美国国家科学院院刊。1998年7月7日；95(14): 7987–7992.
低氧诱导因子1α的调节由O介导2-泛素蛋白酶体途径的依赖性降解域
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布莱根妇女医院血液科02115
*L.E.H.和J.G.对本文的贡献相同。
乔治·萨默罗（George N.Somero）编辑，斯坦福大学，加利福尼亚州太平洋格罗夫，1998年4月30日批准
摘要
缺氧诱导一组重要的生理基因，如促红细胞生成素和血管内皮生长因子。这些基因由低氧诱导因子1（HIF-1）转录上调，HIF-1是一种属于基本螺旋-环-螺旋PAS家族的全局调节因子。虽然HIF-1是一种由α和β亚单位组成的异二聚体，但其活性主要由缺氧诱导的HIF-1α稳定化决定，否则HIF-1在氧化细胞中会迅速降解。我们报告了HIF-1α中一个氧依赖性降解（ODD）结构域的鉴定，该结构域通过泛素蛋白酶体途径控制其降解。ODD结构域由≈200个氨基酸残基组成，位于HIF-1α的中心区域。由于该结构域的部分独立地赋予HIF-1α降解，因此需要删除整个区域才能产生稳定的HIF-1β，能够在缺乏缺氧信号的情况下异源二聚化、DNA结合和反式激活。相反，当与稳定蛋白Gal4融合时，ODD结构域单独导致氧依赖性不稳定性。因此，ODD结构域在调节HIF-1活性方面起着关键作用，因此可以通过改变氧张力来控制基因表达。
单个细胞和整个生物体的生存能力和功能取决于各种基因对氧张力变化的调节。在过去十年中，在理解氧感应的分子基础和生理相关基因的转录调控方面取得了重大进展，这些生理相关基因包括编码促红细胞生成素、血管内皮生长因子、酪氨酸羟化酶、，诱导型一氧化氮合酶和糖酵解酶（综述见参考文献。1和2). 这些基因的诱导产生了多种反应，以维持氧稳态。值得注意的是，在转录水平上，这些不同的基因都受到一个关键转录因子的控制：缺氧诱导因子1（HIF-1）(三,4).
HIF-1是一种αβ异二聚体，其两个亚单位均属于快速生长的碱性螺旋环螺旋（bHLH）转录因子PAS家族(5). β亚单位与芳香烃核转运体（ARNT）相同，ARNT也是芳香烃受体的异二聚体伴侣(6). 相反，α亚单位的唯一但关键功能似乎是调节缺氧反应。像这个家族的大多数成员一样，在N末端附近，两个亚单位都有一个bHLH结构域，这是DNA结合所必需的(7,8). 二聚化需要下游PAS结构域(7–10)和靶基因特异性(11). PAS家族成员的C末端部分差异很大。尽管ARNT在C终端附近包含事务激活域(12,13)，HIF-1转录激活似乎没有必要(14). 最近，在HIF-1α上发现了两个反式激活域，一个位于多肽的C末端，另一个位于中间(15–17).
尽管有这些发现，但人们对缺氧激活HIF-1的步骤知之甚少。磷酸化在信号传递过程中可能至关重要(4,18)，但目前还没有证据表明HIF-1磷酸化是低氧依赖性的。HSP90与HIF-1α的结合已被证实在体外(19)然而，这种相互作用的生物学意义仍有待确定。最近，ARNT被证明可以保护HIF-1α的蛋白水解在体外(20). 此外，一些研究小组报告，Gal4融合体中HIF-1α反式激活域的活性是缺氧诱导的(15–17). 尽管所有这些观察结果都很重要，但综合起来，它们并不表明HIF-1对缺氧反应的激活途径有一个一致的模型。
改变氧张力对HIF-1αmRNA或ARNT mRNA的稳态水平没有显著影响(14,19–21). 此外，正如报道的那样(21)在蛋白质水平上，ARNT是组成性表达的，不受氧的显著影响。相反，HIF-1α蛋白在暴露于氧气的细胞中非常不稳定，而缺氧诱导HIF-1β蛋白丰度显著增加。这些观察结果表明，HIF-1α的积累是HIF-1激活的先决条件，并导致一种假设，即HIF-1的激活主要取决于缺氧诱导的HIF-1β的稳定，否则HIF-1在氧合细胞中会迅速降解(21). 在本文中，我们证明不稳定的HIF-1α由HIF-1β内的氧依赖性降解（ODD）结构域控制，并且降解通过泛素蛋白酶体途径进行分解代谢。去除整个ODD结构域使HIF-1α即使在含氧细胞中也保持稳定，导致自主异二聚化、DNA结合和反式激活，而不依赖于缺氧信号。
材料和方法
细胞培养和试剂。
