酵母线粒体融合需要跨膜GTPase Fzo1p

质粒构建

对于pRS416-FZO1型，包含FZO1型利用含有工程EcoRI位点P297（5′-GGGG公司GAATTC公司CCAGGTACAGAATGCTGGTTGAAAG-3′）和P298（5′-GGGGGAATTC公司CTTGCTCCTTGTTGTCTTAAATGGAG-3′），并克隆到pRS416中唯一的EcoRI位点（经测序验证；Stratagene，La Jolla，CA）。pRS416的EcoRI片段-FZO1型被亚克隆到pRS414（Stratagene）中以生成pRS415-FZO1型.pRS414-FZO1型和pRS416-FZO1型质粒补充了线粒体形态缺陷和线粒体DNA的丢失fzo1Δ。要生成镀锌1规范形式的FZO1型，一个PCR片段，在FZO1型（N-3XMYC-FZO1型)使用带有工程SalI，P379（5′-GGGG）的引物从JSY2028（见下文）中扩增GTCGAC公司TATCTAATCGTGTCTAATTTCTTC-3′）和XbaI，P380（5′-GGGGTCTAGA公司TTAACGATGTCTAGGGAACAAGCTGGAG-3′），站点。PCR片段被克隆到pRS415中-镀锌1(Mumberg等人，1994年)（马里兰州Rockville的American Type Culture Collection）生成p加仑1-N-3XMYC型-FZO1型（pRS415）-镀锌1-N-3XMYC型-FZO1型，通过测序验证）。SRaffinose的生长提供了N-3XMYC-Fzo1p的充分表达镀锌1补体线粒体形态和生长缺陷的启动子fzo1Δ细胞。在保守基因中产生突变FZO1型GTPase结构域，来自pRS416的3.5kb EcoRI片段-FZO1型克隆到pALTER-1的EcoRI位点(Promega公司。)创建pALTER-1-FZO1型.定点突变（改变位点II；Promega公司。)使用以下诱变寡核苷酸进行：K200A（5′-GATGTAAATACTGGCGCC公司TCAGCTCTTGCAAC-3′，介绍一个EheI站点）；S201N（5′-CAGGTGATGTAAAATACTGGTAAAATGCAT公司TATGCAACTCTCTATAAGCG-3′，介绍NsiI站点）；T221A（5′-GGATCAGCTACCATGCGCA公司AATGTATTTCCGAA-3′，介绍Fsp I站点）；K371A（5′-GTTTTTTTTGTGAAA公司 GCTT公司TTGACAAAAATCAGGG-3′，介绍了HindIII站点）。通过限制性酶切鉴定突变体，并通过序列分析确认突变体。被诱变的fzo1型将基因亚克隆到pRS414和pRS424的EcoRI位点中。

fzo1Δ：：HIS3细胞的制备与表征

这个fzo1Δ：：HIS3通过将二倍体菌株JSY1373转化为含有50 bpFZO1型侧翼序列被HIS3型基因(Baudin等人，1993年). 这个fzo1Δ：：HIS3中断精确地删除了整个FZO1型编码序列并通过PCR分析验证。在孢子化杂合二倍体（JSY1808）的39个四分体中HIS3型标记分离为2:2，YP葡萄糖生长缓慢，YP甘油无法生长。使用一级抗孔蛋白抗血清（1:200稀释；分子探针，Eugene OR）和二级山羊抗小鼠FITC抗体（1:100稀释）（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove）在四个四分体中观察线粒体形态(Pringle等人，1991年). DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；25 ng/ml），以可视化mtDNA。交配JSY1810证实线粒体DNA丢失(fzo1Δ)到一个ρ^o（o）试验菌株JSY2555(FZO1型，ρ^o（o）). 第RS416页-FZO1型被转换为fzo1Δ菌株（JSY1810）产生JSY2579（野生型线粒体形态，无可检测mtDNA）。生成rho^o（o）菌株JSY2555（野生型线粒体形态，未检测到线粒体DNA），rho⁺菌株（JSY999）在含有25μg/ml溴化乙锭的合成最小培养基中培养两次达到饱和(Fox等人，1991年).

