Nap1和Gin4激酶对有丝分裂事件的控制

诱变和筛选

如前所述，使用菌株DK166进行硫酸乙甲烷诱变(劳伦斯，1991年). 诱变后，将细胞以每100 mm平板2000个菌落的密度接种在YPD培养基上，并在30°C下生长2天，然后用解剖显微镜筛选菌落。

GIN4基因的克隆与缺失

为了证明GIN4公司只有基因才能拯救细胞外基质1突变表型，我们用PCR扩增和克隆GIN4公司基因导入YCplac111以创建pRA1（寡核苷酸：GCGCAAGCTTGGAGTTATTCATCCGCT和CGCGGTACCCTGTACATAATTTATGTTTA）。为了进一步确认GIN4公司是拯救基因，我们删除了BamH1位点上游的所有序列，在起始ATG下游发现120个碱基GIN4公司pRA1中的编码区。

生成对的删除GIN4公司酵母基因组中的基因GIN4公司通过PCR扩增该基因，并将其克隆到bluescript克隆载体（寡核苷酸：GCGCAAGCTTGGAGTTATTCATTCCCGCT和CGCGGTACCCTTTACATTATTTATGTTTA）的KpnI和HindIII位点。然后将该载体用作第二个PCR反应的模板，该PCR反应扩增出与GIN4公司每端的基因（寡核苷酸：GCGCGCGGGCCCCAATGAATTGGCGTAAACAGAA和GCGCGCCCTAGGTTATTTGCTGCGAATCT）。携带LEU2级然后将该基因连接到PCR产物中，以产生携带LEU2级基因两侧有与5′端和3′端同源的序列GIN4公司基因（pRA5）。一个线性碎片携带被破坏的GIN4公司基因被转化为酵母GIN4公司该基因通过PCR和用识别COOH末端的抗体进行免疫印迹证实。

产生识别Gin4的抗体

识别Gin4的抗体是用从细菌中纯化为6X-组氨酸融合蛋白的Gin4 COOH末端片段免疫兔子获得的。通过PCR扩增COOH末端片段，并将其克隆到载体pQE10中（QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA；PCR引物：GCGGGATCACGTCGAACGATAGAGAGATT和GCGCAAGCTTCTATTTTGTAGAACCTT）。如前所述，使用Gin4融合蛋白从血清中亲和纯化抗体(凯洛格和阿尔伯茨，1992年). 抗体不识别来自携带缺失的菌株的提取物中的任何蛋白质GIN4公司基因。

细胞周期阻滞和免疫荧光方法

对于所有实验酒吧1用20μg/mlα因子阻止，而巴1 ⁻用1μg/mlα-因子阻遏菌株。除图中所示的实验外，通常在室温下使用α因子进行3–3.5小时的制动。​图3，三，在30°C下进行5小时。如前所述，通过在室温下在30μg/ml苯诺明中培养3小时，细胞在有丝分裂中被阻止(Li和Murray，1991年). 有丝分裂纺锤体染色如前所述进行(Pringle等人，1991年).

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图3

删除GIN4公司该基因在依赖Clb2生存的细胞中引起长时间的有丝分裂阻滞。细胞在30°C下培养过夜，直至其外径达到0.5（对照细胞）或0.8(Δgin4,Δclb^1,3,4,Δbar1细胞），然后在t=0时将α因子添加到2μg/ml。如前所述，在每个时间点，取出1.5 ml培养物并分析Clb2水平或有丝分裂纺锤体的存在(Kellogg和Murray，1995年;Pringle等人，1991年). 本实验中使用的菌株含有棒1基因阻止他们突破α-因子阻滞。(A类)有丝分裂纺锤体细胞百分比随时间变化的曲线图，在对数期培养中加入α-因子后Δgin4,Δclb^1,3,4,Δbar1应变和aΔclb^1,3,4,Δ巴1控制应变。有丝分裂纺锤体的细胞百分比是通过计算细胞随机区域中的纺锤体来确定的。每个数据点统计了200多个细胞。3小时后，纺锤体开始出现异常厚和弯曲，很难准确计数有纺锤体的细胞数量。(B类)Western blot显示，在将α因子添加到同一菌株的对数期培养物中后，Clb2的数量随时间变化答：。(C类)观察到的短主轴示例Δgin4,Δclb^1,3,4,Δbar1在对数相培养基中加入α-因子后2h，产生菌株。

Nap1-结合蛋白的亲和纯化

我们使用与纯化细胞周期蛋白结合蛋白基本相同的方案亲和纯化Nap1结合蛋白(Kellogg等人，1995年 一). 简单地说，Nap1是从大肠杆菌作为谷胱甘肽-S转移酶融合物，然后与Affigel 10珠（加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad实验室）偶联，形成亲和柱矩阵。提取液由提取缓冲液（50 mM K）中7.5 g对数相JB811蛋白酶缺乏细胞制成⁺-肝素，pH 7.6，275 mM KCl，1 mM MgCl₂1 mM EGTA、0.15%吐温-20、1 mM PMSF、1 mM-亮氨酸蛋白酶、1 mM/凝乳抑素、1 mM.胃蛋白酶抑素和1 mM DTT）。用研钵和杵在液氮下广泛研磨，将细胞破碎。粗提取物在20000下离心克10分钟，然后是100000克90分钟。第一次旋转的上清液被标记为“LS上清液“在图中。​图5，5第二次旋转的上清液被标记为“HS上清液”. 最后的上清液首先通过一个由BSA与Affigel 10耦合而成的5-ml预柱过滤器，从预柱流出的液体直接加载到含有6mg Nap1的2-ml亲和柱上。加载后，用含有10%甘油、0.05%吐温-20且不含PMSF的30ml提取缓冲液清洗色谱柱。用0.3 M至1.0 M KCl的盐梯度洗脱色谱柱。梯度是通过用移液管将400-μl小份洗脱缓冲液移到色谱柱顶部来实现的，每一小份KCl浓度增加50 mM。在洗脱过程中，收集400-μl部分。通过TCA沉淀浓缩组分，再悬浮在1×蛋白质凝胶样品缓冲液中，并将每个组分的1/10装载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每一条线上。

