COPII萌芽机从ER出口时的货物选择

蛋白质类

按照制造商的描述，小鼠Sec23A在pGEX/2T载体中表达为GST融合蛋白(法玛西亚生物技术公司.股份有限公司）。按照制造商的描述，使用GS珠从可溶性部分分离蛋白质(法玛西亚生物技术公司然后在储存于−80°C之前，对含有25 mM Hepes、pH 7.2、125 mM KOAc的缓冲液进行透析。按照说明制备Sar1A突变体(Rowe和Balch，1995年). 如上所述，GST–Sar1–GTP（Sar1[H79G]突变）在pGEX/2T载体中表达为GST融合蛋白。

大鼠肝细胞溶胶中Sec23-24复合物的纯化

将大鼠肝脏在搅拌器中均匀化，在3×vol/wt的缓冲液中，缓冲液中含有25 mM Hepes-KOH、pH 7.2、150 mM KOAc、250 mM山梨醇、1 mM DTT、1 mM-EGTA、1 mMEDTA、1 mM/PMSF和蛋白酶抑制剂的完整混合物（缓冲液a）(博林格曼海姆生物化学公司（印第安纳波利斯，印第安纳州）4°C。匀浆在1000℃下离心克持续10分钟，然后收集上清液并在12500下离心克收集上清液20分钟，然后在186000下离心克用30%的硫酸铵沉淀上清液1小时，通过16000离心收集含有Sec23免疫反应物质的沉淀物质克使用浆液均质器将硫酸铵颗粒再次悬浮在缓冲液B中（缓冲液a中添加1μg/ml钙蛋白酶抑制剂1、1μg/ml抑肽酶、0.5μg/ml亮氨酸蛋白酶和1μg/m1胃蛋白酶抑制素）20分钟，然后在10000℃下离心克将获得的上清液加载到凝胶过滤柱（S-300型；法玛西亚生物技术公司用缓冲液B进行预平衡。以0.4 ml/min的速度洗脱色谱柱，然后收集馏分。将含有免疫活性的组分合并，然后加载到DEAE-Sepharose柱上，该柱在缓冲液B中以0.15到1 M KOAc的非线性盐梯度以1 ml/min的流速洗脱。将免疫活性峰合并并加载到与缓冲液B平衡的羟基磷灰石柱上，缓冲液B补充有25 mM KH₂人事军官₄，pH 6.5（缓冲液B）。柱以25 mM至500 mM KH的梯度洗脱₂人事军官₄pH 6.5，流速0.8 ml/min。将免疫反应物质混合，然后在含有25 mM Hepes-KOH、pH 7.2和125 mM KOAc的缓冲液中透析。将Sec23-24部分浓缩至0.1 mg/ml，然后将部分冷冻在液体N中₂然后储存在−80°C下供后续使用。

大鼠肝细胞溶胶Sec13-31复合物的部分纯化

获得30%硫酸铵沉淀，然后将其装入S-300凝胶过滤柱(法玛西亚生物技术公司Inc.），如上所述。将含有Sec13-31复合物的高分子量部分混合，然后加载到如上所述的缓冲液B中的羟基磷灰石（HAP）柱上，然后在补充有25 mM KH的缓冲液B中洗脱₂人事军官₄pH 6.0。将洗脱的蛋白质混合，然后浓缩至3 mg/ml，使用凝胶过滤脱盐，冷冻在含有25 mM Hepes-KOH、pH 7.2和125 mM KOAc的缓冲液中，然后储存在−80°C下供后续使用。

Sar1 GTPase活性的测量

GST–Sec23或Sec23/24复合物的Sar1p GTPase活化（GAP活性）如所述（Mahajan等人）（1997年），使用0.5μM Sar1和1μM重组GST–Sec23或Sec23/24纯化部分的1μM进行。

ER发芽试验

使用从正常大鼠肾脏（NRK）细胞制备的微粒体进行COP II囊泡形成反应，然后使用VSV-G特异性抗体使用Western印迹对出芽进行定量(Rowe等人，1996年). 当用纯化组分进行芽接反应时，用GTP（2 mM）补充反应。

囊泡的免疫隔离

如前所述，对含有VSV-G的囊泡进行免疫分离(Rowe等人，1996年).