野生型（JSY1812）和fzo1Δ（JSY1810）电池基本上按照所述进行了以下修改(Yaffe，1995年). 在固定之前，菌株在YP葡萄糖中生长，另外两次更换无水Spurr树脂（Polysciences，Inc.，Warrington，PA），然后隔夜培养，以实现样品的最大渗透。

N-3XMYC-Fzo1p的消耗

为了耗尽N-3XMYC-Fzo1p，p加仑1-N-3XMYC型-FZO1型将质粒转化为JSY2038(fzo1Δρ⁺+第RS416页-FZO1型)和失去pRS416的细胞-FZO1型在含有5-FOA（5-氟有机酸）的SRaffinose培养基上选择质粒，得到JSY2273(fzo1Δρ⁺+第页镀锌1-N-3XMYC型-FZO1型). JSY2273在缺乏亮氨酸的SRaffinose培养基中培养24小时，以选择p镀锌1-N-3XMYC型-FZO1型为了阻断N-3XMYC-Fzo1p的表达，收集、冲洗细胞，并在SDextrose减去亮氨酸的条件下生长，密度为2.5×10⁶通过DiOC染色，在指定的时间点评估线粒体形态和mtDNA核仁分布₆（3,3′二己基氧基碳菁）（Molecular Probes Inc.）(赫尔曼等人，1997年)或DAPI(Pringle等人，1991年)分别是。JSY2270型(FZO1型ρ⁺+第页镀锌1-N-3XMYC型-FZO1型)，包含野生类型FZO1型基因，在N-3XMYC-Fzo1p缺失期间，线粒体形态或线粒体DNA没有任何变化（数据未显示）。在指定的时间点，通过Western blotting（抗MYC抗体）分析总细胞提取物中的N-3XMYC-Fzo1蛋白水平(哈洛和莱恩，1988年). 去除印迹并用抗-3-PGK（3-磷酸甘油酸激酶）（1:1000稀释）（Molecular Probes Inc.）重制，以控制蛋白质载量的差异。通过GFP（绿色荧光蛋白）染色对含有pRS416-ADH-COXIVpre-GFP质粒（JSY2634；mito-GFP）的JSY2273细胞的线粒体形态进行评分。

fzo1-1突变的产生和表征

这个fzo1-1型低保真度聚合酶链式反应产生温度敏感等位基因(Muhlrad等人，1992年). 突变的pRS414-FZO1型质粒被转化为一株菌株，其中fzo1Δ：：HIS3被pRS416覆盖-FZO1型（JSY2287）。pRS416的损失-FZO1型从这些细胞中选择生长在含有5-FOA的培养基上。含有pRS414的细胞-FZO1型在SG甘油培养基上测试突变质粒在25°C和37°C下的生长。鉴定出一株在37°C下不可见的菌株(fzo1-1型). 含有突变版本的FZO1型被恢复，当重新传输到缺少FZO1型在SG甘油培养基上引起温度敏感性增长。pRS414的转换-fzo1-1型野生型菌株的质粒显示fzo1-1型温度敏感性生长缺陷是隐性的。线粒体形态学检查fzo1-1型DiOC染色细胞₆（未显示）或mito-GFP。

为了检测交配过程中线粒体的融合，fzo1Δ+第RS414页-fzo1-1型标记有mito-GFP（JSY2802）或Mitotracker red（JSY2804）（Molecular Probes Inc.）的细胞在25°C或37°C下交配，并按照以下描述进行分析Nunnari等人（1997年）.