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图5

Nap1-结合蛋白的亲和纯化。(A类)将对数期酵母细胞的粗提取物加载到Nap1亲和柱上。用缓冲液洗涤后，用KCl梯度洗脱柱，用TCA沉淀每个馏分的样品，并将其装载到12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。盐梯度开始前的前几个部分显示洗涤液的最后部分。凝胶被考马斯蓝染色。(B类)中显示的相同分数A类将其装载到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上并转移到硝化纤维素上，然后用抗Gin4抗体对其进行探测。对于亲和柱洗脱部分，我们将1/10的蛋白质装入凝胶中，如图所示答：。

Gin4和Nap1的免疫共沉淀

用于沉淀Gin4的免疫亲和珠是通过将抗Gin4抗体交联到如前所述的蛋白A珠来制备的，每毫升蛋白A珠使用1μg亲和纯化抗体(Kellogg等人，1995年 b条). 将菌株DK186和RA4的1.5升培养物培养至外径为0.7，将细胞造粒并在液氮上冷冻。然后，如前所述，在液氮下进行广泛研磨，使电池破裂(Kellogg等人，1995年 一)，并将约0.3g等分的冷冻细胞粉储存在−80°C下。为了提取细胞，需要400μl IP缓冲液（50 mM K⁺-肝素，pH 7.6，400 mM NaCl，1 mM EGTA，1 mM-MgCl₂将0.1%吐温-20、2μg/ml亮氨酸肽、2μg/ml胃蛋白酶抑制素、2μ/ml凝乳抑制素，2 mM PMSF，10%甘油）添加到每个菌株的一份细胞中。在冰上培养5分钟后，将提取物在4°C的微型离心机中离心10分钟，并将每个菌株的450μl上清液添加到含有40–50μl抗Gin4珠的试管中。将试管在4°C下端对端轻轻混合1.5小时，然后用500μl IP缓冲液洗涤珠子三次。在这些清洗结束时，每个菌株的珠子被等分为两个新试管，每个菌株中的一组试管用IP缓冲液清洗三次，而另一组试管在含有1.0 M NaCl的IP缓冲液中清洗。洗涤结束时，向每个试管中添加100μl 1×蛋白质凝胶样品缓冲液，并将试管置于沸水浴中5分钟，以从珠中释放蛋白质。对于Western blots，将每个样品的10μl加载到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。

gin4的构造^K48A型应变

包含GIN4公司通过PCR扩增基因并克隆到整合载体YIplac211的KpnI和HindIII位点，以创建质粒pDK46（PCR引物：GCGCAAGCTTGGAGTTATTCATCCGCT和CGCGGTACCCTGTACATAATTTATTTTTA）。一个BamHI位点位于激酶结构域II亚结构域中离保守赖氨酸密码子21个碱基的地方(汉克斯和奎因，1991年). 制备了一个PCR引物，该引物包含该BamHI位点，并将保守的赖氨酸转变为丙氨酸（AATGGATCACAGGACAGAGGCAGTTGGTATACAAAAGCAG）。第二个引物包括一个HpaI位点，该位点位于BamHI位点下游683个碱基，这两个引物用于扩增一个携带激酶域突变的片段，然后用于替换pDK46中的野生型片段以创建pDK49。用HpaI切割该质粒，以在GIN4公司在菌株DK186或DK166中GIN4公司基因，有一个突变拷贝和一个野生拷贝。这两个拷贝之间的重组事件是通过在细胞上镀上5-氟代甲酸来选择的，而在基因组中留下激酶域突变的事件是通过寻找突变的细胞形态特征的改变来确定的轧棉机4菌株。The phenotype of the轧棉机4^K48A型,Δclb^1,3,4突变并不像Δgin4,Δclb^{1 ,3,4}表型，可能是因为存在残余激酶活性。

Gin4激酶测定

为了测量细胞周期中的Gin4激酶活性，将650 ml菌株DK212和DK213细胞在室温下培养过夜，OD分别为0.8和0.85。将α-因子添加到1μg/ml，并在室温下培养细胞4小时。用500 ml预热至30°C的YPD培养基清洗细胞一次，然后用50 ml预热培养基清洗两次，以去除α-因子。在停止释放后的每个时间点，取出50 ml培养物，以3000 rpm的速度造粒细胞2分钟。将细胞重新悬浮在1 ml YPD中，转移到1.8 ml螺旋顶管中，然后在微型离心机中离心造粒1分钟。去除上清液后，将含有细胞颗粒的试管冷冻在液氮中。在每个含有冷冻细胞的试管中，添加500μl酸洗玻璃珠（直径0.5 mm；Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK），然后添加300μl冰镇溶血缓冲液（50 mm K⁺-肝素，pH 7.6，1M氯化钠，1mM EGTA，1mM氯化镁₂0.1%吐温-20，2μg/ml亮氨酸蛋白酶，2μg/ml胃蛋白酶抑制素，2μ/ml糜蛋白酶，2 mM PMSF，10%甘油），然后立即将试管放入Biospec Multibeater-8中，以最高速度搅拌25秒。取出试管并在冰水浴中冷却，然后在微型离心机中旋转5分钟。移除300μl上清液，并用200μl新鲜缓冲液替换，再次搅拌试管25 s。将上清液混合并再次离心5 min。从每个样品中移除25μl，用于Clb2相关激酶分析，如前所述(Kellogg和Murray，1995年).

