot分析和共聚焦研究证明，在Leydig-transformed MA-10细胞系中，时间线粒体ERK1/2激活对于PKA介导的类固醇生成是必需的。PKA活性导致组成线粒体MEK1/2池的磷酸化，在细胞溶质MEK中的作用较低，而EGF允许主要的细胞溶质MEK激活和核pERK1/2定位。这些结果可以解释为什么PKA比EGF更支持线粒体中持久的ERK1/2激活。通过体外实验表明，线粒体最大类固醇生成是类固醇合成关键调节成分类固醇发生急性调节蛋白（StAR）、活性ERK1/2和PKA相互作用的结果。我们的结果表明，线粒体StAR和ERK1/2之间存在相互作用，涉及一个D结构域，该结构域具有与ERK底物类似的序列碱基疏水基序。由于这种结合，并且只有在胆固醇存在的情况下，ERK1/2在血清中磷酸化StAR232.Ser的定向突变232转化为非磷酸化氨基酸，如Ala（StAR S232A）被抑制在体外通过活性ERK1/2实现StAR磷酸化。用StAR S232A瞬时转染MA-10细胞显著降低孕酮生成量。总之，这里我们表明StAR是ERK1/2的一种新底物，线粒体ERK1/2是调节胆固醇转运的多聚蛋白激酶复合体的一部分。强调了MAPK在线粒体功能中的作用。

介绍

在类固醇生成的复杂过程中，线粒体是限速步骤（胆固醇跨线粒体膜转运）发生的位置[1],[2].

胆固醇转运需要在线粒体上几个蛋白质之间的特定相互作用，包括电压依赖性阴离子通道（VDAC）[3]外周苯二氮卓受体（PBR，目前称为转运蛋白或TSPO）[4]PBR-相关蛋白（PAP7）[5]和类固醇生成急性调节蛋白（StAR）[5]–[8]StAR蛋白在N末端具有线粒体靶序列，在胞浆中合成为37kDa前体蛋白，在线粒体基质中裂解形成30kDa蛋白[7],[9]–[11]StAR蛋白的N端47或62氨基酸调控的小鼠或人类形式刺激线粒体外胆固醇的转运，表明30 kDa形式在线粒体外膜上是活跃的[12],[13]根据上述结果，StAR的活性形式应在基质中的前体加工后重新出口。这一假设尚未得到证实。然而，众所周知，HSP60等其他蛋白质也存在再输出过程[14]此外，研究还表明，抑制37 kDa形式StAR蛋白的加工抑制MA-10 Leydig和Y1肾上腺皮质细胞中的类固醇生成[9],[11],[15]–[18]因此，线粒体中StAR蛋白的加工效率与StAR活性细胞中类固醇生成活性之间的关系尚未完全阐明。

StAR基因的转录以cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）依赖性方式增加[6],[19]此外，PKA的非基因组翻译后效应已被报道与StAR相关。PKA磷酸化小鼠和人类StAR的特定基序，如Ser56-57和Ser194-195分别为[20]。StAR功能需要此事件[21]虽然可以肯定PKA的激活对营养激素刺激的类固醇生物合成很重要[22]–[26]众所周知，ERK1/2及其上游激活物MEK1/2通过基因组和非基因组效应参与类固醇生成的调节[27]–[32]然而，对其在非基因组效应中的作用知之甚少。包括我们在内的几个小组已经证明ERK1/2和MEK1/2靶向不同组织中的线粒体[33],[34]鉴于线粒体是类固醇生成急性调节的主要部位，本研究旨在评估ERK1/2在类固醇细胞线粒体中的作用。在此，我们证明了线粒体ERK1/2的PKA依赖性激活，而ERK1/2又以胆固醇依赖的方式与StAR相互作用并磷酸化StAR。

总之，我们已经证明线粒体ERK1/2是胆固醇转运的调节器，强调MAPK的亚细胞定位是调节特定细胞功能的重要机制。

结果

MEK1/2激活和活性ERK1/2是类固醇生成的严格要求，并且依赖于PKA激活

图1A结果表明，U0126或PD98095（MEK1/2激活抑制剂）抑制了8Br-cAMP刺激的MA-10 Leydig细胞在15分钟内产生孕酮（P4）。这些发现证实了Gyles的观点等.和Manna和Stocco[27],[29]然而，结果与Seger的结果不一致等表明ERK信号级联抑制促性腺激素刺激的类固醇生成[31]值得一提的是，在本文中，有几个方法上的差异，其中主要是MEK/ERK抑制剂的作用是在用促性腺激素刺激rLHR4颗粒细胞24和48小时后进行测试[31].

