核受体PPARβ/δ和PPARα直接调控小鼠心脏的不同代谢调节程序

MHC-PPARβ/δ小鼠不会发生脂毒性心肌病。

MHC-PPARα小鼠发生心肌肥厚和功能障碍，与心肌脂质积聚和高FA摄取和利用率有关(19)与糖尿病心脏相似的表型。对8周龄、性别匹配的MHC-PPARα和MHC-PPAR-β/δ小鼠以及相应的NTG同窝小鼠的心脏进行检查，以确定心室肥大和心脏功能障碍的迹象。如前所示，MHC-PPARα心脏的平均双心室重量/体重量比显著高于对照组（3.9±0.2 vs.3.3±0.1；P（P）<0.05），即使转基因表达水平较低。相反，MHC-PPARβ/δ小鼠在任何转基因表达水平上均未表现出心肌肥大（补充图1A；本文在线提供补充材料；doi:10.1172/JCI32578DS1）。无论心室重量是否归一化为体重或胫骨长度，都获得了类似的结果（补充图1B）。

采用超声心动图评估MHC-PPARβ/δ小鼠的心功能。与对照组（58.5%±6.7%；P（P）< 0.05; 图​图22和补充表1）。正如预期的那样，为期8周的HF饮食（43%的总热量作为脂肪）导致MHC-PPARα-LE小鼠出现严重的心脏功能障碍，表现为LV FS显著下降（41.1%±5.9%），而对照组为63.2%±5.2%；P（P）< 0.01; 图​图2）2)以及收缩和舒张心室扩张（补充表1）。与此形成鲜明对比的是，MHC-PPARβ/δ–LE小鼠在标准或HF饮食中没有表现出任何心室功能障碍或异常心室扩大的迹象（图​（图22和补充表1）。即使在MHC-PPARβ/δ-HE转基因系中，后一个观察结果也成立（图​（图2）。2).

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图2

心肌病在MHC-PPARα小鼠中发生，但在MHC-PPARβ/δ小鼠中不发生。

(一个)标准（Std）或HF饮食治疗后，8周龄雄性MHC-PPARβ/δ-HE和MHC-PPERα-LE小鼠及NTG同窝鼠左心室的典型M型超声心动图。(B类)平均LV FS百分比(n个≥7个/组）*P（P）与NTG相比<0.05**P（P）与NTG和标准饮食治疗的MHC-PPARα-LE相比，<0.05。

MHC-PPARβ/δ小鼠缺乏心肌病表型，这使我们探索了脂肪毒性的代谢特征。MHC-PPARβ/δ和MHC-PPARα小鼠喂食HF食物8周或禁食48小时（以快速增加循环中的非酯化FA）。通过油红O染色半定量显示心肌中性脂肪水平，然后使用电喷雾电离质谱（ESI/MS）对TAG物种进行表征和定量。与MHC-PPARα小鼠相比，MHC-PPAR-β/δ心脏没有积聚异常水平的中性脂质（图​（图3A）。三A） ●●●●。禁食48小时后获得了类似结果（数据未显示）。通过ESI/MS对TAG水平的量化显示，与对照组相比，喂食HF饮食或禁食48小时的MHC-PPARα小鼠的心肌TAG水平显著增加（图​（图3A）。三A） ●●●●。与此形成鲜明对比的是，与HF饮食或禁食的对照组相比，MHC-PPARβ/δ小鼠的心肌TAG水平没有显著差异。结合超声心动图数据，这些结果表明，与MHC-PPARα小鼠相比，MHC-PPAR-β/δ小鼠不发生脂毒性心肌病。

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图3

饮食诱导的MHC-PPARα小鼠心肌TAG蓄积，而非MHC-PPAR-β/δ小鼠。

(一个)上图：喂食HF 4周后，雄性MHC-PPARα-LE和MHC-PPERβ/δ-HE小鼠及NTG同窝鼠心室组织样本的组织学外观。红色液滴表示油红O的中性脂质染色。底部：在雄性MHC-PPARα和MHC-PPORβ/δ小鼠中，通过HF饮食或禁食48小时后的ESI/MS测定心肌TAG水平。(B类)通过RT-PCR分析确定的指示基因的平均心室mRNA水平，显示为标准化为NTG对照值的任意单位（AU）。在喂食HF 4周后，从小鼠心脏中分离出RNA。这个36个B4信号作为内部标准化对照*P（P）与NTG相比<0.05。