通过在PBS中将亲和力纯化的抗Gin4抗体与蛋白A珠（Bio-Rad Laboratories）结合数小时（5μg抗体/20μl珠），制备抗-Gin4珠。然后用裂解缓冲液（不含PMSF）洗涤珠子数次，并将每种裂解液400μl添加到0.6-ml试管中的20μl蛋白A珠子中。将悬浮液在4°C的旋转器上混合1小时。然后在裂解缓冲液中清洗珠子三次，在激酶缓冲液（50 mM K）中清洗三次⁺-肝素，pH 7.6，1 mM EGTA，2 mM MgCl₂，0.1%吐温-20，10%甘油），并在第五次清洗后转移到新鲜试管中。最后一次清洗后，完全去除上清液，并添加20μl分析缓冲液（含有1 mM DTT，0.25 mM ATP，0.1 mCi/ml[γ³²P] ATP、50μg/ml组蛋白H1、2μg/ml亮氨酸肽、2μg/ml胃蛋白酶抑制素、2μ/ml糜蛋白酶）。轻轻旋转试管，在30°C下孵育30分钟，每10分钟轻轻混合一次。通过添加10μl 4×蛋白凝胶样品缓冲液停止反应，并将10μl加载到15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每条通道上。对于Western blotting，将10μl用于免疫沉淀的裂解液稀释到90μl的1×样品缓冲液中，并在沸水浴中培养3分钟，将每个样品的10μl加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。分析结果如图。​图77和​和99除了我们使用的细胞是在苯诺明有丝分裂期或α-因子间期被截留的细胞外，我们的方法与上述相同。

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图7

有丝分裂细胞的Gin4磷酸化组蛋白H1并在体外进行自磷酸化。(A类)所示菌株的细胞被α-因子阻滞在G1期或苯诺明有丝分裂期。然后从被捕的细胞中提取提取物，免疫沉淀Gin4，并使用组蛋白H1作为底物检测激酶活性。(B类)对照组显示，Gin4免疫沉淀物中存在的激酶活性不是由Cdc28引起的。野生型或cdc28-4号细胞在22°C下生长，并用苯诺明抑制有丝分裂。然后从滞留细胞中免疫沉淀Gin4，并在22°C或37°C下测量激酶活性。

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图9

Gin4的激酶活性是通过磷酸化激活的。(A类)Gin4蛋白从有丝分裂细胞中免疫沉淀，然后分裂成两个样品。用lambda磷酸酶处理一个样品(新英格兰生物实验室公司。)，而另一个样品被相同地处理，但没有添加磷酸酶。沉淀蛋白随后在9%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并通过Western blotting检测。(B类)免疫沉淀Gin4蛋白并用lambda磷酸酶处理，如答：。然后用激酶缓冲液冲洗免疫沉淀数次，并测定激酶活性。

测量cdc28-4号突变背景我们使用菌株RSN31-8d和DK186的对数期培养物进行了上述相同的分析。第五次洗涤后，将每个菌株的免疫沉淀物分为两等分。第六次清洗后，取下上清液，在37°C下预孵育每种菌株的一等分珠子15分钟。将40μl激酶分析缓冲液加热至37°C，然后向每个珠子样品中添加20μl，轻轻旋转试管，在37℃下孵育30分钟，每10分钟轻轻混合一次。在25°C下使用每个菌株的其他等分珠进行相同的程序。

磷脂酶处理Gin4

对于用磷酸酶治疗Gin4的实验，Gin4是用与上述Gin4和Nap1共免疫沉淀相同的程序从有丝分裂中停滞的DK186细胞中进行免疫沉淀的，但IP缓冲液中含有1.0 M NaCl。用IP缓冲液洗涤抗Gin4珠三次，然后用磷酸酶缓冲液洗涤两次（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM DTT，2 mM MnCl₂100μg/ml BSA）。第四次清洗后，将珠子分为两等分，最后清洗后，去除上清液，在每个试管中留下25μl的总体积。1.5μl lambda磷酸酶(新英格兰生物实验室公司。，Beverly，MA）添加到一个试管中，两个试管在30°C下培养30分钟。然后在添加15μl分析缓冲液之前，在含有1.0 M NaCl的IP缓冲液中清洗一次珠子，在激酶缓冲液中洗涤两次珠子。轻轻混合试管，并在30°C下培养30分钟，每10分钟轻轻混合一次。通过添加20μl 2×样品缓冲液停止反应。将15μl加载到15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行激酶分析，将2μl加载在9%凝胶上进行Gin4-Western印迹。为了确保在进行激酶分析之前，所有磷酸酶都被洗掉，我们进行了对照，在对照组中，我们将经磷酸化处理的Gin4珠与未经处理的Gin 4珠混合，并观察到Gin4激酶活性没有受到抑制（未显示）。