Hep3B细胞在α改良Eagle’s培养基（GIBCO/BRL）中培养，293细胞在Dulbecco改良Eagle's培养基（GIBCO/BRL）中，补充10%胎牛血清（HyClone）。正常氧被定义为95%空气和5%CO2而缺氧被定义为1%的氧气，94%的氮2和5%CO2.E64型[反式-环氧琥珀酰基-我-亮氨酸氨基-（4-胍基）丁烷]，N个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸甲硫氨酸，N个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸-我-我-去甲亮氨酸，和N个-羧苯氧基-我-亮氨酸-我-亮氨酸-我-去甲缬醛（Cbz-LLL）购自Sigma并溶解于二甲基亚砜中。环己酰亚胺和去铁胺也来自Sigma。
质粒。
pCMXGal4（N）中的Gal4 DNA结合域（1–147）(22)在框架内与HIF-1α融合，形成系列Gal4-HIF-1β融合。对HIF-1α的不同部分进行PCR扩增并克隆到载体中。HIF-1α（aa 530-814）片段从消化的pHIF-1(21)并克隆到载体中。
合成血凝素（HA）标记Nco公司I位点分别插入pBS-HIF-1α和pBS-HIF-1α/SX(21). 然后将HA标记的HIF-1α转移到pcDNA3（Invitrogen）中，产生p（HA）HIF-1 a和p（HA。通过PCR-扩增HIF-1α（aa 335–521），产生3′Xba公司I站点，消化生态RI和Xba公司一、 并插入消化后的p（HA）HIF-1α。其余的C末端缺失通过PCR-扩增到所需密码子进行。内部缺失基本上是通过使用两组引物的标准PCR扩增进行的。将所得产物插入pcDNA3中。所有结构均经DNA测序证实。
pARNT是通过将ARNT cDNA克隆（由加州大学洛杉矶分校Oliver Hankinson提供）插入pcDNA3构建的。HA-标记泛素表达载体（pMT123）由德国海德堡欧洲分子生物学实验室的Dirk Bohmann提供。
瞬时转染和全细胞提取物的制备。
如别处所述，293个细胞采用磷酸钙法悬浮转染(21). 使用4μg pHIF-1α和0.25μg质粒巨细胞病毒-β-半乳糖苷酶（β-gal）进行典型的转染。对于缺氧处理，细胞在收获前在缺氧室（日本大阪Tapei/Espec）中培养4-6小时。在一些实验中，细胞在缺氧前用60μg/ml环己酰亚胺预处理15分钟。基本上按照所述制备全细胞提取物(21). Hep3B细胞通常转染1μg pEpoEluc(21)和质粒巨细胞病毒-β-gal，以及每个60 mm培养皿2μg的p（HA）HIF-1α和pARNT。缺氧处理样品在缺氧室中培养过夜。如其他地方所述，裂解细胞并测定萤光素酶活性(21). β-Gal分析用于转染效率的标准化。
电泳迁移率变化分析。
HIF-1 DNA结合反应按所述进行(21). 对于Gal4 DNA结合反应，将10–15μg细胞提取物（用β-gal分析归一化）与1μg聚dI-dC在DNA结合中混合5 min，然后用20 fmol孵育10 min32含有Gal4结合位点的P标记寡核苷酸。
Western Blot分析。
如前所述，使用20–30μg经β-半乳糖分析标准化的全细胞提取物进行Western blot分析(21). 用1:2000稀释的多克隆抗Gal4抗体（Santa Cruz Biotechnology）检测Gal4-HIF-1α融合，用单克隆抗HA 12CA5（Boehringer Mannheim）检测HA标记的泛素和HA标记的HIF-1β。通过增强化学发光（Amersham）观察抗原-抗体复合物。
代谢标记、脉冲追踪和免疫沉淀。
细胞的代谢放射性标记[35S] 如前所述进行蛋氨酸、脉冲期和免疫沉淀(23). 用100 mCi（1 Ci=37 GBq）的[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸（Tran35S标签，ICN）在21%O下2或1%O24小时。收集样品并在1 ml SDS-溶解缓冲液中溶解(23)含有蛋白酶抑制剂混合物片剂Complete（Boehringer Mannheim）。用荧光成像仪（分子动力学）定量了谱带的强度。
结果
HIF-1α通过泛素-蛋白酶体途径不稳定和降解。