以前，我们已经证明MHC-PPARα心脏肌细胞内中性脂质的积累与参与细胞FA摄取和TAG合成的靶基因的激活有关。因此，鉴于缺乏观察到的心肌脂质表型，我们试图确定这些基因调控程序在MHC-PPARβ/δ小鼠中是否被激活。参与细胞FA转运的基因在MHC-PPARα–LE小鼠中的表达显著上调，包括FA转运蛋白-1(工厂验收试验-1;Slc27a1公司; 2.42倍±0.09倍）和CD36型(抄送36)（2.13倍±0.09倍；图​图3B）。三B） ●●●●。此外，与对照组相比，MHC-PPARα小鼠心脏中编码几个关键TAG合成和脂肪生成酶的基因表达增加，包括甘油磷酸-3-酰基转移酶（GPAT；Gpam）、酰基辅酶A合酶（ACS；Acsl1）和FA合酶（FAS；Fasn）​（图3B）。三B） ●●●●。微粒体转移蛋白的表达(MTP；百万吨/年)该基因在MHC-PPARα心脏中也显著增加，可能是对以脂蛋白形式输出过量脂质的稳态反应。相反，在MHC-PPARβ/δ-HE小鼠心脏中，FA摄取、脂肪生成和TAG合成基因调控程序的表达没有被激活，MTP mRNA水平略有增加除外。这些结果表明，尽管线粒体和过氧化物酶体FAO中的基因激活，但MHC-PPARα小鼠（而非MHC-PPAR-β/δ小鼠）中TAG的异常积累与前者FA摄取和TAG合成中涉及的基因调控程序的差异激活有关（图​（图1B）。1B） ●●●●。

MHC-PPARβ/δ小鼠的心肌葡萄糖摄取和利用率增加。

糖尿病心脏代谢紊乱的特征包括葡萄糖摄取和利用减少，同时FA利用增加，这是MHC-PPARα小鼠的燃料利用概况(19，27). 为了评估MHC-PPARβ/δ小鼠的心肌燃料利用率，使用1-¹¹C-葡萄糖和¹¹C-棕榈酸酯作为示踪剂。令人惊讶的是，MHC-PPARβ/δ-HE小鼠的心肌葡萄糖摄取率显著增加，而¹¹MHC-PPARβ/δ-HE小鼠的C-棕榈酸与对照组相比没有差异（图​（图4A）。4A） ●●●●。使用[9,10测定从MHC-PPARβ/δ-HE小鼠和NTG对照组分离的工作心脏中的底物氧化速率-^三H] 棕榈酸酯和[U-¹⁴C] 葡萄糖。与microPET结果一致，与对照组（1676±151 nmol/min/g干重）相比，MHC-PPARβ/δ-HE心脏的葡萄糖氧化速率显著增加（2155±59 nmol/min/g干重量），而棕榈酸酯的氧化速率没有显著差异（图​（图4B）。4B） ●●●●。与日益依赖葡萄糖作为心脏基质相一致，MHC-PPARβ/δ小鼠的心肌糖原水平高于对照组（图​（图4C）。4C） ●●●●。

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图4

MHC-PPARβ/δ小鼠心肌葡萄糖利用增加。

(一个)左图：标准化摄取值-时间-活动曲线¹¹C-棕榈酸酯和¹¹通过microPET测定C-葡萄糖进入雌性MHC-PPARβ/δ-HE和NTG心脏。数值为平均值±SD。右：注射¹¹C-棕榈酸酯或¹¹C-葡萄糖。图像被归一化为注入的放射性总量和体重。示踪剂吸收的相对量，范围为0-35，由色标表示。(B类)[9,10的氧化-^三H] 棕榈酸酯和[U-¹⁴C] 在12周龄雄性MHC-PPARβ/δ-HE和NTG对照小鼠的离体工作心脏中评估葡萄糖。条形代表平均氧化速率，表示为每克干质量每分钟氧化的纳米基底。(C类)评估雄性MHC-PPARα-LE和MHC-PPERβ/δ-HE小鼠和NTG对照小鼠心脏中的糖原水平。结果显示为糖原释放的葡萄糖，并归一化为组织重量*P（P）与NTG相比<0.05。