MYC-标记Fzo1p的构建与分析

3XMYC表位被直接引入起始Met下游FZO1型（JSY2028）如所述Schneider等人（1995）为了添加额外的MYC表位标签，N-3XMYC-FZO1型利用P297和P298从JSY2028中扩增出5′和3′侧翼序列的编码区加500 bp，并克隆到pRS426的EcoRI位点，产生pRS426-N-3XMYC-FZO1型（通过序列分析验证）。N-3XMYC型-FZO1型被亚克隆到pALTER-1的EcoRI位点（缺少NotI位点），并用NotI消化以释放3XMYC标记。含有来自质粒pMPY-3XMYC的3XMYC-表位的NotI片段(Schneider等人，1995年)插入氨基末端NotI位点FZO1型PCR筛选和序列分析用于鉴定包含9XMYC插入物的克隆（pALTER-1-N-9XMYC-FZO1型). N-9X-MYC-FZO1型克隆到pRS414的EcoRI位点以生成pRS414-N-9XMYC-FZO1型.fzo1Δ仅表达3XMYC标记的细胞（pRS426-N-3XMYC-FZO1型; JSY2028）或9XMYC-tagged（pRS414-N-9XMYC-FZO1型; JSY2394）Fzo1蛋白在非发酵碳源上正常生长，保留线粒体DNA，具有野生型线粒体形态，表明融合蛋白具有功能。使用抗MYC小鼠单克隆抗体（9E10；1:1000）通过总蛋白提取物的Western blotting检测所有MYC标记的Fzo1p形式（加州里士满伯克利抗体公司）(赫尔曼等人，1997年). N-9XMYC-Fzo1p在JSY2392中进行了本地化(fzo1Δ+第RS414页-FZO1型)和JSY2394通过间接免疫荧光法，使用一级抗MYC抗体（1:100稀释）和一级山羊抗小鼠FITC二级抗体（1:1100稀释）（Jackson ImmunoResearch）(Pringle等人，1991年).

N-9XMYC-Fzo1p的生化分析

一株表达N-9XMYC-Fzo1p的菌株（JSY2394）在缺乏色氨酸的SG乳糖培养基中生长，以选择pRS414-N-9XMY-FZO1型质粒。细胞裂解物（胞浆）通过差异沉淀分离，生成线粒体颗粒和线粒体后上清液(Daum等人，1982年;辛塞尔和达姆，1995年). 通过蛋白质印迹分析来自每个级分的样品（细胞当量）。为了确定N-9XMYC-Fzo1p的膜结合，将从JSY2394中纯化的100μg线粒体在12000℃下制成丸克10分钟，重悬于75μl 100 mM Na中₂一氧化碳_三pH 11.5或1%Triton X-100，含1 mM PMSF、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml亮氨酸蛋白酶，在冰上培养30分钟，然后在100000克30分钟。通过Western blotting分析等体积颗粒和上清液组分。线粒体内膜和外膜(Daum等人，1982年)加载到5 ml 0.85–1.6 M蔗糖梯度（0.8、1.1、1.35和1.6 M）上，然后在2°C的Beckman SW50.1转子中以30000 rpm离心16 h（加利福尼亚州Fullerton）。梯度被分为13个单独的400μl组分，并通过Western blotting进行分析。使用NIH图像1.60（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）比较蛋白质水平。通过在含有100μg/ml胰蛋白酶的破胶缓冲液（0.6 M甘露醇，20 mM Hepes-KOH，pH 7.4）中培养100μg纯化线粒体（来自JSY2394）来确定N-9XMYC-Fzo1p在线粒体上的定位(西格玛化学公司。密苏里州圣路易斯）。为了破坏外膜，用9体积的OS缓冲液（20 mM Hepes-KOH，pH 7.4）稀释线粒体，并将胰蛋白酶添加到最终浓度100μg/ml。20分钟后，通过添加大豆胰蛋白酶抑制剂（2.5 mg/ml，西格玛化学公司。)和1 mM PMSF。样品通过Western blotting进行分析。在以下稀释液中使用指示的抗体进行蛋白质印迹：抗MYC（1:1000）、抗孔蛋白（1:1000b条 ₂(1:10,000).