Clb2的表达^{Δ 176}间期细胞内

诱导Clb2的表达^Δ176在间期停滞的细胞中，在含有2%棉子糖的酵母提取物蛋白胨（YEP）培养基中培养30 ml菌株DK247，使其隔夜生长，OD为0.65。通过添加1.5μg/mlα-因子并在30°C下孵育3 h，将细胞阻滞在间期。将培养物分成两半，将细胞粒化并重新悬浮在相同体积的含有1.5μg/mlα-因子和半乳糖或棉籽糖的YEP培养基中。在添加半乳糖后的每个时间点，取每种培养物的1.6 ml样品，并通过Western blotting检测Gin4蛋白，如下所述。

Gin4是正确控制芽生长所必需的

作为进一步了解Gin4蛋白功能的第一步，我们删除了GIN4公司基因。我们特别感兴趣的是比较Δgin4具有以下表型的细胞Δnap1细胞作为确定这两种蛋白质是否参与细胞内类似功能的手段。的一个重要方面Δnap1表型是依赖于CLB2类为了生存(Kellogg等人，1995年 一). 要确定是否对GIN4公司，我们删除了GIN4公司二倍体株杂合基因缺失CLB1级,氯化硼3、和CLB4级基因。这种二倍体的孢子产生了所有可能的单倍体组合GIN4公司删除和CLB（爬升）删除。我们发现删除了GIN4公司野生型背景中的基因会导致轻微拉长的芽表型和一些细胞聚集，尽管菌落形成速度正常且外观光滑（图。​（图22 B类). 这类似于国家行动计划1在野生类型背景中删除(Kellogg等人，1995年 一). 删除GIN4公司a中的基因CLB2类-从属背景(Δgin4,Δclb^1,3,4)导致严重表型与原始表型无法区分ecm1型我们在基因筛查中发现的突变等位基因（图。​（图22 C类). 细胞生长为相互连接的大团块，具有高度拉长的芽形态，与观察到的国家行动计划1同一遗传背景中的缺失（图。​（图22 D类). The phenotype of theΔgin4,Δclb^1,3,4应变也类似于Δnap1,Δclb^1,3,4细胞在30°C下生长非常缓慢CLB1级或CLB3级部分挽救伸长的芽表型，而野生型CLB4级没有效果。表中总结了上述菌株的芽生长表型​表一。我.

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图2

删除GIN4公司该基因使细胞具有细长的芽形态。细胞在30°C的YPD液体介质中生长到对数相位，并使用Nomarski光学的×100物镜进行拍照。每个菌株的基因型都显示在每张图片的上方。

这些结果表明，Gin4和Nap1都是抑制极芽生长所必需的。由于在Clb2依赖背景中Gin4或Nap1的丢失可以通过其他有丝分裂Clb细胞周期蛋白的存在而得到很大程度的挽救，我们可以认为Gin4和Nap1正在介导Clb2的功能。这一结果还表明，其他Clb能够通过替代途径控制芽生长。我们发现这两种基因的缺失国家行动计划1和GIN4公司在CLB2类-依赖性背景导致的表型与任何单一缺失都没有区别，进一步证明Gin4和Nap1协同作用。然而，这两种基因的缺失国家行动计划1和GIN4公司在野生型背景下，引起的拉长芽表型比任一单一缺失更严重（见表​表I）。我). 这一结果表明，Clb2可能不是唯一通过Gin4和Nap1发挥作用的有丝分裂细胞周期蛋白。例如，其他Clb细胞周期蛋白可能通过也通过Gin4或Nap1起作用的替代途径控制芽生长。在这种情况下，两种基因的缺失轧棉4和国家行动计划1在野生型背景下，可能会影响多条通路的功能。

Δgin4，Δclb^1,3,4长时间有丝分裂延迟的细胞

为了进一步测试Gin4和Nap1是否参与类似功能，我们确定Δgin4,Δclb^1、3、4细胞经历有丝分裂延迟的方式类似于Δnap1,Δclb^1,3,4细胞。在我们之前的研究中，我们发现Δnap1,Δclb^1,3,4细胞正常地进行细胞周期，直到进入有丝分裂，在这一点上，他们在短纺锤体阶段经历了长时间的延迟，Clb2蛋白水平较高(Kellogg和Murray，1995年). 确定是否Δgin4,Δclb^1,3,4细胞经历了类似的有丝分裂延迟，我们尝试使用α-因子来同步G1细胞。然而，我们发现即使在α因子存在的情况下5小时后Δgin4,Δclb^1,3,4细胞仍有有丝分裂纺锤体，Clb2蛋白仍存在，表明细胞在有丝分裂中被阻滞。即使在携带缺失棒1阻止细胞突破α因子阻滞的基因。为了更仔细地研究这种有丝分裂阻滞，我们在对数期培养中加入了α因子Δgin4,Δclb^1,3,4,Δbar1单元格，和到Δclb^1,3,4,Δbar1然后每30分钟进行一次分析，以测量Clb2蛋白水平和有丝分裂纺锤体细胞的比例（图。​（图3，三,A类和B类). 在暴露于α-因子90分钟后，对照细胞在G1中同步停滞，如预期的那样，没有纺锤体，也没有Clb2蛋白。相反，Clb2蛋白水平在Δgin4,Δclb^1,3,4,Δ巴1细胞在控制应变后30–60分钟才开始下降，然后在剩余的5小时时间内几乎保持不变。类似地，有丝分裂纺锤体的细胞比例在对照菌株作用30–60分钟后才开始下降，大量细胞在3小时后仍有纺锤体。这些结果表明，一些细胞在30–60 min的延迟后能够退出有丝分裂，而其他细胞即使在5小时后也无法退出有丝裂。大多数细胞似乎在短纺锤体阶段停滞，这与Δnap1,Δclb^1,3,4细胞阻滞（图。​（图3三 C类; 和Kellogg和Murray，1995年). 中的许多单元格Δgin4,Δclb^1,3,4菌株有一个黑暗而凝缩的外观，表明它们已经死亡，这可能是长时间有丝分裂阻滞的结果。这些观察结果可能解释了Δgin4,Δclb^1,3,4细胞。