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类固醇生成严格需要MEK1/2激活和活性ERK1/2。

（A） 将MA-10细胞与50µM PD98059或10µM U0126预孵育30分钟。然后，分别给予或不给予0.5 mM 8Br-cAMP 15分钟。如前所述，通过放射免疫分析（RIA）测定孕酮（P4）[41],[60]（a，与对照组相比p<0.05；b，仅与8Br-cAMP相比p<0.05）。使用两种质粒通过电穿孔转染MA-10细胞，带有野生型或突变型ERK2（H230R）序列。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。c、 与对照转染pRc/CMVi-GFP相比p<0.05；d、 与转染细胞+8Br-cAMP相比p<0.05；e、 与野生型ERK2相比p<0.05）。在使用或不使用10µM的U0126孵育后，用0.5mM的8Br cAMP（B）或10ng/ml的EGF（C）刺激MA-10细胞指定的时间。如前所述，对细胞裂解物进行SDS-PAGE和Western blot[41]，具有抗pERK1/2和总ERK1/2的特异性抗体。免疫印迹显示了三个独立实验的代表性结果。使用总ERK1/2作为负荷控制来量化谱带的强度。条形表示pERK1/2以任意单位存在的相对水平。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。**，p<0.01 vs.0分钟。

我们在U0126和PD98095中观察到的效果不是通过PKA的抑制介导的，因为在这两种抑制剂存在的情况下，这种酶仍然保持完全活性（数据未显示）。再次与之前公布的结果一致[30],[35],[36]U0126和PD98095对细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶没有影响，因为22（R）-OH-胆固醇是胆固醇的一种自由扩散的类似物，即使在抑制剂处于培养基中时也会启动类固醇的生成（数据未显示）。

活性ERK1/2被证实是类固醇生成所必需的。野生型ERK2在MA-10细胞中的过度表达导致8Br-cAMP亚最大浓度刺激的类固醇生成增加(图1A). 野生型ERK2的过度表达导致类固醇生成增加约45%，并占最大类固醇形成的约70%（数据未显示）。45%的增加是由转染细胞中活性ERK2的丰度所解释的。值得一提的是，根据绿色荧光蛋白转染控制测定，这些实验中的细胞转染效率约为35–40%，这与参考文献相符[37],[38]ERK2的一种非活性形式，H230R变体，不能与MEK1相互作用，但保留了以减弱的方式与MEK2相互作用的能力[39]没有产生野生型ERK2的作用(图1A).

接下来，我们用表皮生长因子（EGF）或cAMP对MA-10细胞进行差异刺激。生理学上，虽然cAMP类似物（如8Br-cAMP）最大限度地刺激Leydig细胞中的类固醇生成，但与cAMP相比，EGF只产生10-20%的最大类固醇产生[40]关于ERK1/2磷酸化，我们发现两种刺激都显示出不同的时间进程。8Br-cAMP型(图1B)和EGF(图1C)在EGF处理的细胞中，分别在15和5分钟诱导ERK1/2磷酸化达到最大值，随后迅速衰减至基础水平。相反，8Br-cAMP持续延长的ERK1/2激活，这在刺激一小时时仍然很明显。在这两种条件下，MEK1/2抑制剂U0126几乎完全抑制了ERK1/2的磷酸化(图1B和C).

如前所示[28]用PKA抑制剂H89处理细胞时，人类促性腺激素（hCG）或8Br-cAMP的ERK1/2磷酸化被抑制（数据未显示）。

cAMP或EGF刺激后pERK1/2的定位

免疫印迹显示，8Br-cAMP刺激后，磷酸化ERK1/2（pERK1/2）位于胞浆和线粒体中，在较小程度上位于细胞核部分(图2，A、B和C的上部面板）。在线粒体和细胞液中，ERK1/2磷酸化的早期峰值出现后，8Br-cAMP作用的第一个小时内信号缓慢逐渐减少。相反，在EGF刺激后，pERK1/2主要定位于胞浆和细胞核(图2，A、B和C的中间面板）。在线粒体中，活性在早期（5分钟）达到峰值，然后衰减。hCG刺激导致ERK1/2激活，与8Br-cAMP诱导的ERK1/2活化相似(图2，A、B和C的下部面板）。这一后来的结果证实了8Br-cAMP取代激素的作用。

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激素或EGF刺激的pERK1/2活化的亚细胞分布的比较。

将MA-10细胞与或不与0.5 mM 8Br-cAMP（A、B和C的上部面板）、10 ng/ml EGF（A、B和C的中部面板）或20 ng/ml hCG（A、C和B的下部面板）一起培养指定时间。接下来，获得亚细胞组分，并对每个组分的40µg总蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测pERK1/2（在A、B和C中用pERK1/2表示）。剥离后，在同一膜中检测到总ERK1/2（在A、B和C中用ERK1/2表示）。Western blots显示了三次典型实验的结果。D显示量化，如所述图1.**，p<0.01，*，p<0.05 vs.时间0。（E） 在使用或不使用0.5 mM 8Br-cAMP或10 ng/ml EGF治疗指定时间后，对MA-10细胞中的pERK1/2（绿色）和线粒体（红色）进行免疫荧光染色。合并的图像显示在右侧面板中。

共焦显微镜证实了8Br-cAMP和EGF激活线粒体ERK1/2的两个不同时间序列(图2E). 与免疫印迹一样，在8Br-cAMP作用后，pERK1/2与线粒体共定位，这种作用最早可在五分钟内观察到(图2E)30分钟后仍然很明显(图2E). 相反，在补充EGF后，pERK1/2和线粒体标记物的共定位时间很短（5分钟，图2E)30分钟时不明显(图2E).

