AMP活化蛋白激酶在二甲双胍作用机制中的作用

AMPK部分纯化和体外激酶测定。

从雄性SD大鼠中部分纯化肝脏AMPK(22)走上蓝色的台阶。100μl反应混合物含有100μM AMP、100μM ATP（0.5μCi³³每个反应的P-ATP）和缓冲液中的50μM SAMS（40 mM HEPES，pH 7.0，80 mM NaCl，0.8 mM EDTA，5 mM MgCl₂0.025%BSA和0.8 mM DTT）。添加酶后反应开始。在30°C下培养30分钟后，通过添加80μl 1%H停止反应_三人事军官₄将等分试样（100μl）转移到96孔MultiScreen板（MAPHNOB50；Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts，USA）中。用1%的H清洗盘子三次_三人事军官₄然后在Top-count中检测。使用化合物C-（6-[4-（2-哌啶-1-基乙氧基）-苯基）]-3-吡啶-4-基-吡唑啉[1,5-a]嘧啶-获得的体外AMPK抑制数据，通过非线性回归，使用N编写的计算机程序中的最小二乘Marquardt算法，拟合到以下竞争抑制方程。默克研究实验室的桑伯里：五_我/五_o个= (K（K）_米+S公司)/[S公司+K（K）_米× (1 +我/K（K）_我)]，其中五_我是抑制速度，五_o个是初始速度，S公司是底物（ATP）浓度，K（K）_米是ATP的迈克尔斯常数，我是抑制剂（化合物C）浓度，以及K（K）_我是化合物C的离解常数。

mRNA定量。

如前所述，将大鼠肝细胞接种在M199培养基中并饥饿(16). 然后用相同的无血清和含激素的培养基处理细胞6小时，培养基中含有25 mM葡萄糖，并按指示加入或不加入AICAR或增加二甲双胍浓度。使用硫氰酸胍法（TRIZOL；美国马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司）从培养的肝细胞中提取总RNA。使用TaqMan One Step Gold RT-PCR试剂盒（美国新泽西州布兰奇堡应用生物系统公司）对mRNA进行定量。引物如下：S14、S14p（6FAM-TGGTGATGCCCCAGCCTTCTTGAG）、S14F（TGTGGTGCGGAACATGGA）和S14R（CTCCGGACCACTCAGCTC）；对于FAS、FASp（6FAM-TCCGCC AGAGCCTTTGTTAA-TTGG）、FASF（AACTGAACGGCATTACT-CGGTC）和FASR（GTGTCCCATTGGATTGGT）；针对甾醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、SREBP1p（6FAM-TCCACCATCGGCACCCACTGT）、SREBP1F（AGGACCCAAGGTGACCTGG）和SREBP1R（GCCGGACGGG-TACATTTT）。

肝细胞葡萄糖生成。

24小时饥饿大鼠的肝细胞在2×10⁶在含有10 mM的碳酸氢盐缓冲盐水介质中的细胞/mlL（左）-乳酸、1 mM丙酮酸、0.3μM胰高血糖素，气相为O₂/CO公司₂(19:1). 使用西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯）的葡萄糖氧化酶试剂盒测量葡萄糖。

肌肉AMPK活性和葡萄糖摄取的测量。

用二甲双胍（2 mM）或对照培养基培养离体大鼠滑车上肌3小时，然后测量AMPKα1或AMPK(23). 对于葡萄糖摄取，在3小时培养的最后30分钟，胰岛素（300 nM）出现在指示的位置。然后，3-0-如前所述，在不存在或存在二甲双胍和/或胰岛素的情况下，使用10分钟的培养来测量甲基葡萄糖摄取(23).

动物实验。

雄性SD大鼠（300-350 g，n个= 7–8). 给大鼠治疗一次（见表​表1和1和图​图5b）5b） 或两次（见图​图6）6)一天5天。最后一次给药前，大鼠饥饿20小时，然后再喂养2小时；最后一次给药4小时后，将动物麻醉，并通过冷冻夹持快速取出肝脏，然后取血。通过Ultraspec RNA分离试剂（美国德克萨斯州休斯顿市Biotecx实验室公司）从冷冻切片的肝脏中制备RNA。核提取物是从7只大鼠肝脏中提取的(24). 使用标准葡萄糖氧化酶检测试剂盒测定葡萄糖水平；通过使用标准检测试剂盒（Sigma Chemical Co.）测量NAD到NADH的还原来测定β-羟基丁酸盐浓度。FFA水平使用德国曼海姆Boehringer Mannheim GmbH的检测试剂盒进行测量。使用罗氏诊断公司（美国印第安纳州印第安纳波利斯）的试剂盒检测甘油三酯水平。使用ALPCO有限公司（美国新罕布什尔州温德姆）的酶免疫分析试剂盒测量胰岛素浓度。所有体内实验均由机构动物护理和使用委员会批准。