Clb2激活细胞周期蛋白依赖激酶活性不需要Gin4

先前的实验表明，Gin4是Clb2促进正常有丝分裂进程的能力所必需的。对这些结果的可能解释是，活性Clb2/p34的形成需要Gin4^川东北28激酶复合物。对于Nap1，我们可以通过测定Clb2/p34的激酶活性来排除这种可能性^CDC28型细胞周期中的激酶复合物Δnap1单元格(Kellogg和Murray，1995年). 为了确定Gin4的情况是否相同，我们检测了Clb2/p34的活性^CDC28型细胞周期中的激酶复合物Δgin4细胞。我们发现Clb2相关激酶活性在有丝分裂期间上升到正常水平Δgin4细胞中的激酶活性达到峰值的时间比对照细胞晚10分钟（图。​（图4）。4). 这些结果与获得的结果类似Δnap1单元格(Kellogg和Murray，1995年). 当我们在年进行同样的实验时，我们无法获得干净的结果Δgin4,Δclb^1,3,4由于该菌株不能与α因子完全同步（图。​（图3）。三). 然而，我们使用部分同步培养获得的结果与使用Δgin4单元格（未显示）。因此，Clb2激活细胞周期蛋白依赖性激酶活性不需要Nap1或Gin4。激酶活性激活的延迟可能是由于细胞周期素依赖性激酶复合体用于刺激自身激活的通路中存在缺陷所致(King等人，1994年).

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图4

Clb2激活细胞周期蛋白依赖性激酶活性不需要Gin4。(A类)有丝分裂期间Clb2相关激酶活性出现的时间进程。野生型和Δgin4如前所述，细胞从α因子阻滞中释放出来，然后在细胞周期中检测Clb2相关激酶活性(Kellogg和Murray，1995年). (B类)用于激酶分析的相同样本A类如前所述，通过Western blotting检测Clb2水平(Kellogg和Murray，1995年).

Gin4绑定到小睡1

上述实验证明GIN4公司删除和国家行动计划1缺失具有几乎相同的表型。这些结果为Gin4和Nap1参与细胞内类似功能的观点提供了有力支持。Nap1亲和层析实验为Gin4和Nap1之间的紧密功能相互作用提供了额外的支持。对于这些实验，我们使用大肠杆菌表达系统，然后将Nap1连接到柱基质。将对数相酵母细胞的粗提物加载到亲和柱上，然后用缓冲液清洗亲和柱，并用0.35-1M KCl梯度洗脱。我们发现许多不同的蛋白质与Nap1结合（图。​（图55 A类). 这些结果令人震惊，因为粗细胞提取物是在含有0.275 M盐的缓冲液中制成的，并且用含有相同盐浓度的15个柱体积的缓冲液清洗柱。事实上，许多蛋白质在这些严格的洗涤条件下仍然与色谱柱结合，这表明它们以相对较高的亲和力与Nap1结合，并可能代表特定的相互作用。然而，目前我们将注意力集中在用0.8–1.0 M KCl从Nap1洗脱的蛋白质上，因为这些蛋白质结合最紧密，因此最有可能直接参与Nap1功能。我们注意到，其中一种蛋白质的大小与Gin4的预测值大致相同（图。​（图55 A类,箭头). 从该蛋白获得的胰蛋白酶肽序列将其鉴定为Gin4，用抗Gin4抗体进行的Western blotting进一步证实了它是Gin4蛋白（图。​（图55 B类). 注意，当提取物通过Nap1亲和柱时，Gin4蛋白从提取物中定量地耗尽，这表明Nap1和Gin4之间存在紧密而特异的相互作用。我们还使用抗Gin4抗体进行免疫沉淀实验，以证明内源性Nap1蛋白与粗提物中的内源性Gin4蛋白共沉淀（图。​（图6）。6). 我们发现，粗提取物中的Gin4和Nap1之间的相互作用在用0.4 M NaCl反复洗涤时是稳定的，并且如亲和柱结果所预期的那样，被1.0 M NaCl.破坏。这些结果表明，Gin4以高亲和力与Nap1结合，并且这两种蛋白质可能在细胞内作为蛋白质复合体一起发挥作用。

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图6

Nap1与粗细胞提取物中的Gin4共沉淀。粗细胞提取物由野生型细胞或Δgin4然后将提取物用于Gin4免疫沉淀。用含有0.4 M NaCl或1.0 M NaCl.的缓冲液洗涤Gin4免疫沉淀物，然后用抗Nap1抗体检测共沉淀Nap1。

