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美国国家科学院院刊。2007年11月6日；104(45): 17692–17697.
2007年10月25日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0707045104
预防性维修识别码：PMC2077040型
PMID：17962413

Gata2、Fli1和Scl在早期造血发育过程中形成递归连接的基因调节回路

约翰·皮曼达,*†‡ 凯特琳·奥特斯巴赫,* 凯西·克内泽维奇,* 莎拉·金斯顿,* 陈婉妍（Wan Y.I.Chan）,* 尼古拉·威尔逊,* 约塞特·雷内·兰德里,* 安德鲁·伍德,* 安贾·科尔布·科科辛斯基,§ 安东尼·格林,* 大卫·坦纳希尔,§ 乔治·拉科德, 瓦莱丽·库斯科夫,和伯托尔·戈特根斯*‡
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补充资料

摘要

脊椎动物身体计划的保存被归因于基因调控网络（GRN）的进化稳定性。我们描述了由Gata2、Fli1和Scl/Tal1及其增强子组成的调控电路，大门2-3,飞行1+12，和Scl公司+19，在小鼠胚胎造血规范期间操作。我们展示了飞行1+12个增强器，如大门2-3和Scl公司+19个增强子以造血干细胞（HSC）为靶点，依赖Ets、Gata和E-Box基序的组合。我们展示了Gata2-3型增强子也使用类似的基序簇，Gata2、Fli1和Scl在HSC起源的胚胎第11.5天背主动脉和它们繁殖的胎肝中表达。这些组织和ES细胞衍生的血管母细胞等效物中的三种HSC增强子都与这些转录因子（TF）结合并形成一个完全连接的三元组，该三元组构成了之前未描述的哺乳动物发育中的网络基序和在哺乳动物干细胞规范期间操作的GRN内核的示例。

关键词：成血管细胞，造血，造血干细胞，网络基序，转录因子网络

造血干细胞（HSC）代表了最具特征的成人多能干细胞群体，具有大量的标记物和生物（克隆形成和移植）分析，以识别长期再生的HSC，并将其与自我更新潜力有限的多能干祖细胞区分开来(1). 转录调控是控制HSC形成和随后行为的关键机制(2). 功能的获得和丧失研究已经确定了许多转录因子（TF），包括Scl/Tal 1(三,4)，加塔2(5)和Runx1(6,7)作为HSC发展的关键监管机构。值得注意的是，许多这些转录因子的破坏有助于血液系统恶性肿瘤的发病机制，强调了正常和白血病干细胞转录调控的重要性。

生物复杂性与基因数量无关，而是与基因调控的复杂性有关(8). 增强子和其他顺调控元件在基因的协调表达中起着核心作用，已经确定了一些关键HSC TF的组织特异性调控元件，如Scl和Gata2(9–13). 然而，从对非脊椎动物模型生物的研究中可以清楚地看出，例如果蝇属而海胆，为了理解发育过程，有必要超越对单个基因的研究，确定调控基因如何相互作用以形成功能基因调控网络（GRN）（参考文献综述）。14).

对海胆内中胚层GRN的综合分析表明，它们由由TF基因及其靶向顺调控模块组成的亚回路集合构成，每个亚回路在发育过程中都具有不同的调控功能(15). 这些子电路的链接是高度递归的，每个顺调控模块都从构成子电路的多个TF接收输入。在建筑车身部件中执行基本功能的子电路被称为GRN的核心(16). 构成内核的TF的破坏通常会导致身体部分的丢失，因此内核的基本结构在进化过程中高度保守(16).

小鼠正常造血需要Scl、Gata2和Ets因子Fli1（参考文献。17)并在禽类造血簇中表达(18)青蛙和斑马鱼胚胎的造血中胚层前体(19,20). 在本文中，我们描述了一个由Gata2、Fli1和Scl组成的GRN内核，以及它们各自的顺调控模块。使用转基因小鼠和体内通过对胚胎造血组织进行ChIP分析，我们证明该GRN核在小鼠主动脉-性腺-中胚层（AGM）区域和妊娠中期胎肝（FL）HSC规范的关键阶段起作用。

结果

这个飞行1+12造血增强剂靶向胚胎中的长期造血干细胞。

我们之前已经确定飞行1+12个增强子指导lacZ公司F对血液和内皮的表达0转基因胚胎(21). 然而，尚不清楚飞行1+HSC的12个增强子靶向表达就其本身而言。要评估体内的活动飞行1+12个增强子，我们建立了稳定的转基因株系（L5760和L5754），其创始人使用人类500-bp片段产生FLI1公司+SV最小启动子下游克隆的12个位点和lacZ公司记者（SV/lacZ公司/FLI1+12英寸图1A类i） ●●●●。对原肠化胚胎第7.5天（E7.5）胚胎的整体分析显示，转基因在胚胎外中胚层区域表达，这是早期卵黄囊原始造血的特征（比较图1A类iii与图1A类ii）。这一发现与造血组织和血管系统在发育后期的表达一致(图1A类iv–xiii）。

