剪切应力诱导的内皮细胞极化由Rho和Rac介导，而不是Cdc42或PI 3-激酶介导

Rho、Rac和Cdc42活性的变化伴随剪切应力诱导的肌动蛋白细胞骨架重塑

为了研究Rho、Rac和Cdc42在剪切应力反应中的参与，我们首先测量了内皮细胞适应剪切应力期间它们的活性。RhoA活性在暴露于剪切应力后5分钟增加了三倍，然后在接下来的10分钟内急剧下降到控制水平以下(图2).在剪切应力刺激后2 h，RhoA活性逐渐增加至基础水平的1.6倍(图2)4小时后恢复到基础水平（未描述）。5分钟时RhoA活性的快速增加与许多应力纤维的形成有关(图1B） 刺激后15–30分钟活动的减少与应激纤维的丢失和细胞圆形化有关(图1、C、G和H). 2h时RhoA活性的小幅度增加与大多数细胞在剪切应力方向重新排列的阶段相对应。

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图2。

剪切应力对Rho、Rac和Cdc42活性的调节。HUVEC在指定的时间内受到剪切应力。RhoA、Rac1和Cdc42的GTP负载测定如材料和方法中所述进行。左侧的面板显示在刺激期间RhoA、Rac1和Cdc42活性增加了两倍，并计算为GTP-结合蛋白相对于全细胞裂解物的数量。右侧显示了GTP-结合蛋白和总细胞裂解物的相应代表性蛋白质印迹示例。数值为四到五个独立实验的平均值±SD。*，P≤0.05；**，P≤0.01，与静态对照比较，t吨测试。

Rac1和Cdc42以类似的时间进程被激活。在剪切应力刺激后5-30分钟，其活性增加，15分钟时达到峰值(图2). Rac1和Cdc42的激活与细胞扩张和伸长的开始相一致，在RhoA活性最低时达到峰值。

Rac1通常控制膜皱褶和跛足的形成，而Cdc42控制丝状伪足的形成(雷德利，2001a). 与静态对照组相比，在剪切应力作用下5-30分钟，我们没有观察到丝状伪足或跛足的形成增加(图1). 静态HUVEC在剪切应力前有跛足，但如上所述，细胞收缩后，跛足主要位于细胞的下游侧（参见图1F和图4A） ●●●●。在任何条件下均未观察到丝状伪足；事实上，将组成活性Cdc42（V12Cdc42）引入HUVEC会导致极少数丝状伪足的形成，随后是应力纤维和细胞收缩(Wojciak-Stothard等人，1998年)。

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图4。

抑制剂对剪切诱导的肌动蛋白细胞骨架重塑的影响。细胞未经处理（A）或感染腺病毒以表达β-gal（B）、N17Cdc42（C）、N17%Rac1（D）或N19RhoA（E），然后用剪切应力刺激2小时。或者，在剪切应力暴露4小时之前和期间，用5μM Y-27632（F）、10μM ML-7（G）或10μM LY294002（h）处理细胞。剪切方向用箭头（B）表示。箭头（A）指向下游部分形成的跛足。对细胞进行F-actin（红色）和抗c-myc 9E10抗体（绿色）染色，以显示标记了N19RhoA、N17Rac1和N17Cdc42（B–D）的myc表位。棒材，20μm。

应力纤维的形成和细胞圆形依赖于RhoA和Rho激酶，而复吸则需要Rac1和Cdc42

为了研究RhoA、Rac1和Cdc42对剪切应力诱导的形态学变化的影响，使用腺病毒在内皮细胞中表达这些蛋白的显性阴性突变体。作为腺病毒感染的对照，细胞被表达β-半乳糖苷酶（β-gal；Wojciak-Stothard等人，2001年). 此外，通过添加这些酶的小分子抑制剂来研究PI3K、Rho激酶和MLCK的作用。