FZO1 GTPase点突变分析

pRS414，pRS415-FZO1型，pRS414包含FZO1型GTPase点突变被改组为JSY2287(fzo1Δρ⁺+第RS416页-FZO1型)，以产生以下菌株：(一)JSY2354型(fzo1Δ+pRS414）；(b条)JSY2392型(fzo1Δ+第RS414页-FZO1型); (c（c）)JSY2355型(fzo1Δ+第RS414页-fzo1[T221A]); (d日)第2356页(fzo1Δ+pRS414型-fzo1（K371A）); (e（电子）)JSY2357型(fzo1Δ+第RS414页-fzo1[K200A]); 和(（f）)JSY2358型(fzo1Δ+第RS414页-fzo1[S201N]). 当在低拷贝或高拷贝质粒上引入野生型时，突变Fzo1蛋白没有引起线粒体形态（抗孔蛋白染色）、线粒体DNA核仁保留（DAPI染色）或功能（甘油生长）缺陷FZO1型应变（JSY2288）（数据未显示）。亚细胞分离（见上文）和抗Fzo1p抗体的Western印迹证实，突变蛋白在fzo1Δ单元格（未显示数据）。

37℃条件fzo1-1突变体的线粒体网络片段

线粒体的形态可能在一定程度上受到反膜融合和膜裂变反应的调节(Nunnari等人，1997年). 如果fzo1型突变是为了阻止膜融合，我们预测持续的线粒体分裂最初会导致线粒体网络断裂。为了测试这一点，需要一个条件FZO1型等位基因(fzo1-1型)通过替换野生类型识别FZO1型突变质粒FZO1型质粒fzo1Δ应变（参考材料和方法）。fzo1-1型允许的增长fzo1Δ在25°C但不是37°C的SG甘油培养基上应变（图。​（图3三 E类). 这个fzo1-1型序列包含三种不同的核苷酸变化，导致预测多肽中的氨基酸替换K538I、N543I和P553Q（参考材料和方法）。DiOC染色₆（未显示数据）或GFP（图。​（图3，三,F类和G公司)证明线粒体网络形态在大多数（76%）fzo1-1型在允许温度下生长的细胞（图。​（图3，三,F类,fzo1-1型,25°C类、和G公司,t吨=0最小值）。然而，在转换到37°C后10分钟，99%的fzo1-1型细胞分裂成许多均匀分布的小线粒体隔室（图。​（图3，三,F类,fzo1-1型，37°C，以及G公司,t吨=10分钟). 在37°C下长时间孵育后，这些线粒体片段聚集在一起，形成大的膜聚集体，类似于在fzo1Δ应变（未显示数据）。如果在37°C下20分钟后，温度降至25°C，线粒体网络在60分钟内恢复野生型形态（图。​（图3三 G公司). 在对照实验中，在25°C或37°C下生长的野生型菌株中从未观察到线粒体断裂（图。​（图3三 F类,FZO1型,25°C类和37°C类). 在条件下观察到线粒体网络的快速断裂fzo1-1型该菌株直接证明Fzo1p控制酵母中的线粒体形态，并与该蛋白在线粒体膜融合中的作用相一致。

fzo1-1阻断交配过程中的线粒体融合

细胞融合后不久，酵母合子中就出现了线粒体融合和内容物混合(阿兹皮罗兹和布托，1993年;Nunnari等人，1997年). 为了直接测试Fzo1p在线粒体融合中的需求，我们检测了fzo1-1型交配过程中线粒体含量混合突变。通过用荧光活性染料Mitotracker red标记单倍体亲本和用基质靶向形式的GFP（mito-GFP）标记另一单倍体亲本来观察线粒体网络(Nunnari等人，1997年). 交配和合子形成后，用荧光共聚焦显微镜检查荧光团的分布。在25°C或37°C下进行的野生型细胞交配中，这两个荧光标记快速且完全位于合子中，表明亲代线粒体膜融合，线粒体内容物混合(Nunnari等人，1997年)（表​（表二）。二). 线粒体融合在fzo1-1型×fzo1-1型合子在25°C下形成（图。​（图4，4,A–D; 表​表II）。二). 相反，线粒体网络支离破碎，无法融合fzo1-1型×fzo1-1型合子在37°C下形成（图。​（图4，4,E–L; 表​表II）。二). 什么时候？fzo1-1型用共焦显微镜对合子进行光学切片，线粒体膜含有单倍体衍生的绿色和红色荧光标记，但从未共定位（图。​（图4，4,E–L). 此外，fzo1-1型×fzo1-1型在限制温度下形成的合子包含未融合的线粒体，即使它们完成了核配并形成了新的芽（图。​（图4，4,I–L型). 因此，fzo1-1型导致线粒体对接和/或融合受阻，而不仅仅是延迟。最后，线粒体融合在交配中也减少了fzo1-1型以及37°C下的野生型亲本（表​（表二），二)，表明Fzo1p的功能在两个单倍体亲本中都是有效线粒体融合所必需的。