在Western blotting实验中，我们无法在Nap1亲和柱洗脱的组分中检测到Clb2。然而，这并不奇怪，因为在之前的实验中，我们发现Nap1可以用0.35M盐从Clb2亲和柱中定量洗脱(Kellogg等人，1995年 一). 在这些实验中，在洗脱之前，用含有0.275 M盐的15个柱体积的缓冲液清洗Nap1亲和柱，这可能会洗掉Clb2蛋白。

Nap1依赖性激活Gin4

The phenotype ofΔgin4细胞和Gin4与Nap1紧密结合的事实都表明，Gin4在有丝分裂期间发挥作用，而Nap1和Gin 4也参与类似的功能。为了进一步了解Gin4何时发挥作用，我们开发了一种检测方法，可以在细胞周期中跟踪Gin4的激酶活性。我们从间期或有丝分裂停滞的细胞中免疫沉淀Gin4，然后使用组蛋白H1、髓鞘碱性蛋白或酪蛋白作为测试底物分析沉淀的Gin4的激酶活性（图。​（图77 A类). 我们发现来自有丝分裂细胞的Gin4能够磷酸化组蛋白H1，而来自间期细胞的Gin 4几乎没有检测到的激酶活性。Gin4还能够磷酸化髓磷脂碱性蛋白（未显示）。作为对照，我们使用了来自细胞的有丝分裂提取物进行了相同的分析，这些细胞携带了GIN4公司基因，或Gin4激酶结构域中的点突变（赖氨酸48变为丙氨酸）。这些对照均未显示任何组蛋白H1激酶活性（图。​（图77 A类). 除了在这些分析中组蛋白H1的磷酸化外，我们还检测到与Gin4大小相同的蛋白质的磷酸化。该蛋白的磷酸化在Δgin4或在中轧棉4^K48A型这表明它是Gin4蛋白，并且Gin4能够进行自身磷酸化。

由于Nap1能够与Gin4和Clb2相互作用，因此重要的是要证明我们在本试验中观察到的激酶活性不是由Clb2/p34引起的^川东北28可能与Gin4蛋白共沉淀的激酶复合物。事实上，未观察到轧棉机4^K48A型突变体强烈反对这种可能性。控制实验表明轧棉机4^K48A型突变蛋白以正常水平表达（图。​（图10，10,底部)并由抗Gin4抗体免疫沉淀（未显示）。此外，用含有洗涤剂和1M NaCl的缓冲液反复清洗用于这些激酶分析的免疫沉淀物，该缓冲液应洗掉与Gin4相关的蛋白质。事实上，免疫印迹法无法在Gin4免疫沉淀物中检测到Clb2和Nap1。（注意，用于检测Nap1和Gin4之间相互作用的免疫沉淀协议如图。​图66在洗涤缓冲液中使用较低浓度的盐。）即使在生理盐浓度下进行Gin4免疫沉淀，我们也无法检测到Clb2，我们怀疑Clb2和Gin4在细胞内不会同时与Nap1相关。在我们之前使用Clb2亲和性列的工作中，我们发现Clb2绑定Nap1而不是Gin4(Kellogg等人，1995年 一). 这一结果支持了Clb2和Gin4在同一复合物中不存在的观点，并表明Clb2只能与未与Gin4复合的Nap1结合。作为额外的预防措施，我们从携带cdc28-4号温度敏感等位基因CDC28。先前的实验表明，该等位基因在体外产生对温度敏感的Cdc28蛋白(Ghiara等人，1991年). 当我们在限制温度下测定Gin4免疫沉淀物的激酶活性时cdc28-4号，我们观察到与对照菌株相比，激酶活性没有差异，证明我们观察到的激酶活性不是由Cdc28引起的（图。​（图77 B类). 最后，在最近的实验中，我们发现从含有Gin4激酶结构域的细菌中纯化的融合蛋白能够在体外磷酸化组蛋白H1，这表明Gin4具有磷酸化组蛋白H1的能力（未显示）。

接下来，我们使用组蛋白H1的磷酸化作为检测细胞周期中Gin4相关激酶活性的方法。我们用α因子将细胞阻滞在G1中，然后去除α因子，每10分钟取样一次，因为细胞在细胞周期中同步进行。在每个时间点，我们测定了Gin4相关激酶活性、Clb2蛋白水平和Clb2相关激酶活性（图。​（图88 A类). 我们发现Gin4相关激酶活性在有丝分裂期间达到峰值，在多个独立的实验中，我们始终观察到Gin4激酶活性的峰值发生在略晚于Clb2相关激酶活性的高峰（图。​（图88 B类). 我们还发现，假定的Gin4的自磷酸化与Gin4激酶活性同时达到峰值。

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图8

在有丝分裂期间，Gin4激酶以Nap1依赖性的方式被激活和磷酸化。(A类)Δclb^1,3,4,Δbar1单元格和Δnap1,Δclb^1,3,4,Δbar1将细胞从α-因子阻滞中释放出来，在指定的时间点采集样本，并使用组蛋白H1作为底物检测Gin4-相关激酶活性。(B类)中显示的相同示例A类检测Clb2相关激酶活性。(C类)中显示的相同示例A类通过Western blotting检测Clb2蛋白。(D类)中显示的相同示例A类通过Western blotting检测Gin4蛋白。