PPARβ/δ和PPARα对参与心脏葡萄糖代谢的基因进行差异调节。

与MHC-PPARα小鼠相比，MHC-PPAR-β/δ小鼠在心肌葡萄糖摄取和利用方面存在显著差异，这促使我们比较参与心脏葡萄糖代谢的基因的表达。我们之前发现PPARα对心肌细胞葡萄糖利用的抑制作用发生在多个水平，包括抑制葡萄糖输入相关基因的表达(GLUT4公司)和糖酵解（磷酸果糖激酶[PFK公司;Pfk公司])(19，20). 相反，与对照组相比，MHC-PPARβ/δ小鼠心脏中编码GLUT4和PFK的基因表达水平显著增加（图​（图5A）。5A） ●●●●。GLUT1公司(Slc2a1系列)MHC-PPARα小鼠心脏中的基因表达增加，可能是对明显下调的GLUT4公司表达式（图​（图5A）。5A） ●●●●。GLUT1公司MHC-PPARβ/δ小鼠心脏的基因表达没有显著升高。在MHC-PPARα或MHC-PPAR-β/δ小鼠心脏中己糖激酶（HK；Hk2）mRNA的水平没有显著改变（图​（图5A）。5A） ●●●●。这些结果与底物摄取和流量数据一致，表明PPARβ/δ和PPARα对参与心脏葡萄糖代谢的基因调控程序有明显影响。

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图5

PPARα和PPARβ/δ特异性配体对心脏代谢靶基因发挥不同的调节作用。

(一个)通过RT-PCR分析测定的MHC-PPARα和MHC-PPAR-β/δ小鼠的平均心室mRNA水平（校正为36个B4表达式），表示为标准化为NTG控件值的任意单位（AU）。(B类)用非诺贝特（Feno）、L-165041（L1）或二甲基亚砜对照物治疗3天的WT小鼠心脏分离的RNA进行Northern blot（左）和RT-PCR（右）分析的代表性放射自显影。(C类)在暴露于非诺贝特、L-165041或DMSO 48小时的新生大鼠心室肌细胞中测定2-DG摄取率（平均值±SEM）。在基础、胰岛素刺激（Ins）或细胞松弛素B处理（CytB；抑制GLUT4）条件下测定2-DG摄取率*P（P）<0.05与适当的对照。

鉴于在转基因株系中发现的PPAR亚型特异性基因调控模式可能反映出慢性核受体过度表达导致的人工模式，我们接下来评估了体内激活内源性PPARα和PPARβ/δ的效果。在这些实验中，用PPARα特异性激动剂非诺贝特、PPARβ/δ特异性激动药L-165041或载体（DMSO）治疗WT（B6CBAF1/J）小鼠3天。正如在转基因小鼠中观察到的那样，用任一PPAR激动剂治疗都会导致心肌组织中MCAD公司，一个已知的PPAR靶基因参与线粒体FAO（图​（图5B）。5B） ●●●●。相反，用L-165041治疗的小鼠心肌增加GLUT4公司和PFK公司基因表达，而用非诺贝特或载体治疗的小鼠没有观察到增加（图​（图5B）。5B） ●●●●。相反，非诺贝特治疗导致GLUT4公司和PFK公司mRNA水平。与转基因模型中观察到的心肌细胞TAG积累差异一致CD36型基因表达（基于定量RT-PCR分析）由非诺贝特诱导，但不是由L-165041诱导（图​（图5B）。5B） ●●●●。