将细胞暴露于1%的O中可以诱导HIF-1 DNA结合活性2（缺氧），但在切换到21%O时2（常氧）由于HIF-1α亚基的快速衰变，结合活性迅速消失(21). 脉冲期代谢标记[35S] 蛋氨酸证实低氧诱导的HIF-1α在常压下半衰期短（<5分钟）（数据未显示）。
为了阐明HIF-1α降解的机制，我们使用了特异性抑制溶酶体蛋白酶、钙蛋白酶和蛋白酶体途径的肽醛(24). 用靶向蛋白酶体（Cbz-LLL）、溶酶体蛋白酶的抑制剂预处理Hep3B细胞16小时[反式-环氧琥珀酰亚胺-我-亮氨酸氨基-（4-胍基）丁烷]（E64）或钙蛋白酶(N个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸甲硫氨酸）（LLM），或使用低效蛋白酶体抑制剂(N个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸-我-去甲白细胞）（LLnL），并在常压下维持或在缺氧下培养4小时。通过免疫沉淀分析（图。A类)只有蛋白酶体抑制剂Cbz-LLL和N个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸-我-去甲亮氨酸（3和9通道），表明HIF-1α的降解是通过蛋白酶体途径特异性介导的。时间过程实验表明，仅用Cbz-LLL治疗2小时后，HIF-1α在常压下可检测到（数据未显示）。此外，脉冲相位实验（图。B)研究表明，在常氧条件下，Cbz-LLL治疗后HIF-1α的半衰期延长至2小时，而去铁胺是一种已知的模拟缺氧的铁螯合物(25)，将半衰期延长至仅≈30分钟（图。C类).
HIF-1α的降解通过泛素-蛋白酶体途径进行。(A类)用二甲基亚砜、10μM Cbz-LLL和50μM预处理Hep3B细胞反式-环氧琥珀酰基-我-亮氨酸氨基-（4-胍基）丁烷，N个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸甲硫氨酸和aN个-乙酰基-我-亮氨酸-我-亮氨酸-我-去甲亮氨酸分别持续16小时，并用放射标记[35S] 存在这些可逆的蛋氨酸(39)抑制剂在常氧（N）或缺氧（H）下再放置4小时。箭头表示HIF-1α。B.Hep3B细胞在常压下与10μM Cbz-LLL孵育(上部)或130μM去铁胺（DFO）在[35S] 蛋氨酸，然后追逐0.5、1和2小时。细胞裂解物用抗HIF-1α抗体免疫沉淀。HIF-1α信号强度B量化并绘制C类. (D类)用HIF-1α表达载体和/或HA-标记泛素载体转染293细胞，并在收获前用Cbz-LLL（+）或二甲基亚砜（-）处理16小时。表达的HIF-1α与抗HIF-1α进行免疫沉淀，用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析(上部)，并用抗HIF-1α抗体复制(下部).
为了确定泛素化是否参与降解，用HIF-1α或HA-标记泛素的表达载体或两者（图。D类). 为了最大限度地提高泛素结合HIF-1α中间产物的水平，使用Cbz-LLL阻断蛋白酶体途径。首先用与HIF-1α特异结合的抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA抗体进行Western blot检测。只有在两种表达载体转染后，特别是在Cbz-LLL存在的情况下，才检测到大量泛素结合的HIF-1α的涂抹(上部，车道5和6）。用抗HIF-1α抗体重复相同的印迹，以确认在存在或不存在HA标记泛素的情况下HIF-1β的等效水平(下部). 总之，这些结果表明HIF-1α的降解是通过泛素依赖的蛋白酶体途径介导的。
HIF-1α的降解受氧依赖性降解结构域控制。
为了寻找HIF-1α中通过泛素蛋白酶体途径调节其降解的区域，我们使用Gal4融合表达载体，其中Gal4 DNA结合域与HIF-1β的部分片段连接在框架中（图。A类). 将这些构建物转染到293细胞中，通过放射性标记的Gal4寡核苷酸的电泳迁移率变化以及抗Gal4抗体的Western印迹分析全细胞提取物。我们首先关注包含两个脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸（PEST）样序列的中心区域(5)通常对蛋白质降解至关重要(26,27).