我们发现MA-10细胞的胞浆和线粒体中存在两种不同的MEK1/2和磷酸化MEK1/2（pMEK1/2）池(图3). 有趣的是，MEK1/2对刺激的反应因分布而异(图3A). 8Br-cAMP明显诱导线粒体MEK1/2磷酸化延长，但对胞浆激酶的影响不太显著。相反，EGF在细胞液中诱导了持续且强大的MEK1/2活化，但在线粒体中仅诱导了适度的磷酸化。有趣的是，尽管EGF和8Br-cAMP都增加了细胞液总MEK1/2，但只有EGF促进了其在亚细胞部分的磷酸化作用。由于MEK1/2总量在治疗期间发生了变化图3我们还评估了相应印迹中酰基辅酶A硫酯酶（Acot2）、NADH-细胞色素c还原酶（复合物I）的39 kDa亚基和β-微管蛋白的含量。在8Br-cAMP刺激的细胞中，Acot2被用作线粒体负荷控制[41]在经EGF处理的细胞中，Acot2检测被NADH-细胞色素c还原酶（复合物I）的39 kDa亚基所取代，因为硫酯酶的含量随EGF处理而改变（未发表的观察结果）。在两种处理中，β-微管蛋白检测被用作胞质负荷对照。这些负荷控制表明，MEK1/2总信号的变化实际上是由于生物变异，而不是由于每条通道中蛋白质的不同数量（细胞溶质部分的cAMP处理15、30和60分钟，线粒体部分的60分钟；细胞溶质组分的EGF处理30分钟）。因此，我们将pMEK1/2表达为相对于负荷控制水平，而不是相对于总MEK1/2水平。

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线粒体和胞浆中MEK1/2的激活完全依赖于刺激类型和PKA活性。

（A） 用0.5mM 8Br cAMP或10ng/ml EGF刺激MA-10细胞达指定时间。Western blot分析细胞液和线粒体pMEK1/2含量。采用线粒体酰基辅酶A硫酯酶（Acot2）、NADH-细胞色素c还原酶（复合物I）的39 kDa亚基和细胞溶质β-微管蛋白检测作为负荷控制。免疫印迹显示了三个独立实验的代表性结果。条表示pMEK1/2（黑色条）和总MEK1/2的水平（灰色条）相对于β-微管蛋白（细胞溶质部分）、Acot2（线粒体部分-8Br-cAMP处理）或复合物I（线粒体部分-EGF处理）的任意单位。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。*p<0.05 vs.0分钟；**，p<0.01 vs.0 min。（B）在20µM H-89（PKA活性抑制剂）存在或不存在的情况下，用0.5 mM 8Br-cAMP刺激不同时间的MA-10细胞，分析线粒体中pERK1/2和pMEK1/2的含量。Acot2检测作为pMEK1/2和总MEK1/2蛋白印迹的负荷控制。该图显示了来自三个独立实验的代表性免疫印迹。（C） 使用Lipofectamine 2000试剂，用100 nM siRNA瞬时转染MA-10细胞，以对抗PKA催化亚单位的α亚型。转染后，将细胞与0.5 mM的8Br-cAMP孵育不同时间，用western blot分析线粒体pMEK1/2、总MEK1/2，PKA催化亚基的α亚型和NADH-细胞色素c还原酶（复合物I）的39 kDa亚基的含量。这是三个独立实验中的一个代表性实验。（D） 如（C）所述瞬时转染MA-10细胞，并用8Br-cAMP刺激15和30分钟。按照制造商的说明，使用pERK1/2（pThr185/pTyr187）ELISA试剂盒（美国密苏里州圣路易斯市西格玛化学公司）测量pERK1/2活性。条形图表示pERK1/2活性为平均值±SD（n=3）。a、 p<0.05，模拟转染细胞和8Br-cAMP处理细胞（15分钟）与模拟转染和非8Br-cAM处理细胞（0分钟）相比；b、 p<0.05，PKA催化亚单位siRNA转染和8Br-cAMP处理的细胞（15分钟）与模拟转染细胞和8Br-cAMP处理细胞（15 min）相比。（E） 用0.5 mM 8Br-cAMP孵育不同时间后，从MA-10细胞分离的细胞溶质和线粒体部分中的PKA活性。棒状物表示纳入肯普替特异性PKA合成底物的放射性。PKA分析如前所述进行[61]数据表示为平均值±SD（n=3）。**，p<0.01，*p<0.05 vs.0分钟。