还对培养的大鼠心室心肌细胞进行了PPAR激动剂研究，以确定观察到的差异代谢和基因调节反应是直接介导还是通过心外效应介导。用非诺贝特、L-165041或载体处理肌细胞48小时，然后分析基因表达和2-脱氧葡萄糖（2-DG）摄取率。与体内研究结果一致，接触L-165041的细胞基础和胰岛素刺激的2-DG摄取率增加（图​（图5C），5C） ，伴随着增加GLUT4公司和PFK公司基因表达（补充图2），而在用二甲基亚砜或非诺贝特处理的细胞中没有观察到增加。体内研究也预测，非诺贝特和L-165041都被激活MCAD公司和M-CPT 1b型基因表达（补充图2）。总之，这些结果表明，PPAR亚型特异性激动剂在MHC-PPARβ/δ和MHC-PPAR-α小鼠心脏中观察到的代谢反应具有相同的差异模式。具体而言，PPARβ/δ和PPARα都激活了FAO途径，而PPARβ/δ的激活（而不是PPARα）激活了葡萄糖利用途径，PPARα（而不是PPARβ/δ）激活了FA摄取途径。

PPARβ/δ和PPARα对GLUT4基因转录的差异调节。

作为表征PPARβ/δ和PPARα对葡萄糖代谢基因差异调节机制的初步步骤，在培养的心室肌细胞中进行了转染研究。在这些研究中，PPARβ/δ或PPARα表达载体与含有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒共转染，该基因由2240 bp的WT人类驱动GLUT4公司基因启动子区域（GLUT4.Luc.2240；图​图6A）6A） 存在或不存在PPARα特异性（非诺贝特）或PPARβ/δ特异性（L-165041）配体。PPARα以外源性配体非依赖性方式显著抑制GLUT4.Luc.2240活性（图​（图6B）。6B） ●●●●。相反，PPARβ/δ激活了GLUT4.Luc.2240，这一效应与L-165041治疗相加（图​（图6B）。6B） ●●●●。这些结果与基因表达研究一致，表明PPARα和PPARβ/δ对GLUT4基因具有差异转录调控作用。有趣的是，PPARα介导的抑制作用不受外源性激活剂的影响，而PPARβ/δ介导的激活与L-165041的添加是相加的。后一结果表明，内源性配体对PPARβ/δ具有限制作用，和/或PPARα发挥抑制作用的机制与配体无关。

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图6

PPARβ/δ和PPARα差异调节GLUT4公司通过MEF2a反应区的基因转录GLUT4公司启动子。

(一个)GLUT4公司启动子报告结构（GLUT4.Luc.2240和GLUT4.吕c.MEF_M（M）)用PPARα或PPARβ/δ表达载体（pBOS-PARα或pCMX-PPARβ/dδ）或空载体对照共转染大鼠新生心室肌细胞。细胞与非诺贝特、L-165041或DMSO对照暴露48小时。GLUT4.Luc。MEF公司_M（M）删除启动子报告子结构，表明MEF2a结合位点已被定点突变失活。(B类)荧光素酶活性（平均值±SEM）表示为经β-半乳糖苷酶活性校正并归一化为空表达载体转染细胞值的相对荧光素单位（RLU）(n个= 12). *P（P）与空载体控制相比，<0.05**P（P）与二甲基亚砜相比<0.01；^#P（P）与二甲基亚砜相比<0.05。

我们之前已经证明，在心肌细胞中有一个特征良好的心肌细胞增强因子2a（MEF2a）位点GLUT4公司PPARα对GLUT4转录的抑制作用需要启动子(28). 为了确定PPARα和PPARβ/δ对GLUT4.Luc.2240的差异转录调控是否需要这个调控位点，我们用GLUT4公司通过定点突变（GLUT4.Luc.MEF）使MEF2a位点失活的启动子_M（M）; 图​图6A；6A；裁判。28). GLUT4.Luc可消除PPARα介导的抑制作用和PPARβ/δ介导的激活作用。MEF公司_M（M）（图​（图6B），6B） 证明差异转录调控效应需要MEF反应位点。

MHC-PPARβ/δ小鼠的产生。

在心脏α-MHC启动子下游克隆了一个含有1.0-kb PPARβ/δcDNA的cDNA构建体（克隆26；美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院研究基金会J.Robbins赠送）。通过将MHC-PPARβ/δ构建物微量注射到受精的1细胞C57BL/6×CBA/J F中生成转基因小鼠₁华盛顿大学小鼠遗传学核心的胚胎。