在无剪切应力的对照细胞（静态培养）中，N19RhoA抑制RhoA，Y-27632抑制Rho激酶促进细胞扩散(图3A） ●●●●。相反，N17Rac1显著降低细胞扩散面积（P<0.05），而N17Cdc42和LY294002对细胞扩散面积没有显著影响(图3A） ●●●●。Y-27632略微降低了静态培养中的细胞伸长，但任何其他抑制剂都没有显著改变(图3B） ●●●●。尽管腺病毒感染表达的N17Cdc42对分流后内皮细胞的形状没有显著影响，但该蛋白是活性的，因为如前所述，它抑制了内皮细胞融合培养物中凝血酶诱导的收缩性(Wojciak-Stothard等人，2001年)。

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图3。

RhoA、Rac1、Cdc42和抑制剂对剪切应力诱导的细胞扩散、伸长和排列变化的影响。用剪切应力刺激HUVEC 30分钟（A）或4小时（B和C）。刺激后，固定细胞并对其进行F-肌动蛋白染色，并使用ImageProPlus软件计算细胞铺展（A）、延伸（B）或排列（C）参数。这些细胞未经治疗（对照组）或感染了编码Rho GTPases显性阴性突变体的腺病毒，然后在感染后16 h受到剪切应力。myc标记的N19RhoA、N17Rac1和N17Cdc42的表达水平如D所示。或者，在剪切应力刺激前30分钟应用抑制剂Y-27632、ML-7和LY294002（LY）。单元对齐显示为剪切应力方向10°内对齐的单元百分比。在A–C中，黑色条代表剪切应力下的单元，条纹条代表静态条件下的单元。*，P≤0.05；**，P≤0.01，t吨测试，与静态控制进行比较。

剪切应力刺激5–30分钟后，细胞变圆，导致细胞扩散面积和延伸率降低(图1，G和H). N19RhoA和Y-27632抑制剪切诱导的细胞收缩，而N17Rac1、N17Cdc42、PI3K抑制剂LY294002和沃特曼宁则无作用(图3A和未描述）。ML-7是MLCK的抑制剂，也降低了早期剪切诱导的细胞收缩力，但程度低于N19RhoA和Y-27632(图3A） ●●●●。与静态培养中的未处理细胞相比，在剪切应力刺激后4 h，未处理细胞的伸长率显著增加。然而，RhoA（P=0.045）、Rac1（P<0.01）、Cdc42和Y-27632（P<0.05）的显性阴性突变体阻止了剪切诱导的细胞伸长，而LY294002（P>0.05；图3B） ●●●●。在这些实验中，细胞在刺激前17-22小时被表达显性阴性突变体的腺病毒感染。经过较长时间后，随着显性负性蛋白积累到较高水平，对照组和表达Rho GTPases显性负性突变体的细胞之间的差异变得更大。与未经处理的对照组相比，表达N17Rac1或N17Cdc42的细胞在剪切应力和静态条件下的扩散面积和延伸率进一步降低，而表达N19RhoA的细胞开始生长出长的富含微管的延伸（未公布的数据）。

剪切应力方向上的细胞排列取决于RhoA和Rac1

剪切应力诱导未感染细胞和表达β-半乳糖的细胞在剪切应力2-4小时内肌动蛋白应力纤维沿流动方向排列(图4A、 控制，如2小时所示）。此外，大多数排列的细胞在细胞下游部分产生富含F-actin的跛足(图4A、 箭头）。正如预期的那样，表达N19RhoA的细胞仅显示少数主要是皮质的未对齐应力纤维，但仍有跛足(图4E） ●●●●。类似地，Rho激酶抑制剂Y-27632抑制应激纤维的形成(图4F） ，并似乎增强了膜皱褶，这与Tsuji等人（2002年）MLCK抑制剂ML-7不能完全抑制应力纤维的形成(图4G） 这表明剪切应力期间MLC磷酸化的主要输入是通过Rho激酶而不是MLCK。Rho激酶通过抑制MLC磷酸酶增加MLC磷酸化(van Nieuw Amerongen和van Hinsbergh，2001年)或直接磷酸化MLC(Kaibuchi，1999年；Amano等人，2000年). 此外，Rho激酶可以通过磷酸化LIM激酶来调节肌动蛋白细胞骨架(Maekawa等人，1999年)，内收蛋白(Kimura等人，1998年)和Na-H交换器(Tominaga等人，1998年)与ML-7相比，这些也有助于Y-27632更显著的作用。