用PKA抑制剂H89处理细胞，可消除cAMP作用引起的线粒体pERK1/2和pMEK1/2的增加(图3B)和PKA击倒实验(图3C和D). 因此，8Br-cAMP作用5分钟后线粒体中的PKA活性明显增加(图3E)与细胞器中MEK1/2和ERK1/2磷酸化形式的出现平行。

沉默干扰RNA（siRNA）处理对PKA催化亚单位α亚型表达的有效性通过western blot检测到该亚型的细胞含量减少来证明(图3C). 正如预期的那样，PKA蛋白水平的降低也会导致cAMP刺激的P4产生的减少（培养基中的P4浓度，单位为ng/ml：对照：1.60±0.01；8Br-cAMP 15分钟：3.7±0.6；siRNA+8Br-cAMP15分钟：2.2±0.2，p<0.01）。与使用H89相比，PKA敲除减少孕酮生成的幅度较小（数据未显示），因为如上所述，转染效率不是100%，因为它是细胞吸收H89。

MEK磷酸化通过PKA、StAR和pERK1/2增加体外胆固醇转运与黄体酮的线粒体合成

为了测试活性ERK1/2对胆固醇输入和孕酮合成的直接影响，我们进行了无细胞检测[22]通过分离线粒体测定孕酮的产生。为了用StAR富集非刺激线粒体，我们将StAR cDNA转染到MA-10细胞。免疫印迹显示StAR在线粒体中的表达有效增加和处理(图4A). 与空载体转染或反义序列转染相比，全长StAR cDNA在有向转染时线粒体产生的P4略有增加(图4B，bar a与反义和pRc/CMVi单独）。用重组ERK1补充分离的线粒体后，P4产量增加(图4B，b条vs.a）。添加一个非活性ERK1突变体（K71A）不会影响类固醇的生成(图4B，bar c vs.a）。K71A缺乏自磷酸化能力，磷酸转移酶活性降低[42]当分离的线粒体补充重组PKA催化亚单位和野生型ERK1时，P4的生成比单独补充野生型ERK1时增加更多(图4B，条形图d与b）。同样，当ERK1被其K71A非活性形式取代时，这种作用消失了(图4B，bar e vs.d）。补充野生型ERK1和K71A ERK1，无论是否含有PKA催化亚单位，都不会影响StAR线粒体含量(图4A). 还显示在图4A是相应孵育后PKA、pMEK1/2、pERK1/2和总ERK1/2的线粒体含量。值得一提的是，在用ERK1-GST培养的线粒体样品中(图4A通道b、c、d和e）存在44 kDa ERK1的强信号，可能是由于线粒体蛋白酶裂解融合蛋白而产生游离蛋白[43]由于线粒体类固醇生成依赖于这些蛋白酶对StAR的处理，因此在这种实验中不需要使用蛋白酶抑制剂[10],[44]。正如已经在体内实验如所示图3，PKA的添加增加了线粒体pMEK1/2在体外(图4A). 这些结果支持可能形成一个大的线粒体多激酶复合物，从而激活类固醇的生产。

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严格要求PKA和ERK1/2才能通过分离的线粒体获得最大孕酮产量。

用空载体或含有StAR cDNA的载体（正反义方向）通过电穿孔瞬时转染MA-10细胞。线粒体在胆固醇作为底物（a）、野生型ERK1-GST蛋白单独（b）或与PKA催化亚基（d）共同存在的情况下孵育。还使用了ERK1-GST（K71A）的突变非活性形式（c和e）。在指定的培养后，将线粒体制成颗粒，并进行SDS-PAGE和Western blot（A）。使用识别StAR蛋白、PKA催化亚单位、pMEK1/2、pERK1/2和总ERK1/2的特异性抗体。该面板显示了三个独立执行的实验的代表性Western印迹。P4产量如（B）所示。数据表示为平均值±SD（n=3）。*p<0.05 bar b vs.bar a和§p<0.05 bar d vs.bar b。（C）MA-10细胞接受或不接受0.5 mM 8Br-cAMP治疗3小时；获得细胞溶质和线粒体亚细胞组分，并在存在或不存在与琼脂糖珠结合的人pERK1-GST的情况下培养。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析与pERK1-GST（复合物）结合的输入蛋白和颗粒蛋白。免疫印迹显示与StAR和pERK1/2相对应的条带，作为负载控制。数据代表了三个独立执行的实验。

ERK1与线粒体中的StAR相互作用

最初，我们检查了StAR结构，以确定允许对接到ERK1/2的一致序列。一个被称为D域的典型对接站点(K（K）吨K（K）长期工作负荷大规模集成电路）在氨基酸235和244之间发现。该位点在ERK1/2上游激酶、MAPK磷酸酶和ERK底物中保守[45]这一发现使我们测试了MA-10亚细胞组分中的蛋白质相互作用。为了研究富含StAR的线粒体，我们从8Br-cAMP刺激3小时的细胞中分离出这种亚细胞部分。刺激后，在细胞溶质和线粒体部分检测到StAR的30-kDa亚型(图4C). 用pERK1-GST处理亚细胞组分表明，StAR仅在线粒体组分中与pERK1相互作用(图4C).