通过Gal4融合蛋白识别负责氧诱导降解的区域。(A类)全长HIF-1α（aa 1–826）显示在顶部；bHLH域由一个黑框表示，PAS域标记为PAS，两个类PEST序列绘制为阴影框。Gal4 DNA结合域（G4）融合到PEST-like序列下游的HIF-1α延伸段（aa 498、530、577和602–814）和PEST-licke序列上游的HIF-Iα延伸段中（aa 98–603、573、518、496、400和363）。右侧总结了每个结构的缺氧诱导性（IND）。(B)用Gal-HIF-1α（98至573、518、496和400）转染293个细胞，并用[35S] 1%O下的蛋氨酸2，以21%O的速度追赶20.5、1和2小时。用抗Gal4抗体进行免疫沉淀。Gal4-HIF-1α融合用箭头表示，非特异性带用开放箭头表示。
我们首先检查了含有PEST样序列的区域及其下游（aa 498–814；图。A类). 与HIF-1相反，这些Gal4-HIF-1α融合是组成性表达的，并不是由缺氧诱导的，除了Gal4-HIF-1α（498–814）在常压下表现出较弱的表达（如图所示。A类). 同样，这些组成性表达的Gal4融合子的DNA结合不会因氧水平的变化而改变，也不会因环己酰亚胺（数据未显示）而改变，环己酰酮是一种已知可消除HIF-1 DNA结合的蛋白质合成抑制剂(三).
值得注意的是，当通过两个PEST样序列（aa 98–603）检测PAS结构域下游的HIF-1α区域时，观察到HIF-1样DNA结合（图。A） 。特别是，与HIF-1结合（++++）相比，含有两个PEST样序列的Gal4-HIF-1α（98–603）显示出强大的缺氧诱导（+++）。当其中一个PEST样序列被删除时，低氧诱导减弱[Gal4-HIF-1α（98–573和98–518）]。Gal4-HIF-1α（98–496）仍然表现出微弱的诱导作用，即使两个PEST样序列都被删除，这表明控制氧依赖性降解的区域并不局限于PEST样的序列。然而，当测试Gal4-HIF-1α（98–400和98–363）时，仅获得了本构结合（无诱导）。与这些结果一致，环己酰亚胺抑制由缺氧诱导的Gal4-HIF-1α物种的DNA结合，但不抑制那些组成性表达的物种（数据未显示）。脉冲相位实验（图。B)证实低氧诱导的Gal4-HIF-1α（98–573、98–518和98–496）在常压下的换血率高于Gal4-HIF-1α的换血速率（98–400）。总之，这些数据表明，氧调节区位于HIF-1α的aa 401和603内，该区域的获得使组成型表达蛋白Gal4在常氧条件下不稳定。
为了证实和扩展上述结果，构建了具有C末端缺失的HIF-1α表达载体，转染293细胞，并通过Western blot分析或免疫沉淀测定。由于我们的抗HIF-1α抗体是针对C末端制备的，因此在N末端的框架中放置了一个HA-tag，以便抗HA抗体能够通过C末端截断识别HIF-1。与上述结果一致，Western blot分析和免疫沉淀显示，aa 653、521和494的C末端缺失导致HIF-1α在常氧下的表达逐渐增加，而aa 400和329的缺失导致无缺氧诱导的强组成表达（数据未显示）。
这些结果表明，HIF-1α的降解受氧依赖性降解（ODD）域控制，ODD域使氧依赖性信号能够影响蛋白质的降解。为了直接验证这一假设，从HA标记的HIF-1α中去除了一段氨基酸（401–603）（图。A类). 用抗HIF-1α抗体进行的Western blot分析表明，与全长HIF-1。B上部HIF-1α（401Δ603）是组成性表达的，与氧张力的变化无关(下部，车道1和2）。使用与HIF-1αC末端特异性结合的抗体证实HIF-1β的剩余C末端部分（401Δ603）已表达。融合构建物HIF-1α（401Δ813）包含较大的内部缺失（图。B，第7和第8车道）。这些结果表明aa 401–603含有ODD结构域。