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图4

FZO1型在交配过程中线粒体融合所必需的。fzo1-1型相反交配型细胞（JSY2802和JSY2804）用mito-GFP或Mitotracker红标记，并在25°交配(A–D)和37°C(E–H（E–H）和I–L型). 共聚焦显微镜用于对丝裂原-GFP的分布进行评分(绿色在里面B类,F类、和J型)和Mitotracker(红色在里面C类,G公司、和K（K）)在串行光学部分中（显示了具有代表性的单个光学部分）。线粒体内容物的融合和混合(黄色的在里面D类)在合并的mito-GFP和Mitotracker红色图像中进行评估(D类,H（H）、和L（左）). 用相控显微镜观察合子的形态(A类,E类、和我). 合子芽在右边A类在顶部我.白色箭头，亲代线粒体膜混合的区域。棒材，5μm。

我们认为fzo1-1型突变通过干扰线粒体运动和/或分布间接阻止线粒体融合。首先，尽管线粒体网络在37°C时断裂fzo1-1型×fzo1-1型合子，这些膜碎片正常分离成子细胞，表明线粒体运动没有严重受损（图。​（图4，4,I–L型,箭头). 第二，线粒体断裂fzo1-1型×fzo1-1型合子似乎不会阻碍它们的结合。我们经常在合子颈部附近或二倍体子细胞中观察到红色和绿色线粒体隔室紧密并置（图。​（图4，4,H（H）和五十、 箭头). 总之，这些结果提供了令人信服的证据，证明Fzo1p在线粒体融合中起着至关重要的直接作用。

Fzo1p是一种线粒体外膜蛋白，其GTPase结构域面向细胞质

Fzo1蛋白定位于营养生长酵母细胞的线粒体网络（图。​（图5）。5). 构建了一个编码Fzo1p的质粒，该质粒在氨基末端附近标记有九个MYC表位（N-9XMYC-Fzo1 p），并证明其可以修复线粒体形态缺陷、线粒体DNA丢失表型和甘油生长缺陷fzo1Δ应变（未显示数据）。抗-MYC抗体在表达N-9XMYC-Fzo1p的野生型细胞制备的提取物中识别出116-kD蛋白（图。​（图66 A类，车道2)但不是天然Fzo1蛋白（图。​（图66 A类，车道1). 抗MYC抗体的间接免疫荧光显示，N-9XMYC-Fzo1p定位于野生型细胞中的线粒体网络，并均匀分布在该隔室上（图。​（图5，5,A–D). 这些细胞中DAPI染色的mtDNA核仁模式与荧光信号重叠，证实N-9XMYC-Fzo1p位于线粒体网络上（图。​（图5，5,B类和D类; 比较白色箭头在里面A类和C类具有B类和C类). 当细胞被针对天然Fzo1蛋白产生的多克隆抗体染色时，也获得了类似的结果（数据未显示）。在对照实验中，在只表达野生型Fzo1p的细胞中没有检测到信号（图。​（图55 E类).

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图5

Fzo1p定位于线粒体网络(A–D)fzo1Δ用抗MYC抗血清对表达N-9XMYC-Fzo1蛋白的细胞（JSY2394）进行染色(A类和C类)和DAPI(B类和D类). N-9XMYC-Fzo1p染色与线粒体线粒体线粒体核仁标记完全一致（比较白色箭头在里面A类和C类具有B类和D类). (E类和F类)抗-MYC血清未染色fzo1Δ表达缺乏MYC标记的Fzo1p的细胞（JSY2392）。棒材，5μm。