N17Cdc42未影响应力纤维水平或改变剪切应力诱导的应力纤维排列(图4C） ●●●●。相反，表达N17Rac1的细胞缺乏应激纤维和跛足(图4D） 与之前的观察结果一致，N17Rac1抑制凝血酶和TNF刺激的HUVEC中的应力纤维组装(Wojciak-Stothard等人，1998年,2001；Kiosses等人，1999年). PI3K抑制剂LY294002(图4G） 和沃特曼（未描述）对细胞排列、应力纤维或膜皱褶没有显著影响，这表明PI3K在剪切应力反应中不作用于Rac上游，与生长因子诱导的Rac活化不同(雷德利，2001b)。

除了分析应力纤维排列，我们还测量了细胞取向对剪切应力的响应。在2小时时，大多数细胞的长轴朝向流动方向(图3C、 剪切）。N19RhoA、Y-27632和N17Rac1抑制了剪切应力诱导的细胞排列，但N17Cdc42或LY294002不抑制，这与应力纤维排列的影响一致(图3C和图4). 与Y-27632一样，ML-7也抑制了细胞排列，尽管它并没有完全消除应力纤维的形成(图4G） ●●●●。这些结果表明，肌动球蛋白的收缩性在剪切诱导的内皮细胞极化中起着重要作用。Y-27632和ML-7都是肌动球蛋白收缩力的抑制剂，但已被证明影响人类成纤维细胞中不同亚群的应激纤维(Katoh等人，2001年)在MLC磷酸化的空间调控中发挥着不同的作用(Totsukawa等人，2000年)。

组成性激活的RhoA、Rac1和Cdc42对肌动蛋白组织和剪切应力诱导的排列的影响与Rho和Rac一致，但与Cdc42不一致，这有助于剪切应力诱发的细胞定向。组分活化的L63RhoA诱导应力纤维的形成并阻止细胞排列(图5A） 与之前牛主动脉内皮细胞的观察结果一致(Tzima等人，2001年). L61Rac1还抑制HUVEC排列并诱导跛足的形成(图5B） 与牛主动脉内皮细胞的结果相似(Tzima等人，2002年). 相反，L61Cdc42对细胞排列没有显著影响(图3C和图5C） 或伸长率（未描述），这与N17Cdc42对这些响应没有影响一致。

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图5。

组成性激活的RhoA、Rac1和Cdc42对剪切应力下细胞排列的影响。用编码GFP-L63RhoA（A）、GFP-L61Rac1（B）或GFP-L61 Cdc42（C）的表达载体转染HUVEC。18 h后，细胞暴露于剪切应力4 h。表达GFP标记蛋白的细胞呈绿色，并用箭头表示；肌动蛋白染色呈红色。剪切方向用箭头指示。棒材，20μm。

N17Rac1、N17Cdc42和PI3K抑制剂降低细胞迁移速度

在静态培养中，HUVEC以48.36±7μm/h的平均速度随机迁移(n个= 120). 表达N17Rac1和N17DC42的细胞的移动速度明显慢于对照细胞(图6A） ，而表达N19RhoA或用Y-27632处理的细胞没有显示出细胞速度的降低。LY294002和ML-7也降低了细胞速度(图6A） ●●●●。

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图6。

Rho信号通路对细胞迁移速度的调节。在静态条件（A）或剪切应力（B）下培养的HUVEC通过时间扫描视频显微镜监测5小时。在实验前30分钟添加ML-7、LY294002（LY）和Y-27632，或者在实验前16小时将细胞感染表达N19RhoA、N17Rac1和N17Cdc42的腺病毒。使用动力学成像软件跟踪细胞，并使用Mathematica软件对轨迹进行统计分析（参见材料和方法）。*，P≤0.05；**，P≤0.01，与对照组比较，t吨测试。