StAR被ERK1/2磷酸化在体外胆固醇的存在增加了这种磷酸化

为了研究ERK1/2对StAR的磷酸化作用，我们进行了在体外使用成熟的纯重组StAR蛋白（30kDa）和两种形式的ERK1在[γ-32P] ATP。StAR确实被野生型ERK1磷酸化，但在激酶的非活性突变体K71A存在的情况下没有观察到这种现象(图5A). 有趣的是，野生型ERK1的磷酸化似乎需要胆固醇，因为在这种脂质存在的情况下，信号显著增加(图5A).

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StAR在Ser中磷酸化232ERK1以胆固醇依赖的方式。

将30µg重组纯化的30 kDa野生型StAR与组成活性的His标记野生型ERK1（wt）或突变的非活性ERK1形式（K71A）（A组）或PKA催化亚单位（cs）一起在没有或存在10µM胆固醇（A组和B组）的情况下孵育存在或不存在His-tagged野生型ERK1（面板B）。磷酸化分析后，通过SDS-PAGE和放射自显影术分析磷酸化蛋白水平。（C） 如上所述，在胆固醇存在的情况下，StAR被His-tagged野生型ERK1磷酸化。如前所述，用内蛋白酶V8对磷酸化产物进行有限消化[8]根据Shagger和Von Jagow的描述，用凝胶分析肽[62]以及放射自显影术。方框表示6 kDa肽的氨基酸序列，其中Ser232下划线。（D） StAR的野生型和突变型（S232A）用于在体外磷酸化分析如（A）所述。磷酸化产物通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。面板A、B、C和D中的结果代表了三个独立执行的实验。（E） 用空载体（pRc/CMVi）或用含有37kDa野生型StAR（wt）、S232A-StAR（S232A）或S232E-StAR（S232E）的全长cDNA的载体通过电穿孔转染MA-10细胞。用0.5 mM的8Br-cAMP刺激细胞30分钟。通过RIA测定培养基中的P4浓度来评估P4生成。数据表示为平均值±SD（n=3）。*，p<0.05 S232A StAR与wt StAR。

PKA催化亚基的StAR磷酸化既不依赖于ERK1以前的StAR磷酸化，也不依赖于胆固醇的存在(图5B). 在胆固醇存在的情况下，PKA和野生型ERK1的联合作用进一步增加了放射性信号的强度，表明这两种激酶对StAR的双重磷酸化(图5B).

ERK1/2在Ser磷酸化StAR232

接下来，我们在StAR中搜索ERK1/2磷酸化位点。只有两个Ser-Pro基序，即ERK1/2磷酸化的靶点，在小鼠StAR蛋白的成熟形式中可以检测到232和Ser277根据Expasy Prosite数据库(http://expasy.org/prosite/)，序列号232有90%的概率被磷酸化，而Ser的概率277只有5%。此外，Ser277与Ser相比相对保守232物种间（数据未显示）。序号232（标记232PS）与停靠D域（−2）相邻。为了证明Ser232通过ERK1/2是StAR的磷酸化位点，我们分析了蛋白水解产物和突变形式的StAR蛋白的磷酸化。

30 kDa磷酸-StAR已被鉴定为蛋白酶V8的底物[8]这种蛋白酶水解涉及谷氨酸残基α-羧基的肽结合。根据StAR的一级序列，该蛋白酶将产生一个约6 kDa的小肽，其中含有与Ser相对应的Ser残基232在StAR蛋白序列中。我们执行了在体外磷酸化测定描述于图5A.磷酸化后通过V8进行磷酸化-StAR蛋白水解；所得肽通过电泳和放射自显影术进行分析。在6 kDa处发现了一条独特的放射性带，它包含了预期肽的质量(图5C). 即使Ser232是该片段中唯一可能磷酸化的残基，证实了Ser232是ERK1/2磷酸化的靶点，来自于使用S232A的实验，S232A是StAR的一种突变形式，其中Ser232被改为丙氨酸，一种不可磷酸化的氨基酸。StAR的这种变异形式用于在体外用活性ERK1作为激酶进行磷酸化测定。该突变阻碍了活性ERK1对StAR的磷酸化，证实该残基确实是激酶的靶点(图5D).