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图6

Fzo1p是一种线粒体完整膜蛋白，其GTPase结构域暴露在细胞质中。(A类)总细胞提取物fzo1Δ含有野生型pRS414的细胞-FZO1型（车道1; JSY2392）或pRS414-N-9XMYC-FZO1型质粒（车道2; JSY2394），用抗MYC抗血清通过蛋白质印迹分析。相同的fzo1Δ携带pRS414-N-9XMYC的菌株-FZO1型（JSY2394）用于6亿-F类. (B类)N-9XMYC-Fzo1p与线粒体蛋白孔蛋白共分馏。等量细胞的蛋白提取物通过差速离心分离，通过SDS-PAGE分离，并与抗MYC、抗孔蛋白和抗3-PGK血清进行Western印迹分析。细胞质溶胶核后细胞质提取物；水户粗线粒体颗粒；PMS公司，上清液中线粒体耗尽(C类)N-9XMYC-Fzo1p是一种完整的膜蛋白。纯化线粒体(M（M）)处理以溶解外周膜蛋白（0.1 M Na₂一氧化碳_三)或整体膜蛋白（1%Triton X-100），分离成颗粒(P（P）)和上清液(S公司)并通过SDS-PAGE和Western blotting进行分析。可溶性细胞色素的释放b条 ₂和外围设备F₁0.1M Na后上清液部分的βATP酶亚基₂一氧化碳_三经Western blotting证实治疗有效（数据未显示）。(D类和E类)N-9XMYC-Fzo1p在中等密度线粒体膜组分中分馏。30–50%蔗糖梯度的馏分(顶部，分数1)用抗MYC、抗孔蛋白和抗CoxIV血清进行Western blotting分析。(E类)每部分总N-MYC-Fzo1p、孔蛋白和CoxIV的百分比。(F类)Fzo1p的GTPase结构域暴露在线粒体的细胞质表面1)，胰蛋白酶处理（通道三和4100μg/ml）和渗透性休克（车道2和4)线粒体通过SDS-PAGE和免疫印迹抗MYC和抗细胞色素进行分析b条 ₂血清。

亚细胞分离证实了Fzo1p的线粒体定位（图。​（图66 B类). 在核后细胞提取物的差速离心过程中，N-9XMYC-Fzo1p与线粒体颗粒以及线粒体外膜蛋白孔蛋白共分馏（图。​（图66 B类,水户). 在含有细胞质蛋白3-PGK的线粒体后上清液部分中未检测到N-9XMYC-Fzo1p（图。​（图66 B类,PMS公司). 使用抗Fzo1p抗血清对天然Fzo1蛋白进行分级后，从野生型细胞中获得了类似的结果（数据未显示）。

Fzo1p表现得像一种完整的膜蛋白，这是根据其羧基末端附近两个紧密间隔且保守的疏水结构域预测的（参见图。​图11 A类) (Hales和Fuller，1997年). 当用100 mM Na提取含有N-9XMYC-Fzo1p的线粒体时₂一氧化碳_三pH 11.5，为了释放外周膜蛋白，N-9XMYC-Fzo1p和完整的外膜蛋白孔蛋白都对碳酸钠提取有抵抗力，并且仍然与膜颗粒相关（图。​（图66 C类). 相反，当线粒体膜用1%Triton X-100溶解时，Fzo1p和孔蛋白被释放到上清液中（图。​（图66 C类). 在细胞器被渗透和机械方法破坏后，Fzo1p仍与线粒体膜相关，以释放可溶性膜间隙和基质蛋白（图。​（图66 D类和数据未显示）。

对蔗糖密度梯度上分离的亚线粒体膜组分的分析表明，Fzo1p与线粒体内外膜都相关。N-9XMYC-Fzo1p以中等密度分馏，其与包含完整膜蛋白CoxIV的内膜囊泡和包含孔蛋白的外膜囊泡的分布重叠，但不同（图。​（图6，6,D类和E类). 虽然这一结果并不能证明Fzo1p跨越两个线粒体膜，但这种分离模式是“被捕获”的易位中间产物的特征，这些中间产物跨越由易位孔形成的接触部位的两个线粒体薄膜(Pon等人，1989年). 以前已经观察到与线粒体内外膜分离并在接触部位富集的蛋白质(Pon等人，1989年).