当暴露于剪切应力时，细胞优先在剪切应力方向和流动方向迁移，而在任何其他方向的迁移都大大减少(图6B） ●●●●。细胞迁移速度为24±7μm/h，明显低于静态培养。与无剪切应力的细胞相似，N17Cdc42、N17Rac1、LY294002和ML-7降低了流动条件下的细胞速度，而N19RhoA和Y-27632没有显著改变迁移速度(图6B） ●●●●。ML-7（而非Y-27632或N19RhoA）引起的速度下降可能是ML-7对跛足形成的抑制作用的结果(图4G） ●●●●。在成纤维细胞中，ML-7也被证明抑制皱褶，诱导细胞圆形，并抑制外周应力纤维的形成，而Y-27632不影响跛足的形成或减少细胞扩散(Katoh等人，2001年)。

剪切应力诱导的细胞迁移方向需要RhoA和Rac1，但不需要Cdc42

如上所述(图6)在没有剪切应力的情况下，稀疏培养物中的内皮细胞随机移动，而剪切应力下的细胞主要在流动方向上迁移(图7，A–D）。在趋化过程中，方向性依赖于Cdc42和PI3K(Wang等人，2002年). 相反，N17Cdc42或LY294002/wortmannin对剪切应力引起的定向迁移不产生影响(图7E） ●●●●。相反，表达N17Rac1或N19RhoA的细胞，或用Y-27632或ML-7处理的细胞，细胞运动的方向被取消(图7E） 与它们对剪切应力诱导的细胞排列的影响相关。

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图7。

显性负RhoA、Rac1、Cdc42和抑制剂对细胞迁移方向的影响。在静态条件（a和C）或剪切应力（B和D）下显示12小时实验期间的细胞轨迹。每个单元轨迹的起点绘制在X轴和Y轴（C和D）的交点处。圆形直方图（E和F）显示了细胞迁移到20个相等片段中每个片段的比例，当每个细胞从其起点迁移50μm时进行测量。迁移<50μm的细胞不包括在本分析中。箭头表示该值显著的细胞群平均方向（P值表示显著），绿色阴影区域表示使用瑞利检验计算的统计显著性95%置信区间。在所有情况下，剪切应力的方向都朝向直方图的底部（B，箭头）。针对每种情况，分析了三个独立实验中的90个细胞。

假设Cdc42是各种细胞类型中细胞定向所必需的(Etienne-Manneville和Hall，2003年)，我们想确定Cdc42是否有助于内皮细胞的定向传感，或者它对剪切应力诱导的细胞重新定向是否不重要。因此，我们进行了体外伤口愈合试验，类似于用于显示Cdc42在成纤维细胞定向和向伤口迁移方面的需求(Nobes和Hall，1999年). 有趣的是，N17Cdc42并不影响内皮细胞向伤口中心移动的方向性(图7F） 表明Cdc42不参与调节内皮细胞运动的方向性。然而，在剪切应力条件下，N17Cdc42将细胞移动的总速度降低到伤口愈合分析中控制值的69±3%。

Rho是剪切诱导内皮细胞形状和运动重塑的关键调节因子

为了向流动方向迁移，随机定向的细胞必须改变其极性。要做到这一点，细胞可以在迁移过程中发生翻转。然而，我们的结果表明，剪切应力诱导的细胞重新定向首先是通过Rho介导的早期细胞收缩实现的，导致细胞去极化，然后是通过新的跛足向流动方向延伸。这种用于重新定向细胞的两阶段机制可能比转向相对缓慢移动的细胞更有效。施加剪切应力后，RhoA的激活是非常短暂的，10分钟后恢复到对照水平。这可以解释为什么在之前关于剪切应力诱导的融合牛主动脉内皮细胞中RhoA活性变化的论文中没有观察到RhoA的激活(Tzima等人，2001年). 此外，更高水平的剪切应力被用于Tzima等人（2001年），这可能会影响RhoA活动变化的时间。