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图5

二甲双胍和AICAR下调肝脏SREBP-1。(一)二甲双胍（500μM）和AICAR（500μM）对大鼠肝细胞SREBP-1 mRNA表达的抑制作用相似。平均值±SEM(n个=3次重复分析）。胰岛素显著增加SREBP-1 mRNA(P（P）=0.03，与学生的控制介质相比t吨测试）。AICAR和二甲双胍均显著降低SREBP-1 mRNAP（P）相对于胰岛素，分别为0.0046和0.01。(b)二甲双胍可防止治疗大鼠核提取物中成熟SREBP-1的再喂养刺激积聚。使用单克隆抗SREBP-1抗体（从杂交瘤CRL-2121制备）进行Western blot分析。从单独的体内实验中获得了类似的结果。

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图6

二甲双胍抑制体内肝ACC活性。在存在或不存在指示的柠檬酸盐浓度的情况下，使用来自用对照载体处理5天的喂养大鼠的肝脏样品分析ACC活性（填充正方形，n个=7）或用200 mg/kg（每天两次口服灌胃）二甲双胍治疗（开方格，n个= 8). **P（P）< 0.01.

表1

二甲双胍对AMPK激活下游选定参数的体内影响

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免疫印迹分析。

为了检测磷酸化AMPK（Thr172），从处理过的大鼠肝细胞中提取35%硫酸铵沉淀，利用多克隆抗体对AMPKα进行磷酸化，进行Western blot分析（Thr171；Cell Signaling Technology，Beverly，Massachusetts，USA）。对于SREBP-1，从二甲双胍治疗的大鼠肝脏中提取100μg核提取物进行类似分析，但使用单克隆抗-SREBP-1 Ab（从杂交瘤CRL-2121制备；美国型培养物收集中心[ATCC]，美国马里兰州罗克维尔）。

二甲双胍诱导原代肝细胞ACC失活。

作为AMPK激活的结果，二甲双胍治疗显著抑制了肝细胞ACC活性，与AMPK激活相关的浓度和时间点平行（图​（图1e）。1e） ●●●●。ACC催化乙酰辅酶A合成丙二酰辅酶A。丙二酰辅酶a是从头合成脂肪酸的初始底物，是脂肪酸氧化的速率限制步骤肉碱棕榈酰转移酶I（CPT-I）的有效抑制剂(34). 因此，ACC失活导致丙二酰辅酶a浓度降低，可能导致脂质合成减少，脂肪酸氧化速率增加。事实上，与AICAR一样，二甲双胍刺激了离体大鼠肝细胞中的脂肪酸氧化（图​（图11f） ●●●●。

二甲双胍和AICAR抑制脂肪生成基因表达。

AMPK也参与基因调控(10). 如上所述，AMPK的激活可以抑制几个葡萄糖活化脂肪生成相关基因的表达。与AICAR的作用类似，随着二甲双胍浓度的增加，肝细胞中葡萄糖诱导的FAS和S14表达逐渐受到抑制（图​（图2）。2). 作为对照，不受AICAR影响的HMG-CoA还原酶（HMGR）基因的表达不受二甲双胍的影响。

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图2

二甲双胍或AICAR治疗肝细胞可抑制大鼠原代肝细胞中的成脂基因。基于Taqman的实时RT-PCR用于定量FAS、S14和HMGR的mRNA。平均值(n个=每处理3）±SEM值*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01与对照介质（成对t吨测试）。C、 控制；A、 阳性对照（AICAR，500μM）。这些实验重复了至少三次，结果相似。