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这个FLI1公司+12种造血增强剂以造血干细胞为靶点。(A类)FLI1公司+12增强子将报告者的活动导向血液和血管。（i） 人体示意图FLI1公司轨迹。对应于FLI1公司+用12个区域构建转基因小鼠。（ii–vii）E7.5–E12.5 X-镀锌全安装WT和L5760SV公司/lacZ公司/FLI1公司+12个胚胎。（ii）无染色的E7.5 WT胚胎。（iii）E7.5转基因胚胎在胚胎外造血区域内染色。（iv）E9.5转基因胚胎，心脏室（盒装）和卵黄血管染色（箭头所示）。（v） E11.5转基因胚胎显示FL（箭头）和血管内染色。（vi）E12.5转基因胚胎，卵黄血管染色（箭头所示）。（vii）vi中方框区域的放大图，显示FL染色（箭头）。（viii–xiii）E11.5的石蜡切片SV公司/lacZ公司/FLI1公司+12胚胎。（viii）DA的矢状切面显示内皮染色。（ix）DA高倍视图，显示造血簇染色（箭头）。（x） FL切片显示造血细胞染色。（xi）通过卵黄囊的x（xii）截面的高倍视图，显示血管壁上有染色。（xiii）心脏切片显示心内膜染色。(B类)流式细胞术检测FDG处理的非转基因和转基因E12.5 FLSV公司/lacZ公司/FLI1公司+12个（L5760）×WT交叉。CD150型+/CD48型−/CD41细胞−细胞在转基因靶向人群中富集。YS，卵黄囊。

为了确定飞行1+12个增强子靶向表达FL HSC，我们首先表征了SV靶向FL细胞的表面表型/lacZ公司/FLI1公司+12转基因。每5.7 CD150一个+/CD48型−/CD41型−FL细胞在受照小鼠中进行长期多系重建(22). 从E12.5胚胎中制备FL细胞悬液，并用荧光β-半乳糖苷酶底物荧光脱氧染色-d日-葡萄糖（FDG）。如所示图1B类，≈3%的SV FL细胞/lacZ公司/FLI1公司+12个转基因胚胎表达转基因。大约0.034%的E12.5 FL电池具有CD 150+/CD48型−/CD41细胞−表面表型(图1B类i） 和目标细胞FLI1公司+12个增强子富集于该表型（比较图1B类我和图1B类iii）。此外，转基因靶向细胞显示血统承诺的CD150相对较少−/CD48型−/CD41细胞−单元格（比较图1B类ii带有图1B类iii）。我们接下来表演在体外菌落分析建立多系潜力lacZ公司-负值和lacZ公司-阳性细胞。如所示支持信息（SI）表1,lacZ公司-阳性细胞富集为髓系和红系集落形成细胞。然而，菌落分析不能识别真正的HSC。因此，我们使用辐照成年小鼠作为受体进行了长期重建实验。

来自SV的E12.5 FL细胞悬浮液/lacZ公司/FLI1公司+用FDG对12个转基因胚胎进行染色，并根据FDG的相对水平设置两个分选区lacZ公司表达式。不同数量的已排序FDG+和FDG−用2×10将细胞输注到受辐射的小鼠体内5非转基因脾细胞提供短期辐射防护。移植后6个月，通过PCR分析供体外周血，检测供体细胞植入情况lacZ公司转基因。两个实验的累积结果表明lacZ公司移植后6个月以上，10只受体小鼠中约1/3（5/15）检测到转基因4FDG公司+单元格(SI表2). 相比之下，捐赠者lacZ公司8例1×10移植受者中，0例检测到转基因5FDG公司−细胞和5×10移植受体中的一个5FDG公司−细胞。确定是否移植FDG+采用半定量PCR方法对多系造血移植后的FL细胞、所有重组受体的造血组织和纯化细胞进行lacZ转基因分析。重组受体的造血组织含有10–100%的供体来源细胞（数据未显示）。综上所述，这些数据表明SV/lacZ公司/飞行1+12个结构体针对大多数能够长期多系重组的FL-HSC。

中的Ets和Gata绑定主题飞行1+12其活动需要HSC增强剂。

我们之前已经证明，高度保守的Ets和Gata位点簇对Scl和Lyl1基因的早期造血调节元件的活性至关重要(17,23). Ets和Gata位点的聚类[两个Ets和一个Gata位点具有定义的间距和方向约束，构成Ets/Ets/Gata（E/E/G）特征]可以在全基因组计算屏幕中利用，以识别新的造血干/祖细胞元件(21,24). 这个飞行1+12增强子(图2A类)除了E/E/G（E5/E4/G1）标记外，还具有另外六个高度保守的Ets位点、一个额外的部分保守的Gata位点和一个E-box（Scl的共有结合位点）。我们之前已经证明，删除包含E/E/G特征的89-bp核心（+11430/+11521）将取消增强子活性(21). 为了确定各种保守的Ets、Gata和E-box基序的相对贡献，分别和联合引入突变，并在416B造血祖细胞中测试增强子的活性(图2B类). WT和突变结构体的活性相对于包含SV最小启动子的pGL2启动子载体的活性进行了表达。