Rho诱导细胞收缩的早期需求可以解释为什么抑制Rho也会阻止随后的细胞沿流动方向排列。然而，尽管RhoA活性在初始峰值后迅速下降，但随着时间的推移逐渐增加，这与RhoA在剪切应力传感中发挥长期作用是一致的。事实上，众所周知，Rho对于感知机械应力很重要(Geiger和Bershadsky，2001年)因此，Rho可能参与了细胞后部剪切应力的传感和/或信号传递。有趣的是，尽管Rho是剪切应力诱导的细胞极化所必需的，但它并不影响迁移速度，事实上，它对细胞位移具有负调节作用。RhoA/Rho激酶对细胞迁移速度的贡献取决于细胞类型和条件。细胞迁移模型表明，RhoA和Rho激酶通过增加细胞体收缩力和刺激尾部脱落发挥作用(Cox和Huttenlocher，1998年,雷德利，2001a). 中性粒细胞和单核细胞中RhoA/Rho激酶的抑制会抑制尾部脱落，从而抑制内皮细胞的迁移(Alblas等人，2001年；Worthylake等人，2001年). 同样，我们观察到Y-27632减少了尾部脱落（未公开的数据），但这并不影响内皮细胞的迁移速度，可能是因为尾部脱落不是内皮细胞迁移的速率控制步骤。另一方面，抑制RhoA/Rho激酶可以促进其他细胞类型的细胞运动(Sahai等人，2001年；Chang等人，2002年；Chen等人，2002年). 实际上，Rho信号通路和其他调节细胞迁移的途径之间的平衡可能决定了抑制Rho/Rho激酶对细胞迁移的影响程度。

与Y-27632相比，MLCK抑制剂ML-7降低了跛足延伸、细胞扩散和细胞移动速度。因此，与Rho/Rho激酶相比，其作用更类似于抑制Rac，可能反映了肌球蛋白IIb在跛足前突中的已知作用(Diefenbach等人，2002年). 同样，Katoh等人（2001年）已经表明，在成纤维细胞中，ML-7减少细胞皱褶，抑制外周应力纤维的形成，并减少细胞扩散，而Y-27632抑制中心应力纤维形成，但不影响皱褶或细胞扩散。此外，MLCK和Rho激酶在MLC磷酸化的空间调节中发挥着不同的作用：Rho蛋白激酶促进细胞中心的MLC磷酸化而MLCK调节细胞外围的MLC磷酸化(Totsukawa等人，2000年). 这种差异也可能导致Y-27632和ML-7对内皮细胞对剪切应力的反应产生不同的影响。

Rac和Cdc42在内皮细胞极化和迁移中的作用

当RhoA活性最低时，Rac1和Cdc42的峰值剪切应力诱导激活为～15分钟。此时，细胞开始极化，在流动方向上产生跛足状突起。Rac1活性的总体增加很小，但这可能是因为Rac1主要只在细胞的前缘被激活(Kraynov等人，2000年；Tzima等人，2002年)。

鉴于对其他细胞类型的定向迁移的观察，我们观察到内皮细胞排列和流动方向上的运动不需要Cdc42，这是出乎意料的，因为Cdc42是维持细胞定向所必需的(Allen等人，1998年；Nobes and Hall，1999年；艾蒂安·曼尼维尔和霍尔，2001年). 有趣的是，我们发现在伤口愈合试验中，与成纤维细胞和星形胶质细胞相比，内皮细胞定向迁移到伤口中也不需要Cdc42(Nobes and Hall，1999年；艾蒂安·曼尼维尔和霍尔，2001年). 可能是在内皮细胞中，Cdc42与PAR6–PAR3–aPKC复合物没有分子联系，PAR6-PAR3-aPKC复合体参与在多种细胞系统中产生细胞极性(Etienne-Manneville和Hall，2003年). 在这方面，有趣的是，Rac下游的内皮细胞信号传导与成纤维细胞也不同。例如，Rac的下游靶点p21-活化激酶PAK1促进应激纤维的形成并抑制内皮细胞的迁移(Kiosses等人，1999年)而在成纤维细胞中，它会导致应力纤维的丢失并刺激迁移(Kiosses等人，1999年；Sells等人，1999年). Cdc42通过影响聚合肌动蛋白在前沿的组织结构（通过WASP家族蛋白；Cory和Ridley，2002年)和/或通过对PAK的影响影响局部粘附周转(Bagrodia和Cerione，1999年)。