HIF-1α内部缺失分析。(A类)HIF-1α内部删除的示意图，其中删除了aa 401–603、401–529、497–601、401-496、497-529、531–601和401–813。右侧总结了每个结构的缺氧诱导性。(B)HA-标记全长HIF-1α(上部)和HIF-1α（401Δ603）(下部)用pARNT共转染293细胞，并用抗HIF-1α抗体进行Western blot分析。同样，用pARNT共转染HA标记的HIF-1α（497Δ601、531Δ601和401Δ813），并用抗HA抗体（3–8道）进行Western blot分析。(C类)用HA标记的HIF-1α（401Δ603）转染293细胞，标记有[35S] 蛋氨酸，然后在常压下追逐0.25、0.5、1和2小时。用抗HA抗体进行免疫沉淀。每一条带的强度被量化并绘制成D类.全长HIF-1α用黑色箭头标记，HIF-1β（401Δ603）用星号标记，HIF1α（497Δ601，531Δ601和401△813）用白色箭头标记。
试图通过将aa 401–603区域划分为三部分来缩小ODD域（图。A类)：aa 401–496；aa 497–529包含一个PEST样序列；和aa 531–601包含其他类PEST序列。对这三个部分中的每一部分及其组合进行了系统的内部删除测试，以确定ODD域的最低要求。与HIF-1α（401Δ603）不同，这些部分缺失的HIF-1β在常压下表现出不同程度的不稳定性（图。A类; 图。B右侧). 因此，删除整个ODD结构域对HIF-1α的完全稳定是必要的。
HIF-1α（401Δ603）的稳定性由脉冲相证实（图。C类)证明蛋白质在常压下的半衰期显著增加到≈1小时（图。D类). 总之，这些结果证实了ODD结构域位于HIF-1α的aa 401和603之间，是氧诱导不稳定性的关键决定因素。
ODD域单独提供ODD。
为了确定ODD结构域是否能够以异源方式独立发挥作用，将HIF-1α的aa 401–603部分融合到Gal4。与Gal4显示的DNA结合模式相反（图。A下部)，ODD结构域的添加导致在常氧条件下Gal4 DNA结合显著降低（图。A上部，车道1和3）。与HIF-1的阻断激活一致(三)，环己酰亚胺消除了Gal4-HIF-1α（401–603）的DNA结合，但不消除Gal4的DNA结合（通道2和4）。蛋白质丰度也通过免疫沉淀法测量（图。B). 与凝胶位移结果一致，Gal4-HIF-1α（401–603）的表达在常氧条件下与缺氧条件下相比显著降低（通道3和通道4），而Gal4的表达对氧气不敏感（通道1和通道2）。此外，脉冲追逐实验（图。C类)证明ODD结构域将Gal4半衰期从远大于2小时缩短到≈45分钟（图。D类). 因此，ODD域对于触发O既是必要的也是充分的2-HIF-1α的依赖性降解。值得注意的是，在常压下，Gal4-HIF-1α（401–603）的半衰期比HIF-1β（<5分钟）长得多（45分钟）。这种差异可能归因于Gal4蛋白的固有稳定性(t吨1/2≫2小时）与ODD结构域缺失HIF-1α的相对不稳定性(t吨1/2≈1小时）。
ODD域的功能是可移植的。(A类)Gal4-HIF-1α（401-603）(上部)和Gal4(下部)将表达载体分别转染293细胞，用电泳迁移率变化法检测其DNA结合活性。(B) [35S] 采用蛋氨酸标记和免疫沉淀法定量常氧和缺氧条件下Gal4（1和2道）和Gal4-HIF-1α（401-603）（3和4道）的丰度。(C类)类似地，Gal4-HIF-1α（401–603）(上部)和Gal4(下部)脉冲标记并在21%O下追踪0.25、0.5、1和2小时2。每个信号的强度以D类.箭头表示Gal4-HIF-1α（401–603）和箭头标记Gal4。
自主异二聚体化、DNA-结合和去除整个ODD结构域后的反激活。
由于HIF-1α需要与ARNT异源二聚体结合DNA，因此将HIF-1β（401Δ603）与ARNT表达载体共转染至293细胞，检测其DNA结合能力。如图所示。A类，HIF-1α（401Δ603）能够与低氧反应元件结合，并且在21%氧浓度下表现同样好（如果不是更好）2与1%O相比2（车道3和4）。这种结合是自发异二聚的结果，如电泳迁移率转移分析所证明的，其中HIF-1α（401Δ603）-DNA复合物通过添加抗HA或ARNT的抗体而超转移或消除（泳道6和7）。这些结果表明，一旦HIF-1α稳定下来，异二聚体和随后的DNA结合就不需要缺氧信号。