COPII招募分析

如前所述，使用Sar1-GTP限制性突变体进行COPII成分的膜招募(Aridor等人，1995年). 用于招募纯化Sec23–24复合物或His₆–Sec23，在存在Sar1–GTP–限制性突变体的情况下，将每种0.5μg与膜一起孵育。当用纯化成分进行招募反应时，反应混合物中添加0.1 mM GTP。

GST复合物隔离

在250 mM山梨醇、35 mM KOAc、0.5 mM MgOAc、20 mM Hepes、pH 7.2和2.5 M尿素存在下，通过冰上培养微粒体，从VSV感染的NRK细胞制备盐洗膜（120–160μg）。随后，通过12000℃离心收集膜克2分钟，然后在含有20 mM Hepes、pH 7.2、250 mM山梨醇、70 mM KOAc和1 mM MgOAc的缓冲液中再次悬浮。然后将膜培养在萌芽-转运反应中，如所述(Rowe等人，1996年)在存在或不存在GST–Sec23（11μg）和GDP（T39N）-或GTP（H79G）-限制形式的纯化Sar1蛋白（各1.5-μM）和1 mM GTP的情况下，在指定温度下保持30分钟，最终体积为160μl，如图所示。通过转移到冰中终止反应，然后通过20000离心收集微粒体克然后，在含有20 mM Hepes、pH 7.2、1 mM MgOAc和1%洋地黄素的缓冲液中，在冰上培养30分钟，将膜溶解在最终体积为1 ml的溶液中，并加入蛋白酶抑制剂混合物(Rowe等人，1996年)偶尔混合。不溶性物质通过50000离心去除克在4°C下保持15分钟。将用溶解缓冲液预先平衡的GS珠添加到可溶部分中，然后在4°C下摇晃样品再培养30分钟。随后，通过离心收集GS珠，然后用溶解缓冲液洗涤三次。清洗后的小球在SDS样品缓冲液中煮沸洗脱5分钟，然后加载到7.5%的SDS-PAGE凝胶上，并使用增强化学发光进行Western印迹分析。为了测定总蛋白质含量，使用CHCl浓缩GS小球造粒后上清液中剩余的未结合物质_三/如上所述的甲醇提取(Wessel和Flugge，1984年). 使用GST–Sar1–GTP和Sec23–24分离配合物，如GST-Sec23分离配合物所述，然后在10%SDS-PAGE凝胶上进行分析。

Sec23是膜对Sar1激活反应中可吸收的最小细胞溶胶COPII成分

为了确定启动COPII囊泡货物分拣的可能蛋白质相互作用，我们检测了纯化Sec23-24对ER膜的补充。微粒体与大鼠肝细胞液的孵育导致Sec23组分在膜上的募集依赖于温度和Sar1，当通过总膜的粒化进行测量时（图。​（图3三 A类,c（c）). 这一结果与我们之前的观察一致，即在半完整细胞中，在Sar1 GTPase激活后，COPII被特异性招募到ER中，并且可以基于间接免疫荧光与动员的VSV-G共定位(Aridor等人，1995年).

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图3

第23节表示Sar1 GTPase补充到膜的最小外壳成分。(A类)微粒体与大鼠肝细胞液在冰上或32°C下孵育10分钟，不存在或存在1μg激活的Sar1–GTP突变体，无论是否存在ATP再生系统。在所有情况下，将Sar1–GTP与100μM GTP一起添加。将膜造粒、清洗，然后使用材料和方法中描述的Sec23特异性抗体通过Western blotting测定Sec23结合量。(B类)如图所示，将微粒体与ATP再生系统、GTPγS（100μM）、Sar1–GTP和/或2 mM GTP一起孵育。将膜造粒、清洗，然后按照材料和方法中的描述对蛋白质印迹进行定量。Sec23结合量是在含有Sar1–GTP和ATP再生系统的培养液中观察到的最大结合百分比。(C类)微粒体与纯化的Sec23–24复合物或His孵育₆-用所述试剂标记Sec23答：。将膜造粒、清洗，然后通过Western blotting测定Sec23结合量。给出了三个独立实验的典型结果。