动物研究。

对年龄从8周到16周的雄性和雌性MHC-PPARβ/δ和同窝NTG小鼠（25-30 g体重）的心脏功能和代谢终点进行分析。这份手稿中的大多数数据代表了对雄性小鼠的研究，但图形图例中有例外。在每种情况下，对异性的独立分析都给出了相同的结果（数据未显示）。在饮食研究中，小鼠可以随意食用HF食物，HF食物提供了43%的脂肪热量（TD 97268；Harlan Teklad）。在禁食研究中，小鼠在每次实验开始时被关在单独的笼子里，禁食48小时。对照组小鼠被允许随意食用标准实验室啮齿动物食物（饮食5053；Purina Mills Inc.）。对于激动剂研究，小鼠每天口服一次DMSO、非诺贝特（100 mg/kg/d）或L-165041（10 mg/kg/d。所有动物研究都严格按照NIH动物人道治疗指南进行，并得到华盛顿大学医学院动物研究委员会的批准。

小鼠隔离工作心脏制剂。

如前所述进行小鼠工作心脏灌注(27). 简单地说，用含有5 mM葡萄糖、100μU/ml胰岛素和0.4 mM棕榈酸酯的Krebs-Henseleit溶液灌注分离的工作心脏。心肌FA和葡萄糖氧化率通过定量收集^三H（H）₂O或¹⁴一氧化碳₂由心脏灌注含有[9,10的缓冲液产生-^三H] 棕榈酸酯或[U-¹⁴C] 葡萄糖。

分离的新生大鼠心室肌细胞。

如前所述，分离新生大鼠心室肌细胞(45); 用二甲基亚砜、1μM非诺贝特或10μM L-165041刺激48小时；并进行RNA分离以进行Northern blot分析或2-DG摄取率分析。

2-DG摄取分析。

用DMSO、非诺贝特（1μM）或L-165041（10μM）刺激分离的新生大鼠心室肌细胞48小时，测定其2-DG摄取率。实验前五小时，将细胞置于无血清培养基（Optimem；Invitrogen）中。在实验前一小时，将1 U/ml胰岛素（Sigma-Aldrich）和10μM细胞松弛素B（Sigma Aldrich。细胞与含有[^三H] 2-DG（2 mCi/ml；美国放射性标记核苷酸）、10μM 2-DG、140 mM NaCl、20 mM HEPES、5 mM KCl、2.5 mM MgSO₄和1 mM CaCl₂用冰镇PBS停止反应，用50 mM NaOH溶解细胞，用闪烁计数裂解产物，并计算2-DG摄取率。

MicroPET研究。

在成像之前，老鼠被单独安置在房间里，并半禁食过夜（允许接触1粒啮齿动物食物）。第二天早上，在进行实验之前，小鼠再禁食3小时。的MicroPET成像¹¹C-棕榈酸盐和1-¹¹如前所述，在Focus 120和220（Concord microPET系统）上进行C-葡萄糖摄取和代谢(19). 简单地说，使用棕榈酸酯图像作为地标，将感兴趣区域放置在每只小鼠的心脏上。感兴趣区域根据注射的动物体重和活动进行标准化，以获得动态标准化摄取值-时间-活动曲线。对NTG和MHC-PPARβ/δ动态标准化摄取值进行分组和平均。MicroPET图像也进行了类似的标准化。

超声心动图研究。

如前所述，使用Acuson Sequoia 256超声心动图系统（Acuson Corp.）在华盛顿大学小鼠心血管表型核心对清醒小鼠进行经胸M型和二维超声心动图检查(46).

RNA分析。

使用RNAzol方法（Tel-Test）从小鼠心室中分离出总RNA。使用随机引物用QuikHyb（Stratagene）进行Northern印迹分析³²P标记的cDNA克隆。使用STORM磷光成像仪（GE Healthcare）量化带强度，并使用ImageQuaNT5.2软件将其归一化为36B4的表达。使用ABI Prism 7500序列检测系统和Applied Biosystems提供的试剂进行实时定量RT-PCR。信号强度标准化为36B4的表达。

免疫印迹研究。

心脏总蛋白的制备如前所述(47). 使用兔多克隆PPARβ/δ（H-74）抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.）和兔多克隆抗GLUT4抗体（华盛顿大学医学院M.Mueckler赠送）进行Western blot分析。通过测量SuperSignal Ultra（Pierce）测定的化学发光信号进行检测。