稳定HIF-1α的自主异二聚体化、DNA结合和反式激活。(A类)将（HA）HIF-1α或（HA）HIF-1α（401Δ603）与pARNT共转染到293细胞中，并通过电泳迁移率测定（1-4道）或在存在HA或ARNT抗体的情况下直接检测HIF-1 DNA结合(21)（车道6和7）。箭头表示HIF-1，星号表示HIF-Iα（401Δ603），开放箭头表示超移HIF-1α。(B)Hep3B细胞转染pEpoE-luc和pcDNA3或pEpoE-luc和pARNT加HA标记的HIF-1α、HIF-1β（401Δ603）、HIF-2α（497-601）或HIF-1γ（401△813）。测量并绘制荧光素酶活性。结果是三个独立转染的平均值。相应的低氧诱导倍数显示在底部。
HIF-1α的转录激活域被映射到aa 540-580和780-826(16,17)因此，HIF-1α（401Δ603）缺少前者，但保留了后者。鉴于其自主DNA结合活性，HIF-1α（401Δ603）通过与促红细胞生成素3′增强子驱动的报告子共转染Hep3B细胞来测试其反式激活能力(21). 如图所示。5B、 在常氧条件下，单独的报告子显示出背景水平的萤光素酶活性，由于内源性HIF-1的激活，缺氧使萤光素酶活性显著增强（≈6倍）。当报告者与过度表达ARNT和野生型HIF-1α的载体共转染时，荧光素酶活性在常氧和缺氧条件下均受到刺激，导致5倍的缺氧诱导。相比之下，HIF-1α（401Δ603）特别增加了常压下的报告活性，将低氧诱导降低到<2倍。对于较大的缺失结构体HIF-1α（401Δ813），也获得了类似的结果，该结构体仅包含C末端反式激活域的13个残基。然而，氧敏感性HIF-1α（497Δ601）的低氧诱导（图。B)与全长HIF-1α相似。
讨论
我们先前假设HIF-1的激活主要取决于缺氧诱导的HIF-1α的稳定，否则HIF-1在氧合细胞中会迅速降解(21). 在本报告中，我们通过三种独立的方法鉴定了一个ODD结构域：Gal4-HIF-1α融合用于初始筛选，HIF-1βC末端缺失用于确认，HIF-α内部缺失用于最终验证。所有数据内部一致，有力支持ODD域在控制HIF-1α稳定性方面的功能重要性。暴露于21%O的细胞内2ODD结构域赋予全长HIF-1α极短的半衰期（≈5分钟），甚至低于c-Fos的半衰率，c-Fos也受泛素蛋白酶体途径调节。这种快速转换适用于HIF-1α和c-Fos等转录因子的严格调节，使细胞能够快速适应环境刺激的变化。
越来越多的证据表明，泛素蛋白酶体介导的降解在调节广泛的转录因子中起着关键作用（综述见参考文献。28–30). 我们的实验表明，该途径介导HIF-1α的氧依赖性蛋白水解，HIF-1是一种在适应缺氧中起重要作用的转录因子。最近，Salceda和Caro(31)据报道，异二聚体HIF-1 DNA结合活性通过抑制泛素依赖性蛋白水解而增强。然而，没有关于HIF-1的哪些亚单位参与这一过程的信息。
含有PEST序列的蛋白质很可能成为细胞内快速降解的靶点(26,27). 人类HIF-1α在499–518和581–600位置包含两个类PEST基序(5). 这些序列位于ODD结构域的羧基末端，显示与O有关2-HIF-1α的依赖性降解。然而，ODD结构域的N末端一半也参与降解。HIF-1αC末端缺失和内部缺失的数据特别表明了这一点。在bHLH-PAS家族中与HIF-1α最密切相关的是EPAS-1/HLF/MOP2(32–34)，其在内皮细胞中选择性表达，并可能在细胞分化中发挥关键作用。虽然EPAS-1/HLF/MOP2中没有与ODD结构域同源的序列，但推测的PEST基序存在于蛋白质的其他部位，其功能尚不清楚。此外，芳香烃受体与HIF-1α有许多相似之处，但与HIF-α不同，它缺乏PEST基序，并且无论其连接状态如何，都相对稳定(35).