StAR活动体内由于Ser的突变而减少232

研究Ser的作用232在StAR功能中，我们用两种不同的StAR突变体瞬时转染MA-10细胞。8Br-cAMP刺激30分钟可提高孕酮生成；当细胞转染StAR（S232A）的非磷酸化突变体时，增强的生产被部分阻断(图5E). 相反，类固醇生成能力部分受到Glu取代Ser的影响（S232E）(图5E). 这可能是因为Glu是一种带负电荷的氨基酸，它模拟了磷酸化-Ser中磷酸基团的负电荷。

讨论

在这项研究中，我们已经证明：a）MA-10 Leydig细胞中的类固醇生成依赖于线粒体ERK1/2激活的特定时间模式；b） ERK1/2磷酸化由线粒体PKA和细胞器中构成的MEK1/2驱动；c） 活性ERK1/2与StAR相互作用并导致其在Ser232; PKA和ERK1/2的双重磷酸化可能有利于StAR功能。

我们发现PKA激活了构成线粒体MEK1/2池，这一发现与以前的报道一致[28],[30],[31]有趣的是，当三种激酶在线粒体外膜（类固醇生成的关键部位）相互作用时，构成性线粒体PKA-磷酸化MEK1/2优先激活ERK1/2的非磷酸化线粒体池。很明显，在经典ERK1/2激活剂（如EGF）的影响下，在没有线粒体PKA激活的情况下，细胞溶质而不是线粒体MEK1/2池被激活。因此，8Br cAMP和EGF这两种刺激有利于pERK分布的场景——分别定位在线粒体和类固醇生成中，或定位在细胞核和细胞增殖中——这在质量和数量上都有很大不同。

线粒体中的pERK1/2与StAR、MEK1/2和PKA有功能性相互作用，从而形成线粒体多复合体。根据晶体学分析，描述了ERK1/2结构（CD结构域）中的酸性和疏水性斑块[46]例如，在属于MKP3（MAP激酶磷酸酶3）的肽和ERK2之间的相互作用模型中[45]，天冬氨酸316和Asp319观察到ERK2 CD结构域与Arg相互作用20和Arg21代表性MKP3肽（R20R（右）21GSNVA公司LML公司，D域），在本例中假定归因于Lys的交互作用235和Lys237StAR的（K235TK公司237长期工作负荷大规模集成电路). 基于ERK2-StAR复合体的计算机模型(图6)，我们发现Lys的ε-胺基团之间可能存在相互作用235StAR结构和天冬氨酸的羧基319在ERK2结构中，由11º隔开。与MKP3一样，部分序列中强调的疏水基序的其他相互作用有望稳定StAR与ERK对接槽的结合[45].

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ERK1/2与StAR分子相互作用的预测模型。

使用PyMOL（美国德拉诺科学公司；www.delanoscific.com). ERK2（蛋白质数据库代码2GPH）用蓝色表示，StAR（StartD4中的START域小家鼠)绿色。在该模型中，StAR位于ERK2的对接槽中。ERK2的活性中心为暗红色。ERK2的CD结构域以黄色表示，包括Asp316和Asp319与StAR的D域接触。赖氨酸174和Lys176，对应于Lys235和Lys237StAR序列的小家鼠用橙色表示，Ser171，对应于Ser232鼠StAR，深粉红色。

我们还证实ERK1/2-StAR结合在Ser232该残基整合了ERK1/2底物磷酸化的经典SP基序[47]在StAR中，SP基序与ERK1/2的结合域相邻，大大增强了激酶的磷酸化效率[48]这种情况与经典ERK1/2基板Elk-1的情况类似[49]，尽管SP位置相对于对接域是反向的。此外，易被ERK1/2磷酸化的SP基序在−1或−2位有一个Pro残基，而StAR在−3位有一个保守的Pro残基。然而，与其他底物一样，Pro之后是Leu，基序中没有酸性残基[47].

ERK1/2对StAR的磷酸化不依赖于PKA对StAR磷酸化的依赖，但需要胆固醇的存在。有人认为StAR是一种熔融的球状物，当胆固醇接近疏水表面时，它会改变羧基末端螺旋[50],[51]胆固醇被证明是变构调节剂，促进StAR与配体的进一步结合[51]在这种情况下，胆固醇对StAR的C端的位移可能会增加其对接域与ERK沟的接触。包含Lys的对接图案235在StAR序列和Asp中319在ERK序列中构成了最近的相互作用，由一段短距离（约11°）隔开(图6). 这个距离不够；那么，胆固醇和羧基末端的紊乱可能引起的构象变化将有助于Ser之间更紧密的定位232和ERK的催化位点，产生更有效的磷酸化。众所周知，在对接位点的近似值之后，激酶的构象发生了变化，导致磷酸化位点近似于催化中心[52].

关于StAR蛋白的形式在体外磷酸化，几个原因解释了30kDa蛋白的选择。首先，书目存在争议，因为没有对StAR蛋白线粒体的导入、成熟/激活和功能的完整解释。在这方面，没有确凿证据表明该活性属于两种亚型中的任何一种，即30或37 kDa。其次，在我们的下拉实验中，如上所述，ERK1与30 kDa线粒体形式的StAR蛋白特异性共沉淀，表明ERK与该亚型之间的相互作用可能发生在StAR蛋白裂解之后。因此，这些事实支持StAR的30kDa形式可能是ERK1/2的底物这一概念。然而，用全长型StAR（37kDa）的突变形式进行的转染实验表明，37或30kDa形成ERK1/2的底物，StAR在Ser232是其类固醇生成活性所必需的。