只有在存在ATP再生系统、GTP的摩尔浓度和Sar1–GTP限制性突变体以防止外壳解体的情况下，才能观察到COPII从胞浆到细胞膜的稳定募集（图。​（图3三 A类). ATP再生系统不能被包含ATP的非水解类似物ATPγS所取代（数据未显示）。当在没有Sar1–GTP的情况下开始招募时，仍然可以观察到对ATP再生系统的需求，但在存在GTP的非水解类似物GTPγS的情况下，GTPγS被激活为内源性细胞溶质Sar1蛋白（图。​（图3三 B类,a–c). COPII招募需要膜相关成分，因为膜的有限蛋白水解阻止了结合（数据未显示）。在缺乏ATP的情况下，当过量的GTP与GTPγS一起添加时，未观察到招募（图。​（图3三 B类,e（电子）)过量的GTP显著减少了ATP存在时GTPγS诱导的招募（图。​（图3三 B类,d日). 因此，需要GTPγS将内源性Sar1稳定在活性状态，以检测COPII与细胞膜的结合。相反，在缺乏ATP再生系统的情况下，用Sar1–GTP突变体添加毫摩尔浓度的GTP有效地支持了募集（图。​（图3三 B类,如果). 一些GTP可用于产生微量ATP，或添加的可水解核苷酸可用于不区分ATP和GTP的蛋白质，如酪蛋白激酶II。有趣的是，酪蛋白激酶II样酶类被牵涉到被毛募集中(Bonifacino等人，1996年). 无论如何，这些结果表明Sec23招募涉及额外的ATP/GTP依赖功能，该功能依赖于水解，与Sar1的功能不同。已经发现，与网格蛋白包被囊泡形成有关的AP1和AP3适配器复合体的ARF1依赖性募集也有类似的需求(Traub等人，1993年;Simpson等人，1996年).

为了确定在激活的Sar1存在下可补充到膜上的最小细胞溶质成分，我们检查了纯化的Sec23-24复合物从大鼠肝细胞溶质中的补充。从细胞液中观察到，纯化Sec23–24的募集依赖于温度、ATP和Sar1–GTP（图。​（图3，三，比较A类和C类,a–d). 此外，重组His时也观察到相同的结果₆-标记–在没有Sec24蛋白的情况下使用Sec23单体（图。​（图3三 C类，条车道e–h). 因此，Sec23募集的ATP/GTP需求是由于膜上存在的活性，Sec23代表COPII机制的最小细胞溶质成分，可在Sar1 GTPase激活后稳定募集到微粒体膜。

VSV-G以依赖Sar1的方式与COPII机械相互作用

为了解决COPII组分在货物选择和囊泡出芽中的作用，我们使用了一种从哺乳动物微粒体中重建1型跨膜蛋白VSV-G释放到COPII包被囊泡的分析(Rowe等人，1996年). 为了在体外进行囊泡出芽，从内质网中含有VSV-G的细胞匀浆中制备核后上清液部分。在含有大鼠肝细胞液和ATP形式的能量源的运输混合物中培养膜。使用差速离心法测量从内质网输出的VSV-G的分数，以更快地分离沉降内质网和高尔基膜，这些膜以中速（16000）回收克)从缓慢沉淀的ER衍生囊泡中提取的颗粒（MSP）释放到中速上清液（MSS）中。MSS中存在的载体囊泡随后以高速（100000克)通过SDS-PAGE和定量蛋白质印迹测量MSP或HSP级分中VSV-G的量。

为了确定囊泡出芽所需的最低成分，用高盐清洗膜，以去除任何残余结合的Sar1、Sec23-24和Sec13-31复合物(Barlowe等人，1994年; 数据未显示）。这些膜仍然具有出口能力，因为与细胞质和Sar1–GTP孵育导致含有VSV-G的小泡积聚（图。​（图44 A类,一). 通过与Sar1A-GDP限制性突变体孵育抑制发芽（图。​（图44 A类,b条)，这一结果与我们之前的证明一致，即来自ER的VSV-G出口受Sar1 GTPase的调节(Rowe等人，1996年). 高盐洗膜保持其以Sar1A依赖性方式招募GST-标记的Sec23（GST-Sec23）单体的能力（图。​（图44 B类). 然而，添加活化的Sar1A和GST–Sec23并不支持COPII囊泡的形成（图。​（图44 A类,c（c）). 这些结果表明，GST–Sec23在没有Sec24和Sec13–31的情况下不足以发芽。