剪切应力形态反应中的PI3Ks

已知PI3K被剪切应力激活，参与NO生成和c-Jun NH₂-末端激酶激活(Go等人，2001年)，但它们在剪切应力的形态响应中的作用以前还没有研究过。我们的结果表明，wortmannin/LY294002敏感的PI3K不需要剪切诱导的细胞极性变化，但有助于细胞迁移速度。PI3K有助于多种细胞类型的细胞迁移(Sotsios和Ward，2000年；坎特利，2002年)，但只有少数研究讨论了它们在细胞极化中的作用(Weiner等人，2002年). 例如，在粘液菌和中性粒细胞，PI3K对迁移速度和维持方向性都是必需的(Wang等人，2002年；Weiner等人，2002年)而我们在此报告PI3K对迁移速度有贡献，但对方向性没有贡献。它们可以促进细胞迁移，至少部分是通过作用于Rac的上游(韦纳，2002)但在内皮细胞的剪切应力反应中，抑制PI3K并不影响细胞伸长，而抑制Rac则影响细胞伸长。这表明并非所有Rac依赖性反应都需要激活PI3K。同样，fMLP刺激的中性粒细胞中Rac激活不需要PI3K(Geijsen等人，1999年)。

细胞培养、腺病毒感染、转染和抑制剂的使用

HUVECs购自Biowhittaker，并在装有10μg/ml人纤连蛋白的烧瓶中在补充有2%FCS的EGM-2培养基（Biowhittaker）中培养。在实验中，在两到四个传代之间使用细胞。

HUVEC的电镀密度为2×10⁴9厘米每毫升细胞数²Nunc滑盖烧瓶（Life Technologies）或涂有10μg/ml人纤维连接蛋白的玻璃盖玻片。细胞在静态培养中用于细胞运动分析和细胞形状分析，或在平行板系统中置于剪切应力下。腺病毒基因转移用于在HUVEC中表达显性阴性RhoA、Rac1和Cdc42蛋白(Wojciak-Stothard等人，2001年). 感染后16-18小时进行实验。GFP标记的组成活性形式的Rho蛋白L61Rac1、L61Cdc42和L63RhoA，使用Nucleofector（Amaxa）和核转染试剂盒（Biowittaker）转染到HUVEC。转染后16-18小时，将细胞用于实验。

在剪切应力刺激前30分钟，向细胞中添加Rho激酶抑制剂Y-27632（5μM）、MLCK抑制剂ML-7（10μM）或PI3K抑制剂沃特曼（0.1μM）和LY294002（10μM）。通过滴定确定ML-7的浓度，它是5h内对细胞形态有影响的最低浓度。在较高浓度（20–40μM）下，ML-7在流动条件下会导致应力纤维的快速损失和细胞分离。为Y-27632选择的浓度基于先前的实验(Wojciak-Stothard等人，2001年)LY294002和沃特曼在内皮细胞中的浓度基于已发表的报告(Nakashio等人，2002年)。

剪切应力

在含有5%CO的封闭循环系统中，使用串联的平行板流室对电池施加层流剪切应力，时间从5分钟到24小时不等₂37°C时。平行板流动室是在葛兰素威康定制的，介质的循环是由蠕动泵（Masterflex）产生的，该泵经过校准，可产生3 dyn/cm的剪切应力².腔室按照前面所述进行组装(休斯顿等人，1999年). 为实验选择的剪应力水平与静脉血管中剪应力的生理水平相对应(Morawietz等人，2000年). 对未经受剪切应力的细胞进行静态控制。墙剪切应力Tw，表示为（dyn/cm²)，使用标准方程式T计算_w个=3年Q/2a²b条(休斯顿等人，1999年)式中，y是37°C时的粘度（Poise），Q是体积流量（ml/s），a是半通道高度（cm），b是通道宽度（cm）。