AMPK抑制剂的鉴定和表征。

为了确定AMPK在介导二甲双胍作用中的作用，采用高通量体外试验鉴定小分子AMPK抑制剂。通过筛选含有10000多个分子的化合物库，发现并表征了化合物C（插入图​图3a）。三a） ●●●●。使用可变ATP浓度进行的实验表明，化合物C是一种有效的可逆抑制剂，与ATP竞争K（K）_我=109±16 nM（图​（图3a）。三a） ●●●●。在体外实验中，化合物C对包括ZAPK、SYK、PKCθ、PKA和JAK3在内的几种结构相关激酶没有表现出明显的抑制作用。因此，据我们所知，这是对一种有效且选择性小分子AMPK抑制剂的首次描述，该抑制剂可能有助于进一步评估该途径的生理效应。将培养的肝细胞与化合物C孵育，可通过AICAR或二甲双胍抑制ACC失活（图​（图3b）。三b） ●●●●。化合物C还减弱了AICAR和二甲双胍增加肝细胞中脂肪酸氧化或抑制脂肪生成基因的作用（未显示）。

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图3

发现并使用一种新型小分子AMPK抑制剂，以确定二甲双胍对ACC和葡萄糖生成的影响是AMPK依赖性的。(一)化合物C对部分纯化AMPK的抑制作用（插图显示了化学结构）是可逆的，相对于ATP具有竞争性。在存在5μM ATP、0μM AMP（填充圆）、100μM ATP，0μM AM（填充正方形）和100μM ATP+100μM AMP（开放圆）的情况下进行体外激酶分析。(b)化合物C抑制AICAR和二甲双胍对大鼠肝细胞ACC的作用。平均值(n个=每处理3）±SEM值*P（P）<0.05与对照培养基（配对t吨测试）。(c（c）)化合物C减弱二甲双胍抑制24小时饥饿大鼠肝细胞产生胰高血糖素刺激的葡萄糖的能力。在时间0，加入化合物C（40μM），在时间30分钟，加入二甲双胍（2mM）。方形，控制；二甲双胍钻石；圆圈，二甲双胍加化合物C。每个点代表四次重复分析的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）在同一时间点，与单独二甲双胍相比，<0.01（成对t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。

二甲双胍介导的肝细胞葡萄糖生成需要AMPK激活。

据信，二甲双胍介导的抑制肝葡萄糖生成（HGP）在其降糖功效中起着主要作用(2,三,6). 在这里，我们确定二甲双胍和AICAR都能够抑制胰高血糖素刺激的原代培养的大鼠肝细胞中的累积葡萄糖产生（图​（图3c三c和未显示的数据）。重要的是，肝细胞与化合物C共培养能够减弱二甲双胍降低这些细胞中葡萄糖生成的作用（图​（图3c），三c） 表明二甲双胍抑制肝细胞葡萄糖生成需要激活AMPK。

二甲双胍激活肌肉AMPK并促进葡萄糖摄取。

由于AMPK激活被认为是刺激骨骼肌葡萄糖摄取的机制(12–14)，我们评估了二甲双胍对完整大鼠滑车上肌葡萄糖摄取和AMPK活性的影响。用二甲双胍孵育离体肌肉导致AMPK两个催化亚单位的活性增加（图​（图4a）。4a） ●●●●。这与葡萄糖摄取显著增加相一致，葡萄糖摄取也被观察到与胰岛素刺激的效果相加（图​（图4b）。4b） ●●●●。在以前的研究中，AICAR和其他应激对AMPKα2的刺激程度大于AMPK(23). 需要进一步研究来评估这种差异。

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图4

二甲双胍（Met；2 mM，3小时）刺激骨骼肌AMPK活性，并诱导葡萄糖摄取。(一)AMPK活性；(b)葡萄糖摄取。平均值(n个=每次治疗5-6只分离的大鼠滑车上肌）±SEM值。

AMPK激活抑制SREBP-1。

SREBP-1c是一种重要的胰岛素刺激转录因子，与胰岛素抵抗、血脂异常和DM2的发病机制有关(35,36). 由SREBP-1诱导的靶基因包括编码脂肪生成酶的基因，如FAS和S14。在胰岛素诱导SREBP-1的条件下，用二甲双胍或AICAR孵育大鼠肝细胞强烈抑制SREBP-1mRNA的表达（图​（图5a）。5a） ●●●●。因此，通过这些实验还确定了AMPK介导对脂肪基因表达影响的新途径。

我们感谢Shiying Chen描述抗AMPK抗体的特性，Marcie Donnelly提供与动物研究相关的技术支持，Mark Fraley提供化合物合成，Georgianna Harris和Denis McGarry提供有益的讨论和智力支持。