线粒体外膜中存在多蛋白复合物对类固醇生成具有功能性影响。在这个复合物中，ERK1/2对StAR的磷酸化是胆固醇转运的关键过程。众所周知，StAR与PBR协同工作，PBR又与VDAC交互。然而，人们对StAR如何与这些蛋白质相互作用知之甚少。在之前未发表的观察中，我们检测到StAR可以与VDAC相互作用。进一步分析Ser的作用将很有趣232-这种多蛋白复合物的组装及其功能中的StAR磷酸化。StAR（30kDa）分子中由于Ser磷酸化而产生的额外负电荷232可能有助于成熟形式的30kDa StAR在线粒体外膜中的保留和多蛋白复合物的形成。

材料和方法

抗体和试剂

纯化的hCG由Parlow博士（国家激素和垂体计划，国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK，NIH，Bethesda，MD，USA）慷慨提供。从Cell Signaling（美国马萨诸塞州贝弗利）获得抗磷酸ERK1/2、抗磷酸-MEK1/2、反总MEK1/2抗体和U0126；抗总ERK1/2和抗β-微管蛋白购自Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY，USA）。NADH-细胞色素c还原酶的抗-39kDa亚单位是从Molecular Probes，Inc.（尤金，俄勒冈州，美国）获得的。抗-StAR由Douglas Stocco博士（美国德克萨斯州卢伯克德克萨斯理工大学健康科学中心）慷慨提供。识别PKAα催化亚单位的抗体（美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司）是Tellez Iñón博士（阿根廷布宜诺斯艾利斯INGEBI）慷慨捐赠的。Acot2抗体是在我们的实验室产生的[53]从Stressgen（美国密歇根州安阿伯）购买了融合到GST的人类ERK1的野生型和催化非活性变体（K71A）。野生型ERK1-GST被激活在体外按照制造商的说明。成分活性的His-tagged ERK1和PD98059购自Calbiochem（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。PKA催化亚单位来自新英格兰生物实验室（美国马萨诸塞州贝弗利）。由GenScript（GenScript Corporation，Piscataway，NJ，USA）在pRc/CMVi构建物上对StAR野生型cDNA进行定点突变。针对PKAα催化亚单位的siRNA来自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯生技公司）。含有ERK2野生型或突变（H230R）变体的3×flag-CMV7-ERK2质粒由Melanie H.Cobb博士（美国德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心药理学系）提供。所有其他试剂都是可用的最高等级的商业产品。

细胞培养

MA-10细胞系是小鼠Leydig肿瘤细胞的克隆株，产生孕酮（P4）而不是睾酮作为主要类固醇[54].MA-10细胞由爱荷华大学医学院（美国爱荷华州爱荷华市）马里奥·阿斯科利博士慷慨提供，并按照最初的描述进行处理[41],[54].

细胞转染和构建

通过电穿孔或使用阳离子脂质试剂进行细胞转染。根据已经公布的程序，通过电穿孔瞬时转染MA-10细胞[41]使用空载体或包含StAR cDNA的载体（正方向或反方向）。根据之前使用的程序，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将PKA催化亚单位α亚型的siRNA并入细胞[37].

全长StAR cDNA（Gen Bank登录号BC082283号)通过PCR从MA-10细胞中获得，如Maloberti所述等。 [37]根据小鼠StAR的公开序列设计引物。用正向（5′-GGACCTTGAAAGGCTCAGAGAACACAACACC-3′）和反向（5′-GGATTAGTAGGGATCGGCACAATGATGG-3′）引物扩增1440 bp片段。该序列在真核表达质粒pRc/CMVi中进行亚克隆，pRc/CMCi是瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所Ingo Leibiger的礼物。连接提供了用于XL-1转化的正方向和反方向大肠杆菌然后，用Wizard®系统（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）进行midip制备，筛选出几个克隆，获得正、反义质粒；随后用于转染MA-10细胞。

如前所述获得重组30 kDA StAR蛋白[15]简单地说，通过PCR从MA-10细胞中获得成熟形式（30kDa）的StAR cDNA，其引物为：正向5′-GGATCGCAGGGTGGGTCAA-3′和反向5′-GGATTAGTAGGGAAGTCGGCAATGATGG-3′，扩增出1200-pb片段。然后，在pGEX-4T-3质粒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）中克隆StAR cDNA。该结构用于改造BL-21大肠杆菌，通过谷胱甘肽亲和色谱法（GST纯化模块，Amersham Biosciences，Sweden）纯化重组蛋白GST StAR，并进行凝血酶蛋白水解切割。然后，在体外用30 kDa StAR进行磷酸化实验。使用定点突变的StAR cDNA获得突变形式的StAR蛋白（S232A）也遵循相同的方案。

亚细胞分离

亚细胞分离如前所述；通过差速离心法从MA-10细胞中分离出细胞核、细胞溶质和线粒体部分[22],[34],[55]以下是该程序的详细说明。在相应的处理后，去除培养基，用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS洗涤MA-10细胞，并在800×克持续10分钟。将MA-10细胞重新悬浮在MSHE缓冲液中（219 mM D-甘露醇、70 mM蔗糖、0.02%EGTA、0,1%BSA、1.8 mM Hepes pH 7.4），并用胰岛素注射器进行60次机械破坏。然后，在5000×克持续10分钟。上清液以15000×克持续30分钟。然后，将对应于线粒体部分的颗粒清洗一次，并重新悬浮在MSHE缓冲液中，上清液对应于细胞溶质部分。对馏分进行酶分析，以评估其纯度（根据[34]). 每个组分的纯度至少为90%，数值与以前的出版物相似[56].