由于Gin4与Nap1紧密结合，这两种蛋白质似乎参与了相同的活动，我们接下来试图确定激活Gin4激酶是否需要Nap1。为此，我们检测了细胞周期中Gin4相关激酶的活性Δnap1,Δclb^1,3,4细胞。我们发现，这些细胞中的Gin4相关激酶活性水平较低，在细胞周期中变化相对较小，这表明Nap1是正确调节Gin4关联激酶活性所必需的（图。​（图88 A类). 有趣的是，在细胞生长的间期，Gin4激酶的活性虽然很低但很显著Δnap1,Δclb^1,3,4细胞（比较图中两种不同菌株在零时间点的激酶活性。​图88 A类). 这一观察表明，Nap1可能既需要在有丝分裂期间激活Gin4，也需要在间期有效地灭活Gin4。

Gin4的Nap1依赖性磷酸化

接下来我们讨论了Gin4在有丝分裂过程中被激活的机制。Western blotting实验表明，在有丝分裂过程中阻滞的细胞中的Gin4蛋白的电泳迁移率比来自间期细胞的Gin 4慢，这表明Gin4在有丝裂过程中发生翻译后修饰。用磷酸酶处理有丝分裂细胞中免疫沉淀的Gin4，使其转变为与间期细胞中Gin4相同的电泳迁移率，表明有丝分裂中的Gin 4被磷酸化（图。​（图99 A类). 为了确定Gin4磷酸化的时间，我们使用Western blotting跟踪细胞周期中Gin4的磷酸化，在图中我们使用相同的样本跟踪Gin4激酶活性的激活。​图8。8我们发现，Gin4磷酸化与Gin4相关激酶活性的出现平行发生，并且Gin4的磷酸化完全依赖于Nap1的存在（图。​（图88 D类).

在多次实验中，我们始终观察到，Gin4磷酸化最大的时间点与Gin4激酶活性峰值同时出现（图中的120分钟时间点）。​图8）。8). 这一观察表明，Gin4的激酶活性在有丝分裂期间通过磷酸化被激活。为了证实这一点，我们从有丝分裂中停滞的细胞中免疫沉淀Gin4，用磷酸酶处理Gin4并测定其激酶活性。我们发现，有丝分裂细胞中的Gin4去磷酸化导致Gin4激酶活性几乎完全丧失（图。​（图99 B类). 去磷酸化的Gin4似乎能够进行自磷酸化，但这一结果应谨慎处理。如果一小部分Gin4蛋白没有通过磷酸酶处理完全去磷酸化或失活，它很可能会经历自磷酸化。这将给出相对于组蛋白H1磷酸化的欺骗性强信号，因为分子内磷酸化将比分子间磷酸化更有效。

Gin4自动磷酸化

Gin4激酶分析如图所示。​图77和​和88表明Gin4能够进行自磷酸化。为了测试是否是这种情况，我们同步了轧棉机4^K48A型用α-因子进行筛选，然后通过Western blotting检测细胞周期中突变Gin4蛋白的磷酸化。我们发现具有非活性激酶结构域的Gin4完全不能进行有丝分裂磷酸化，支持了正在发生自磷酸化的观点（图。​（图10）。10). 我们在野生型背景和依赖Clb2的背景中都获得了相同的结果。

Gin4、Nap1和Clb2共同作用于有丝分裂事件的控制

许多不同的实验方法表明，Gin4、Nap1和Clb2共同控制有丝分裂事件。首先，由基因缺失引起的表型GIN4公司基因或国家行动计划1该基因几乎无法区分，这与这两种参与执行类似功能的蛋白质一致。其次，依赖Clb2的细胞中Gin4或Nap1功能的丧失会导致有丝分裂延迟延长，这与正确执行有丝分裂事件所需的这三种蛋白质一致。第三，依赖Clb2的细胞中Gin4、Nap1或Clb2功能的丧失导致了高度伸长的芽的形成，这表明这三种蛋白质都在有丝分裂期间正常发生的从极性芽生长到各向同性芽生长的转变中发挥作用(Kellogg等人，1995年 一;Kellogg和Murray，1995年;Lew和Reed，1995年;Lew和Reed，1993年). 第四，生化实验表明，Gin4和Clb2与Nap1直接相互作用，表明这三种蛋白质的功能必须紧密联系(Kellogg等人，1995年 一). 第五，在有丝分裂期间，Gin4激酶被磷酸化并激活，这与Gin4的有丝分裂作用一致。第六，在有丝分裂期间，体内需要Nap1来磷酸化和激活Gin4，这证明了这两种蛋白质在体内的功能相互作用。最后，在间期阻滞的细胞中Clb2的表达导致了Gin4的磷酸化，表明Gin4磷酸化是对Clb2活性的反应。