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图4

VSV-G可以用Sec23在复合体中检测到。(A类)按照材料和方法中所述制备的盐洗微粒体在32°C下与大鼠肝细胞溶质孵育30分钟(一和b条)或商品及服务税-第23节(c（c）)在存在非活性Sar1A（GDP限制型）突变体的情况下(b条)（1μg）或激活的Sar1A（GTP限制）(一和c（c）)突变体（1μg）。VSV-G的量(%总数的)如前所述，测定COPII囊泡中ER的释放(Rowe等人，1996年). (B类)盐水洗涤的微粒体在冰上孵育(c（c）)或在32°C时(一,b条,d日、和e（电子）)持续30分钟(一)或GST–第23节(b–e类)在缺席的情况下(b条)或存在GTP-受限(一,c（c）、和d日)或GDP限制(e（电子）)Sar1突变体。将膜造粒、溶解并与GS珠培养，然后使用蛋白质印迹法测定珠上回收的GST-Sec23或VSV-G的量，如材料和方法中所述。(C类)在激活的Sar1–GTP突变体存在的情况下培养盐洗微粒体，然后将GST–Sec23造粒、溶解，然后用GS珠培养，如材料和方法中所述。VSV-G的量(顶部面板)，核磷蛋白II(中间面板)或calnexin(底部面板)在总样本中(一)或者从珠子上洗脱的(b条)通过Western blotting测定。给出了三个独立实验的典型结果。

在确定了不支持囊泡出芽，但支持GST–Sec23单体向膜稳定募集的条件后，我们分析了货物是否与含有部分涂层的募集Sec23相关。为此，将与重组GST–Sec23和/或Sar1A突变体孵育的盐洗微粒体制粒、洗涤，然后溶解在含有洗涤剂的缓冲液中。离心去除不溶性物质后，用GS珠培养上清液，然后用Western blotting定量结合GST–Sec23。GST–GS珠的Sec23回收率与Sar1A和温度有关（图。​（图44 B类,b条和c（c）). 在激活的Sar1–GTP限制性突变体存在的情况下培养（以防止外壳分解）导致GS珠结合Sec23增加约100倍（图。​（图44 B类,d日). 引人注目的是，在GS珠上也发现了VSV-G，其招募直接反映了GST–Sec23结合的要求（图。​（图44 B类,顶部). 平均而言，GS珠回收了总可溶性VSV-G的15-20%（图。​（图44 C类,顶部，比较一和b条)，该值相当于VSV-G在胞浆和ATP存在下通常释放到囊泡中的量（图。​（图44 A类,一). 在相反的一组实验中观察到相同的结果，其中使用识别VSV-G管腔结构域的抗体代替GS珠免疫沉淀VSV-G/GST–Sec23–包含复合物（数据未显示）。招募是选择性的，因为在与GS珠结合的蛋白质复合体中无法检测到丰富的ER标记蛋白核糖蛋白II和calnexin（图。​（图44 C类,底部，比较一和b条). 可溶性伴侣BIP也被排除在复合物之外（数据未显示）。因此，Sec23足以与Sar1A激活同时启动VSV-G招募，证明Sec23在囊泡萌芽前启动的货物分拣中的作用。

Sar1和Sec23-24复合物都是含有预萌芽中间体的货物形成所必需的

虽然在没有Sec24成分的情况下添加GST–Sec23促进了货物的选择性补充，但并不支持进一步的囊泡形成。为了使用纯化的Sec23–24分析货物补充和囊泡形成，并分析Sar1是否是出芽前复合物的成分，我们用GST修改了Sar1的激活形式，Sar1–GTP，以生成GST/Sar1-GTP嵌合体（GST–Sar1-GTP）。我们测试了GST-Sar1-GTP嵌合物是否会促进含VSV-G小泡的形成。我们利用了这样一个事实，即在盐洗后，Sar1成为芽变反应的限制成分。这一要求可以补充过量的胞浆（数据未显示）或添加外源重组Sar1（图。​（图5，5,c（c）). 将洗净的微粒体在存在ATP、胞浆和各种Sar1重组蛋白的运输反应混合物中重新悬浮30分钟，然后测量VSV-G向HSP的释放。用野生型重组Sar1补充测定（图。​（图55 A类，比较b条到c（c）)，Sar1–GTP（图。​（图55 A类，比较b条到d日)或GST–Sar1–GTP（图。​（图55 A类，比较b条到e（电子）)支持有效的囊泡形成。