Rho、Rac和Cdc42下拉分析

细胞生长在纤维粘连蛋白覆盖的80cm上²在剪切应力刺激之前，将玻璃板进行亚融合，并在含有2%FCS的生长因子缺乏培养基中培养16–18小时。将玻璃板插入流动室，细胞受到3 dyn/cm的剪切应力²刺激后5–120min，用1ml裂解缓冲液/板在1×裂解缓冲液中在冰上裂解细胞30s，并测量RhoA、Rac1和Cdc42的GTP负荷。如前所述，用结合谷胱甘肽珠的重组GST-RBD（Amersham Biosciences）测定RhoA活性(Ren和Schwartz，2000年)，每个样品使用100μg GST-RBD。使用Rac活化分析试剂盒（Upstate Biotechnology）测定Rac1的GTP负荷，并向每个样品中添加10μg PAK1 PBD。使用20μg GST-WASP-PBD/样品测量Cdc42的活性。GST-WASP-PBD是C.Wells博士（英国伦敦路德维希癌症研究所）赠送的礼物。亲和沉淀RhoA、Rac1和Cdc42蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行检测。Upstate Biotechnology（批号21956，Rac活化分析试剂盒）提供了Rac下拉分析的详细方案以及Rac和Cdc42下拉分析中使用的裂解/洗涤缓冲液的制备。

F-actin的免疫荧光和定位

为了可视化F-actin和myc标记蛋白的分布，HUVEC在室温下用4%甲醛溶解在PBS中固定10分钟，并用0.2%Triton X-100渗透6分钟。细胞在PBS中0.5%BSA中孵育45分钟以阻断非特异性抗体结合，然后与小鼠单克隆9E10抗c-myc抗体（1:200）孵育。细胞与荧光标记的山羊抗鼠抗体和1μg/ml TRITC-球蛋白孵育1h。标本安装在Moviol（源）中。通过共焦激光扫描显微镜（型号61 LSM 510；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）获得细胞的单平面图像。

细胞形态和迁移分析

为了分析细胞扩散面积、延伸率和方向，使用Image Pro Plus（源）分析共焦显微镜获得的数字化图像。细胞方向（对齐）是细胞长轴和所选方向之间的角度。在Image Pro Plus中分析细胞形状时，使用垂直线作为参考方向。细胞伸长的计算方法如下所述邓恩和布朗（1986）是细胞长轴与细胞最短轴的比例。数据以平均值±SD表示。未配对t吨测试用于比较各组之间的差异。统计学意义被接受，P＜0.05。

为了分析细胞迁移，在5–24小时内，通过视频显微镜以10分钟的时间间隔对细胞进行数字记录。如前所述，使用软件（Kinetic Imaging Ltd.）跟踪细胞，并使用Mathematica软件（Wolfram Research Inc.）对轨迹进行统计分析(Allen等人，1998年). 通过计算每次实验中5小时内从起点迁移50μm或以上的细胞总数百分比来评估细胞位移。为了可视化细胞在剪切应力作用下运动的方向性，使用方向数据的统计分析并显示为方向图(Zicha等人，1997年). 简而言之，每个轨迹都被转换为一个角度，表示从轨迹起点到其首次穿过设置为50μm的虚拟地平线的点之间的方向。这些数据汇总在一个方向图中，该方向图是一个圆形直方图，显示每个20°间隔内的细胞方向数。对数据进行了方向单模态聚类的瑞利检验，并选择P<0.01作为拒绝随机方向性零假设的标准(Allen等人，1998年). 如果存在显著的单模态聚类，则计算平均方向及其95%置信区间。

我们特别感谢M.Braddock博士（Glaxo Welcome，Stevenage，UK）在剪切应力设备方面的帮助；M.Schwartz博士提供pGEX2T GST RBD；D.Sacks博士提供pGEX2T-GST-Wasp-PBD；Dr.C.Wells净化GST-WASp-PBD；N.Hotchin博士负责提供GFP标记的结构体L61Rac1、L61Cdc42和L63RhoA；D.Cutler博士（伦敦大学学院分子细胞生物学实验室，英国伦敦）使用核载体；和A.Entwisle博士寻求共焦显微镜的帮助。

这项工作得到了英国心脏基金会（FS/99021）和路德维希癌症研究所（Ludwig Institute for Cancer Research）的支持。