线粒体类固醇生成的无细胞测定

转染后，MA-10细胞进行亚细胞分离以获得线粒体。细胞器重新悬浮在10 mM苹果酸、1 mM镁中2Cl、50µM ATP、40 mMβ-醇磷脂、1 mM DTT。根据公布的程序刺激线粒体类固醇生成[22],[55]在30°C下，在没有或存在50µM胆固醇作为底物的情况下培养线粒体20分钟。在有或无1µg野生型ERK1-GST蛋白单独或与1 IU PKA催化亚基一起的情况下进行胆固醇补充。还使用了突变的非活性ERK1（K71A）。Charest描述了ERK1的K71A突变体等。 [42]一个氨基酸残基的改变消除了激酶的自磷酸化活性和髓磷脂碱性蛋白磷酸转移酶活性。虽然这种突变形式能够被MEK1/2磷酸化至其非突变形式达到的约80%水平，但结果是髓磷脂碱性蛋白磷酸转移酶活性的部分激活（20%）。在指定的培养后，通过放射免疫分析法测定培养基中P4的产生[41]用SDS-PAGE和Western blot分析线粒体蛋白含量。

下拉分析

为了研究StAR蛋白和pERK之间的相互作用，如Hirakawa和Ascoli所示进行了下拉试验[28]简单地说，细胞溶质或线粒体组分（分别为500µg或300µg）在与琼脂糖珠偶联的人类重组ERK1-GST存在下培养，琼脂糖小球先前按照制造商的说明激活。孵育在下拉缓冲液中进行；50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，10%甘油，0.5%Nonide P-40，1 mMMgCl2在4°C下隔夜补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。然后，将琼脂糖蛋白颗粒（复合物）中包含的与ERK1-GST结合的蛋白用相同的缓冲液洗涤三次，煮沸5分钟，进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

体外重组StAR的磷酸化

用野生型His标记的ERK1或ERK1-GST（K71A）和PKA催化亚单位的催化失活形式进行野生型或S232A-StAR的磷酸化分析。使用10µCi的[γ-32P] 如前所述，在30°C下ATP持续30分钟[49],[57].

SDS-PAGE和免疫印迹分析

蛋白质通过SDS-PAGE分离，并如前所述电转移到聚二氟乙烯（PDVF）膜上[58]使用图图例中描述的特定抗体进行免疫检测。在60℃下，用剥离缓冲液（62.5 mM Tris，pH 6.8，100 mM 2-巯基乙醇和2%SDS）处理印迹30分钟后，在同一膜中依次使用识别pERK和总ERK的抗体。同样的声明对pMEK和总MEK识别有效。在评估pMEK1/2含量的western blot中，总MEK1/2和其他蛋白质被用作负荷控制：如前所述，用于8Br-cAMP处理的线粒体酰基-CoA硫酯酶[41]用于EGF治疗的NADH-细胞色素c还原酶（复合物I）的线粒体39 kDa亚单位，以及两种情况下的细胞溶质β-微管蛋白。在ECL化学发光检测系统（美国新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech）和X射线胶片曝光后，使用辣根过氧化物酶偶联二级抗体对蛋白质进行可视化。对于定量分析，使用Storm Phosphor成像仪扫描仪（瑞典Amersham Biosciences）进行密度测定，并使用ImageQuant 5.2软件分析波段强度。

免疫荧光分析

MA-10细胞在聚-L-赖氨酸玻璃盖玻片上生长至约80%汇合。处理后，将细胞在36.5°C下与300 nM Mitotracker Red®（Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA）（一种特殊的线粒体染料）孵育45分钟。然后，室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定10分钟，并在室温下用封闭溶液（0.3%Triton X-100和PBS中的1%BSA）渗透60分钟。详细程序如前所述[59]细胞与抗pERK1/2 cy2-结合抗体（1∶250）在4℃孵育过夜。用PBS多次洗涤后，在室温下用山羊抗兔抗体（1:400）培养细胞1小时。使用Fluorsave防褪色试剂（Calbiochem）将盖玻片安装到载玻片上，然后使用尼康C1显微镜（IByME，UBA，阿根廷）进行共焦分析。

统计分析

数据采用方差分析法进行分析，然后进行Dunnet检验。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：国家研究委员会（CONICET）布宜诺斯艾利斯大学（UBA）国家科学技术促进局（ANPCyT）Sigma Xi，科学研究学会

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