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图5

GST-标记的Sar1–GTP支持小泡从盐渍微粒体膜上萌发。(A类)按照材料和方法中所述制备的盐洗微粒体与冰上的胞浆在芽变反应中培养(一)或在32°C下保持30分钟(b条)或野生型Sar1（1.5μg）(c（c）)，Sar1-GTP（4μg）(d日)，或GST标记的Sar1–GTP（10μg）(e（电子）)如图所示。VSV-G的量(%总数的)如前所述，确定从内质网释放到热休克蛋白中(Rowe等人，1996年). (B类)在32°C的温度下，在添加GST-标记的Sar1–GTP（4μg）的发芽反应中培养盐洗微粒体30分钟。收集7个萌芽反应的热休克蛋白，然后单独用磁珠进行免疫隔离(一)或与VSV-G尾部单克隆抗体（P5D4）结合的珠，如所述(Rowe等人，1996年) (b条). 用抗Sar1的多克隆抗体通过Western blotting检测结合到珠子的GST–Sar1–GTP。分子量标记显示在左侧。给出了三个独立实验的典型结果。

为了确定GST–Sar1–GTP蛋白是否并入含有VSV-G的囊泡中，微粒体在细胞液和GST–Sar1–GTP存在下孵育30分钟，然后使用涂有抗VSV-G细胞质尾部抗体（P504）的磁珠将ER衍生囊泡释放到免疫隔离的HSP中，我们之前使用的一种方法从形态学和生物化学两方面表征了体外生成的含有Sec23-的COPII囊泡的组成(Rowe等人，1996年). 与第23节一样，与野生型Sar1（25 kD）相比，基于Sar1的更高分子量（47 kD），使用Western blotting和Sar1特异性抗体可以在亲和纯化的囊泡上容易地检测到GST–Sar1–GTP（图。​（图55 B类,箭头).

由于GST–Sar1–GTP在外壳募集和囊泡形成中都是活跃的，因此我们检测了该嵌合体在存在或不存在从大鼠肝细胞液中纯化的Sec23–24的情况下分离含VSV-G的货物复合物的能力。我们发现GST–Sar1–GTP促进了温度依赖性的Sec23–24向微粒体膜的募集，正如GST–Sec23所观察到的那样（参见图。​图44 A类)（未显示数据）。在这些条件下，在没有Sec13-31的情况下，招募的成分不支持囊泡出芽（见下文和图。​图7）。7). 培养后，将膜溶解，然后用GS珠培养洗涤剂可溶性部分。对与GS珠结合的蛋白质进行免疫印迹和蛋白质分析。如图所示。​图6，6，在Sec23–24存在的情况下培养膜，但在没有GST–Sar1–GTP的情况下，没有促进货物与GS珠的结合（图。​（图66 A类,一). 同样，仅添加GST–Sar1–GTP仅导致少量（<1%）总VSV-G的恢复（图。​（图66 A类,b条)，可能反映了含COPII成分的盐洗膜的残留污染。然而，第23–24节和GST–Sar1–GTP的加入导致了VSV-G的高效招募（图。​（图66 A类,c（c）). VSV-G招募与温度有关（数据未显示），并且在Sec23–24增加的情况下饱和（图。​（图66 D类)因为在一些实验中，进一步添加复合物不会影响VSV-G在珠中的招募量或对出芽试验中释放的VSV-G产生影响（数据未显示）。在最佳条件下回收的VSV-G的量与在GST–Sec23和Sar1–GTP存在下孵育观察到的量相当（参见图。​图4）。4). 引人注目的是，招募是选择性的，并排除了内质网驻留蛋白，如核黄素II（图。​（图66 B类)或calnexin（未显示数据）。

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图7

ER中的囊泡出芽需要Sar1、Sec23-24和Sec13-31。(A类)如材料和方法所述，从大鼠肝细胞液中部分纯化哺乳动物Sec13-31复合物。粗胞浆中存在Sar1、Sec23、Sec24和Sec13(一,c（c）,e（电子）、和克)和HAP池(b条,d日,如果、和小时)分别用特异性抗体进行Western blotting检测（参考材料和方法）。注意，Sec13-31复合物中高度富集的HAP组分中没有Sar1或Sec23-24。(B类)将ER微粒体与ATP、GTP和纯化成分在32°C下孵育30分钟，然后按所述测定释放到HSP中的VSV-G量(Rowe等人，1996年). 反应在40μl体积中进行，补充400μg大鼠肝细胞液、2μg GST-Sar1-GTP、1μg His₆–Sar1–GTP、1μg Sec23–24复合物和42μg含Sec13/31的馏分，如图所示。给出了三个独立实验的典型结果。