Fzo1p以其氨基末端GTPase结构域和邻近的七肽重复序列为导向，暴露在线粒体室的细胞质表面。用胰蛋白酶处理分离的完整线粒体，使Fzo1p氨基末端的MYC标签完全消化（图。​（图66 F类，车道三). 相反，细胞色素b条 ₂是膜间隙中的一种蛋白质，对蛋白质水解具有抵抗力，这表明线粒体外层膜保持完整（图。​（图66 F类，车道三). 细胞色素b条 ₂然而，如果线粒体外膜被渗透性休克破坏（图。​（图66 F类，车道4). 由于Fzo1p的行为类似于完整的膜蛋白，这些数据还表明Fzo1 p羧基末端的至少一个疏水结构域嵌入线粒体外膜。

靶向线粒体Fzo蛋白的信号和机制可能是保守的。当cDNA编码黑腹果蝇Fzo蛋白被引入野生型细胞镀锌1低拷贝质粒果蝇属蛋白质与线粒体膜共分离，通过Western blotting和特异性抗体检测D类.黑腹食肉动物同源（数据未显示）。然而果蝇属Fzo蛋白不能修复线粒体形态或线粒体DNA丢失表型S公司.酿酒酵母fzo1Δ应变。

Fzo1线粒体膜结合和拓扑

免疫定位、分馏和蛋白酶消化研究表明，Fzo1p是一种完整的膜蛋白，其氨基末端显示在线粒体表面。这种拓扑结构将Fzo1p的GTPase结构域和相邻的七肽重复序列定位在细胞质中，它们可以与可能调节Fzo1蛋白功能的结合伙伴和/或调节分子相互作用。考虑到不同Fzo家族成员的畴结构和总电荷分布的守恒性（图。​（图11 A类;Hales和Fuller，1997年)，我们预测来自其他生物体的Fzo同源物将显示类似的线粒体分布和拓扑结构。

据报道，线粒体融合在线粒体内外膜之间的稳定接触点启动(Bereiter-Hahn和Voth，1994年). Fzo蛋白的羧基末端可能在融合反应中协调这两个位置的脂质双层的行为中发挥重要作用。蛋白酶消化和蛋白质溶解研究表明，Fzo1p的羧基末端疏水结构域中至少有一个嵌于线粒体外膜。此外，Fzo1p在蔗糖梯度中迁移，具有部分重叠线粒体内膜和外膜标记的中等密度部分。在与线粒体接触位点物理相关的蛋白质中观察到了这种分馏模式(Pon等人，1989年)表明Fzo1p位于这些构造中。有许多拓扑结构可以解释Fzo1p与两个线粒体膜分离的能力。Fzo1p可能跨越两个膜，其羧基末端在基质中，如最初提出的Hales和Fuller（1997）或者，Fzo1p的羧基末端尾部可以延伸到膜间空间并与内膜中的蛋白质相互作用。最后，Fzo1p可能只与其他蛋白质形成的接触部位的外膜相关。Fzo1p羧基末端的定位将有助于区分这些模型。

虽然果蝇属和酵母Fzo蛋白都是线粒体融合所必需的，一些观察结果表明它们可能受到不同的调节。首先，我们的研究表明果蝇属Fzo蛋白有效地靶向野生型酵母的线粒体膜，但不能拯救野生型酵母中的线粒体表型fzo1Δ应变（未显示数据）。其次果蝇属Fzo和酵母Fzo1蛋白在这两种生物体中表现出不同的表达模式。果蝇属Fzo仅在线粒体融合发生的短时间内在精子线粒体上检测到(Hales和Fuller，1997年)这表明线粒体融合的时间可以通过控制Fzo的表达、定位和/或降解来进行发育调控。相反，酵母Fzo1p蛋白水平和线粒体定位在有丝分裂生长、交配或减数分裂期间没有改变（数据未显示），这与线粒体融合发生在酵母生命周期的所有阶段的观察结果一致(Pon和Schatz，1991年;Nunnari等人，1997年;赫尔曼和肖，1998年). 在延时研究中，当一个线粒体小管的尖端与另一个线粒体微管的尖端或侧面接触时，可以观察到酵母线粒体融合(Nunnari等人，1997年). 这就意味着关键的融合成分在线粒体小管尖端被定位或特异性激活(Nunnari等人，1997年). 我们观察到Fzo1p均匀分布于线粒体室，这表明融合机制并不局限于尖端。相反，Fzo1p可以在膜接触部位局部激活。