组织学分析。

收集小鼠心脏，将心肌的中室横截面切片浸入Tissue-Tek OCT复合物（Sakura Finetek USA Inc.）中，并在冷冻模具中使用Cytocool II（Richard-Allan Scientific）进行切片。切片用油红O染色以检测细胞内中性脂质积聚。

心肌TAG水平。

如前所述，ESI/MS用于量化心肌TAG水平(48). 简单地说，使用改良的Bligh和Dyer技术从小鼠心脏提取脂质，随后在正离子模式下对TAG物种进行分析。

糖原测量。

将来自8周龄雄性和雌性MHC-PPARβ/δ和NTG小鼠的小鼠心脏组织在液氮下粉碎，并在0.3 M高氯酸溶液中均质。然后在50 mM醋酸钠（pH 5.5）和0.02%牛血清白蛋白中，使用和不使用淀粉糖苷酶消化（Sigma-Aldrich）对肌肉提取物进行分析。将340 nM时产生的吸收变化与0–80μmol葡萄糖的标准进行比较。结果显示为糖原释放的葡萄糖，并归一化为组织重量。

启动子研究。

GLUT4公司发起人报告人构建（GLUT4.Luc.2240；由美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学J.Pessin善意提供；以及GLUT4.Luc.MEF_M（M）)用PPARα或PPARβ/δ表达载体（pBos-PARα或pCMX-PPARβ/dδ）或空载体对照（pEFBOS或pCMX）共同转染大鼠新生心室肌细胞。用PPARα特异性（非诺贝特）或PPARβ/δ特异性（L-164041）激动剂或DMSO对照刺激细胞48小时。针对SV 40β-半乳糖苷酶（500 ng/ml）校正相对荧光素酶单位中的荧光素酶活性，并将其归一化为空载体对照转染细胞的值。

心肌I/R研究。

对小鼠进行麻醉（氯胺酮/甲苯噻嗪）、手术准备并在哈佛啮齿动物呼吸器上进行通气。暴露心脏后，移除心包，并在左前降动脉下方通过带有U形针的9-0聚丙烯缝合线。缝合线系在一根PE-10导管上，以阻塞左前降动脉30分钟。在闭塞期之后，小心地移除PE-10管以允许再灌注。然后关闭胸腔，老鼠恢复了健康。再灌注24小时后，再次将小鼠麻醉，并皮下注射肝素（1 U/g）。打开腹腔，将肝素/KCL混合物注入下腔静脉以阻止心脏跳动。然后通过切断肾动脉给老鼠放血。结扎颈动脉，插管降主动脉，用磷酸盐缓冲液灌注心脏，然后再灌注1%的TTC（Fisher）。然后在原始位置重新封闭左前降动脉，并灌注1%Evans Blue Dye（Sigma-Aldrich）。将心脏取出，在-20°C下冷冻1小时，切成5片，并在4°C下用4%中性缓冲福尔马林固定过夜。在福尔马林中放置24小时后，称重心脏切片。使用佳能Power Shot A80数码相机拍摄了所有切片每一面的图像。使用图像工具软件（UTHSCSA）对每个图像进行分析。通过平均每个切片的两侧并将其归一化为切片重量来量化面积。接下来，将风险区域计算为左心室不含蓝色染料的部分。计算了该危险区域内梗死组织（白色区域）的百分比（见图​图7）。7).

我们感谢玛丽·温盖特（Mary Wingate）在手稿准备方面的协助，特里·夏普（Terry Sharp）在微PET研究方面的技术协助，布赖恩·芬克（Brian Finck）的有益讨论，以及特蕾莎·利昂（Teresa Leone）对手稿的评论。所有组织学研究均在华盛顿大学消化疾病研究中心进行。转基因小鼠是在华盛顿大学糖尿病和研究训练中心（P60 DK020579）的支持下产生的。E.M.Burkart得到了美国心脏协会（Heartland Affiliate）的医学研究金支持。这项工作得到了NIH拨款P50 HL077113和P01 HL057278的支持。