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图6

VSV-G可以在带有GST标记的Sar1–GTP和哺乳动物Sec23–24复合物的复合物中分离。(A–C)在存在Sec23-24复合物（通道）的情况下，在32°C下培养盐洗微粒体30分钟一,d日、和克)GST标记的Sar1–GTP（车道b条,e（电子）、和小时)或两者（车道c（c）,如果、和我). 按照材料和方法中的描述，将膜制成颗粒，溶解，然后与GS珠培养。VSV-G的量(A类)或核磷蛋白II(B类)如材料和方法中所述，使用蛋白质印迹法测定在珠子上回收的。插图在里面A类和B类在检测VSV-G的同一印迹上显示对照微粒体膜(A类)或核磷蛋白II(B类). 对于免疫印迹分析，相当于四个萌芽反应（补充5μg Sec23-24(A类和B类)和8μg GST标记的Sar1–GTP）。(C类)对于银染色分析，将6个芽生反应的等效物与12μg GST-标记的Sar1-GTP和4μg Sec23-24合并。在C类，分子量标记显示在凝胶的左侧。*第24节细分产品；**GST–Sar1–GTP细分产品。(D类)在存在GST–Sar1–GTP和指示量的Sec23–24的情况下，在标准发芽反应中，在32°C下培养盐洗微粒体30分钟。GST-Sar1复合物中回收的VSV-G的相对量按照材料和方法中的描述进行测定。

免疫隔离复合物的银染显示Sec23-24的有效募集（图。​（图66 C类,箭头). 尽管在单独存在Sec23-24的情况下，许多蛋白质与GS珠结合（图。​（图66 C类,克)，这是一种不支持货物补充或囊泡出芽的对照条件，说明与GS珠结合的非特异性背景，仅在GST–Sar1–GTP存在下孵化（图。​（图66 C类,小时)或结合第23–24节（图。​（图66 C类,我)导致背景以上仅招募有限数量的蛋白质（图。​（图66 C类,灰色箭头). 这些蛋白质在COPII介导的货物选择和囊泡形成中的身份和可能作用目前正在研究中。重要的是，基于免疫印迹的VSV-G对应的蛋白带（图。​（图6，6,A类和C类，比较b条具有我,大箭头)在GST–Sar1–GTP和Sec23–24的存在下显著增强，但在缺乏这两种成分的培养中没有增强。这些结果直接证明了GST–Sar1将VSV-G募集到含货物复合体中的能力。有趣的是，VSV-G的招募水平与单独添加Sar1引发囊泡出芽期间与复合物结合的成分的招募水平相似（图。​（图66 C类,灰色箭头)这表明，与Sar1招募相关的限制因素参与了货物选择。

Sar1监管的第23–24节招聘有选择地将货物分类为萌芽前综合体

我们发现Sec23单体亚单位或纯化的Sec23-24复合物定义了COPII外壳的最小细胞溶质成分，这些成分在Sar1 GTPase激活后被招募到ER膜。这些蛋白质在功能上相互作用，因为酵母和哺乳动物Sec23组分都会加速Sar1的GTP水解固有速率。与酵母蛋白相比，哺乳动物蛋白作为Sar1 GAP的活性特别显著(Yoshihisa等人，1993年). 虽然部分外衣的补充不支持囊泡出芽，但我们的假设是外衣组装可以指导货物分拣(Aridor和Balch，1996年一 )Sar1-GTPase的激活与将货物募集到乳房前的洗涤剂可溶性蛋白质复合物中密切相关，这一观察结果现在直接支持了这一观点。最近报道了相关结果，显示酵母ER中货物的Sar1依赖性分拣(Kuehn等人，1998年). 综合观察结果确立了该途径的进化保守性。使用GST–Sec23或GST–Sar1，我们证明VSV-G（约占总数的15–20%）能非常有效地恢复到出芽前蛋白复合物中。复合物的形成被Sar1-GDP限制性突变体阻断，该突变体阻止COPII外壳组装，表明复合物形成对COPII成分的特异性。膜相关内质网驻留蛋白核黄素和钙连蛋白以及可溶性成分BIP被排除在复合物之外，显示出高选择性。免疫纯化的ER衍生囊泡在货物选择过程中也观察到ER驻留蛋白被排除(Rowe等人，1996年)和半完整细胞(Balch等人，1994年). 因此，体外预出芽复合物的形成重建了体内观察到的分选事件。