Fzo1功能需要氨基末端GTPase结构域

Fzo1p的GTPase结构域对其功能至关重要，可以作为调节线粒体对接和/或融合的分子开关。这个fzo1（K200A）和fzo1（S201N）G1基序的突变相当于减少鸟嘌呤核苷酸结合的Ras GTPase的突变(Sigal等人，1986年;费格和库珀，1988年;Farnsworth和Feig，1991年). 这个fzo1（T221A）G2基序中的取代是基于Ras突变，该突变消除了与效应分子的相互作用(Adari等人，1988年;Cales等人，1988年;Vojtek等人，1993年;Murphy等人，1997年). 这些突变都没有破坏Fzo1p的定位，这表明将Fzo1p靶向线粒体不需要GTP结合和/或水解。

相比之下fzo1（K371A）G4基序的突变保留了野生型功能，能够修复线粒体融合、线粒体DNA维持和甘油生长的缺陷fzo1型突变细胞。这种赖氨酸在GTPases超家族中高度保守(Bourne等人，1991年)并且是Ras中GTP结合囊的有效核苷酸结合和稳定所必需的（Lys117）(Der等人，1988年;Pai等人，1990年). 尽管Ras中Lys117的突变显著降低了其对GTP的亲和力，但它不会破坏其致癌潜能(Clanton等人，1986年;Der等人，1988年). 此外，G4基序的类似突变果蝇属Fzo没有完全破坏线粒体融合(Hales和Fuller，1997年). 这些结果表明，酵母和苍蝇Fzo蛋白可能对GTP具有较高的内在亲和力，而不会因G4赖氨酸的改变而完全受损。或者，就核苷酸结合而言，该赖氨酸可完全（酵母Fzo1p）或部分（苍蝇Fzo）可有可无。

酵母类动力蛋白Vps1p和Dnm1p的突变形式(Vater等人，1992年;Otsuga等人，1998年)，哺乳动物动力蛋白(Herskovits等人，1993年;范德布利克等人，1993年)、和Ras(Sigal等人，1986年;费格和库珀，1988年;Farnsworth和Feig，1991年)当在野生型细胞中过度表达时，诱导显性表型。这些显性表型被认为是由于蛋白质的突变形式要么滴定出来，要么阻断了其功能所需的结合伙伴的活性。相比之下，我们测试的Fzo1p的失活形式均未在野生型细胞中诱导显性线粒体表型（数据未显示）。对这些结果最简单的解释是，Fzo1p单独起作用，或者Fzo1的GTPase结构域中的突变完全破坏了其与自身或其他蛋白质相互作用的能力。

我们感谢R.Jensen（马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学）提供的有丝分裂GFP质粒和细胞色素b条₂抗体，犹他大学健康科学中心（犹他州盐湖城）研究显微镜设施（K.H.Albertine和N.B.Chandler）的工作人员，以协助超微结构研究，Q.Tieu（加利福尼亚大学戴维斯分校）以技术协助分离fzo1-1型等位基因。

这项工作得到了美国癌症协会（CB-97）和美国国立卫生研究院（NIH）（GM-53466）对J.M.Shaw的资助，国家科学基金会（MCB-9724143）对J.Nunnari的资助，以及美国国立卫生研究院（HD-29194）对M.T.Fuller的资助。G.J.Hermann、K.G.Hales和J.P.Mills得到了NIH培训拨款的支持（分别为GM-07464、HG-00044和GM-07790）。犹他大学显微镜研究设施由美国国立卫生研究院（NIH）资助（S10-RR-10489）。犹他州健康科学测序设施得到了美国国家癌症研究所的资助（5-P30CA42014）。