Clb2依赖细胞中Gin4功能的丧失导致长时间有丝分裂延迟

在依赖于CLB2类为了生存，删除GIN4公司基因或国家行动计划1基因在短纺锤体期导致长时间的有丝分裂延迟。观察到的有丝分裂延迟GIN4公司缺失更为严重，因为许多细胞似乎在有丝分裂过程中永久停滞，最终死亡。这种有丝分裂阻滞的主要原因尚不清楚。一种可能的解释是，细胞无法执行特定的有丝分裂事件，导致检查点控制激活，从而延迟细胞有丝分裂，直到这些事件完成。以前的研究已经证明存在检查点控制，可以延迟细胞周期以应对纺锤缺陷(Li和Nicklas，1995年;默里，1995年;Rieder等人，1994年)而突变细胞以短纺锤状结构停滞的事实表明，它们在纺锤状组装或功能的某些方面存在缺陷。我们已经发现Δnap1和Δgin4细胞都能抵抗破坏微管稳定性的条件，这表明Nap1和Gin4可能在调节微管稳定性中发挥作用(Kellogg和Murray，1995年; 和数据未显示）。未能正确控制微管稳定性可能导致有丝分裂纺锤体缺陷，并导致纺锤体组装检查点激活。已经确定了酵母中纺锤组装检查点所需的一些基因(Hoyt等人，1991年;Li和Murray，1991年)，但我们还无法测试这些基因是否是细胞分裂延迟所必需的Δgin4,Δclb^1,3,4单元格或中Δnap1,Δclb^1,3,4细胞，因为这些检查点基因中至少有一部分是合成致命的Δclb3,Δclb4双重删除（Kellogg，D.，未发表的数据）。有趣的是，我们观察到在有丝分裂纺锤体组装检查点被苯菌灵捕获的细胞已经完全磷酸化并激活了Gin4（图。​（图77和​和9）。9). 这表明纺锤体组装检查点必须在Gin4激活后的某个时刻阻止有丝分裂事件。对有丝分裂控制途径的其他成分进行进一步的分析，可能有助于确定检查点控制在有丝分裂中阻止细胞周期的作用。

有丝分裂阻滞的另一个可能的解释是，Gin4和Nap1在触发Clb2破坏和有丝分裂退出的途径中发挥作用。当细胞周期蛋白诱导进入有丝分裂时，它们会引发一系列事件，最终激活细胞周期蛋白破坏机制并退出有丝分裂(King等人，1994年,1995). 许多实验表明，除了破坏细胞周期蛋白外，细胞周期蛋白破坏机制还可能通过破坏将姐妹染色体结合在一起的蛋白质来诱导染色体分离(Holloway等人，1993年;Irniger等人，1995年). 有趣的是，细胞周期蛋白破坏机制的缺陷导致酵母细胞因短纺锤体和未分离的染色体而停滞(海奇曼和罗伯茨，1996年;Irniger等人，1995年). 我们对导致细胞周期蛋白破坏机制激活的途径几乎一无所知，Gin4和Nap1可能在这条途径中发挥作用。然而，Nap1和Gin4在激活细胞周期蛋白破坏中的作用并不能解释这些基因缺失导致的芽生长失控，这表明Gin4和Nap1必须参与几个有丝分裂控制途径。

丝裂原特异性磷酸化和Gin4激酶的激活

我们的结果表明，Gin4激酶在有丝分裂期间被激活和磷酸化，其方式依赖于Clb2和Nap1。此外，我们发现具有非活性激酶结构域的突变型Gin4在有丝分裂期间没有磷酸化，这表明Gin4的磷酸化是由于自身磷酸化。

在有丝分裂期间，Gin4激酶是如何被磷酸化和激活的？我们迄今为止获得的结果表明，Clb2和Nap1以某种方式激活了Gin4的自动磷酸化。有几个模型可以解释Gin4磷酸化对Nap1的需求。在之前的研究中，我们发现爪蟾Nap1可以被含有周期蛋白B的周期蛋白依赖性激酶复合物磷酸化，但不能被含有周期素A的复合物磷酸化合(Kellogg等人，1995年 一). 这一结果表明，Nap1仅在有丝分裂期间磷酸化，此时存在B型细胞周期蛋白。一旦磷酸化，Nap1就会刺激Gin4的自动磷酸化。在这个模型中，Clb2对某些有丝分裂事件的特异诱导完全是由于Clb2能够形成可磷酸化Nap1的细胞周期依赖性激酶复合物。这个模型的一个问题是，我们还无法在体外重建酵母Nap1的磷酸化，以重述我们使用爪蟾蛋白质，但这可能是由于两个系统之间的技术差异。

Gin4活化的另一个可能模型是，Nap1作为一种机制的一部分发挥作用，该机制通过Clb2细胞周期蛋白依赖性激酶复合物将Gin4磷酸化。Gin4的初始磷酸化可能会刺激Gin4自身磷酸化，导致Gin4激酶的完全磷酸化和活化。第三种模型假设，通过与Nap1和Clb2细胞周期蛋白依赖性激酶复合物结合，Gin4的自磷酸化被激活，其方式类似于通过与细胞周期蛋白结合激活细胞周期蛋白依存性激酶。这种模型的一个问题是，到目前为止，我们还无法在Gin4免疫沉淀物中检测到Clb2，这表明这两种蛋白可能不存在于细胞内的同一复合物中。

细胞周期事件的诱导与激酶特异性问题

在体外，Gin4能够磷酸化组蛋白H1和髓鞘碱性蛋白，这意味着其底物特异性与细胞周期蛋白依赖性激酶和MAP激酶的特异性重叠(尼格，1993年;Peter等人，1992年). 由于所有这些激酶都已知在有丝分裂过程中被激活(Gotoh等人，1991年;Heider等人，1994年;Minshul等人，1994年)，这一结果强调了在解释体外进行的激酶测定结果时谨慎行事的重要性。已经鉴定出许多蛋白质可以在体外被细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化，但越来越多的具有与细胞周期蛋白依赖性激酶重叠的底物特异性的激酶使得很难得出这些蛋白质是否真的在体内被细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化的结论。因此，很难使用体外磷酸化分析来研究细胞周期依赖性激酶诱导细胞周期事件的途径，除非有独立的方法来验证蛋白质在体内被细胞周期依赖的激酶磷酸化。

这项工作得到了国家卫生研究院拨款GM53959-01的支持。