Sar1和Sec23-24复合物都需要用于货物选择，这是通过两种独立的方法证明的，这两种方法使用GST-Sec23蛋白（在激活的Sar1存在的情况下）或激活的GST-Sar1蛋白（在纯化的Sec23-27复合物存在的情况下）。在不存在交联试剂的情况下，回收活化的Sar1 GTPase、Sec23或Sec23-24并在洗涤剂-可溶性复合体中载货的能力表明它们之间存在紧密联系。Sar1–GTP和Sec23之间的相互作用与我们的观察一致，即哺乳动物Sec23是Sar1 GAP。这些结果使我们认为，处于激活状态的Sar1在大衣募集中起着结构作用，而不是催化作用。Sar1与膜相关鸟嘌呤核苷酸交换蛋白（GEP）的相互作用可能促进GTPase上形成高亲和力接触位点，与Sec23结合以启动外壳募集和货物选择，尽管这些事件的顺序尚待确定。Sec23–24复合体可能需要在萌芽期间与预选货物相互作用并稳定，或者可以在Sar1激活后直接选择货物交付至萌芽站点。

需要强调的是，激活的Sar1–GTP既不会促进货物出口，也不会影响观察到的货物分拣成囊泡(Rowe等人，1996年)或出芽前复合体（本研究）。然而，Sar1活化和失活（GTP水解）可能是正常分选事件的基本要素。正如Rab蛋白可以作为靶向融合复合物组装的动力学校对计时器一样(Aridor和Balch，1996年b条 ;Rybin等人，1996年)，Sar1可能起到类似的作用，其体内激活可能起到动力学控制的作用，以暂时稳定外壳复合体，以便进行适当的货物选择、包装和发芽。事实上，在激活的Sar1–GTP突变体存在的情况下，我们观察到大衣成分Sec23和Sec24超过了货物成分Sec24，这无疑是因为它能够通过阻止GTP水解来稳定这种暂时的大衣组合。

先前的研究表明，细胞溶质外壳在货物分拣中的作用，这些研究使用去污剂溶解的细胞匀浆探测外壳成分与冰上固定的信号肽的结合的方法，在体外检测货物与外壳的相互作用。例如，AP1复合物和网格蛋白外壳和酪氨酸排序基序之间的相互作用(Ohno等人，1995年,1996;Bonifacino等人，1996年)或含有苯乙烯的排序决定因素与COPI成分之间的相互作用(Cosson和Letourner，1994年;Fiedler等人，1996年;Sohn等人，1997年)已经证明。然而，很明显，这种相互作用既不是在生理条件下发生的，也不是在没有小GTPase ARF1激活的情况下，这些外壳被招募到其靶膜上。因此，COPII介导的货物选择对Sar1激活的依赖性以及Sar1作为出芽前复合物组成部分的作用也可能与其他细胞溶质外壳复合物相同。事实上，最近证实了小GTPase ADP核糖基化因子ARF1和COPI的β亚基在COPI募集过程中的直接相互作用(赵等，1997)并且ARF1的激活是生成AP1对TGN膜的高亲和力募集所必需的(Traub等人，1993年). 因此，在生理条件下，外壳复合物将不会结合排序决定因素，直到指导GTPase激活的未知事件发生为止。

虽然我们的研究主要集中在分析Sar1和Sec23-24存在时货物在出芽前复合物中的补充，但我们发现随后添加胞浆或仅添加Sec13-31复合物就足以促进囊泡形成。因此，Sar1和Sec23-24复合物是必要的，但不足以发芽。然而，它们的补充是内质网膜上囊泡逐步组装的真正中间产物。第13-31节在货物选择后的步骤中的具体作用尚待确定。

这项工作得到了美国国立卫生研究院对W.E.Balch的资助（GM 42336、CA 58689和DK 51870）。电子显微镜在CA 586689中广泛使用B芯。M.Aridor是欧洲分子生物学组织（EMBO）和人类前沿科学计划（Human Frontier Sciences Program）的奖学金获得者；S.Bannykh是囊性纤维化基金会博士后奖学金的获得者；C.Nuoffer是EMBO和瑞士国家科学基金会的奖学金获得者。