磷酸化可能是缺氧激活HIF-1的关键。丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶抑制剂阻断缺氧诱导HIF-1活化(18). 重要的是要确定氧气是否影响HIF-1α在特定位点的磷酸化，并确定这可能如何影响泛素-蛋白酶体介导的降解。虽然ODD结构域相对较大，但部分内部缺失未能产生稳定的HIF-1α，表明该结构域内存在功能冗余。事实上，在ODD结构域的三个人工分割部分（aa 401–496、497–529和530–603）中，每个部分都独立地赋予不同程度的缺氧诱导（图。A类). 这些结果对确定O的精确位置提出了严峻挑战2-依赖性退化。域上可能分布着多个功能位点，因此除非所有或大部分功能位点同时发生突变，否则HIF-1α将无法稳定。最近Pugh等。(17)检查了位于ODD域内的HIF-1α（aa 549–582）的内部转录激活域。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基在这段时间内的替换对报告者的缺氧诱导没有影响。
泛素-蛋白酶体途径对转录因子的调节可能依赖于与其他蛋白质的相互作用。例如，当E2F与口袋蛋白（Rb、p107和p130）结合时，它们就不会被降解(36,37). 相反，c-Jun的存在增强了蛋白酶体介导的c-Fos降解(38). 这些观察结果提出了ARNT异二聚化如何影响HIF-1α稳定性的问题。与全长ARNT结合可保护HIF-1α免受在体外蛋白水解降解(20). 虽然我们确实注意到与单独转染HIF-1α（401Δ603）的人相比，与ARNT和ODD结构域缺失的HIF-1β（401△603）共同转染导致DNA结合活性增强（数据未显示），但ARNT并未进一步增加DNA结合（图。A类)或蛋白质丰度（图。B)缺氧条件下HIF-1α（401Δ603）的表达。ARNT可能发挥作用体内用于在二聚化时稳定HIF-1α，但以氧诱导依赖的方式。此外，ARNT的这种保护作用可能受到以下事实的限制，即HIF-1α在细胞从1%氧切换到1%氧后迅速衰减221%，尽管其与组成性表达的内源性ARNT发生二聚化(21).
ODD结构域的鉴定为理解HIF-1激活的机制提供了分子基础。如图所示。缺氧激活HIF-1的过程可能涉及以下三个连续步骤。(我)缺氧通过消除ODD结构域介导的泛素蛋白酶体降解来稳定HIF-1α；(二)稳定的HIF-1α与内源性ARNT自主异二聚体化并与低氧反应元件结合；和(三)缺氧增强靶基因的HIF-1反式激活。HIF-1α的稳定可能是主要的调节方式，因为其他两个步骤取决于HIF-1蛋白的丰度。此外，ODD结构域可以作为描述缺氧信号通路的起点，从而识别与该区域相互作用的蛋白质。此外，考虑到ODD结构域功能的可运输性，可以设想ODD融合蛋白可以被工程化，以便在生理系统中通过氧张力调节感兴趣的表达蛋白。
缺氧诱导HIF-1激活的模型。图示了HIF-1α的示意图。bHLH域用黑框标记，C端事务激活域用阴影框标记。显示PAS和ODD域。由氧张力变化调节的步骤用粗线框起来。
致谢
我们感谢Zoltan Arany、Shoumo Bhattacharya和David M.Livingston的抗HIF-1α抗体和Gal4表达载体，感谢Dirk Bohmann的HA标记泛素结构，感谢Oliver Hankinson的ARNT cDNA克隆。我们也感谢Alfred Goldberg的有益讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款RO1-DK41234（H.F.B.）的支持。L.E.H.是美国国立卫生研究院国家研究服务奖（F32-DK09365）的获得者。
脚注
本文直接（轨道II）提交给诉讼办公室。
缩写：HIF-1，缺氧诱导因子1；ODD，氧依赖性降解；Cbz-LLL公司，N个-羧苯氧基-我-亮氨酸-我-亮氨酸-我-去甲缬草醛；芳香烃核转运体；bHLH，基本螺旋-环-螺旋；HA、血凝素；PEST、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸；β-半乳糖苷酶。。
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