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中的保守Ets和Gata TF结合位点FLI1公司+造血细胞中的活性需要12种增强剂。(A类)的核苷酸序列比对FLI1公司+12个增强子，分别用红色、蓝色和粉红色标记保守的Gata、Ets和E-box位点。核苷酸编号来自翻译起始点。mm，鼠标；hs，人类；md，负鼠。(B类) (左侧)报告人构建的人类WT和突变基因组片段对应于FLI1公司+12增强子。保守的Ets、Gata和E-box位点表示为圆圈（部分保守的虚线边缘），分别编号为E1-8、G1-2和EB；它们在突变处被划掉。(赖特)在416B细胞中对每个构建体进行稳定转染分析的结果。荧光素酶活性是pGL2启动子载体（SV）活性的倍增-卢克)独自一人。(C)F小结0用多种方法产生的转基因胚胎SV公司/lacZ公司/突变体FLI1公司+12个构造。还显示了具有代表性的X-Gal染色全山E11.5胚胎。（+）到（++++）表示从周/罕见到强X-Gal染色。

有趣的是，突变E4/E5（Ets位点是Scl公司+19个标记）废除了增强子活性，而同样保守的E2/E3或E6/E7突变则没有效果。同样，对高度保守的GATA位点G1进行突变，可消除增强子活性，而仅对G2进行突变则没有效果。值得注意的是，虽然部分保守的GATA位点G2和E-box单独突变没有影响，但这两种基因的缺失都会使增强子的活性降低≈1/3。

转基因报告分析(图2C)突变体的FLI1公司+12种元素证实结合位点在ΔFLI1公司+还需要12个地区体内增强子的活性。突变的E4/E5导致完全没有血液/内皮/心内膜活性。可能由于某种程度的补偿，G1或G2/E-Box位点突变导致部分胚胎背主动脉（DA）和FL轻度/中度染色。然而，染色明显少于WT胚胎（比较图1A类具有SI图6).

全基因组计算分析组大门2-3区域与飞行1+12 E/E/G监管要素。

使用内部保守Ets、Gata和E-box基序的数量体内已验证飞行1+12造血增强子作为一种指标，我们对相关元素进行了一系列全基因组计算筛选(SI表3和表4). 有趣的是，所有四个屏幕都返回了加塔2IS启动子作为潜在匹配。这个大门2-3区域包含3.1-kb的5H区域Gata2-EHRD公司先前证明的启动子片段对于血源性DA中Gata2的表达是充分和必要的(9). 该元素的活性仅归因于保守的Gata位点，但其与飞行1+具有多个Ets、Gata和E-Box基序的元素的屏幕中的12个增强子表明，这些其他保守位点也可能具有重要的功能。

Ets绑定主题对于大门2-3增强活动。

的5H区域（−3097到−2762）大门2-3增强剂(图3A类)之前已经证明，报告基因的活性靶向尾部DA，即胚胎中HSC的起源部位，这种活性依赖于Gata结合基序G1、G2、G4、G5和G6(9). 与这些保守的Gata基序交织在一起的是一些保守的Ets基序和E-box基序(图3A类). 此配置与Scl公司+19,飞行1+12，和六角螺母+1增强子，由造血祖细胞中Ets因子和Gata2的组合调节体内(17,21). 为了检测这些Ets和E-box基序的相对重要性，从人类DNA中PCR扩增了一个与小鼠−3126/−2631增强子相对应的片段，并在荧光素酶报告子pGL2p中亚克隆了SV最小启动子上游。分别引入突变和组合突变，并在416B造血祖细胞的稳定转染中进行测试(图3B类). 单个Ets位点E1和E7的定点突变对增强子的整体活性几乎没有影响，而E2和E5以及E-box的突变使活性降低约1/3。增强子核心内E2–E6的突变足以消除增强子活性。

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保守的Ets-TF结合位点大门2-3造血细胞的活性需要增强子。(A类)鼠标示意图加塔2与分别用红色、蓝色和粉红色标记的保守Gata、Ets和E-box位点的基因座和核苷酸序列比对。−3126/−2631米大门2-3区域包括3.1-kb的5H区域（−3097/−2762）Gata2-EHRD公司(9). 核苷酸编号来自小鼠is外显子。mm，鼠标；hs，人体；医学博士，负鼠。(B类) (左侧)报告者构建人类WT并突变大门2-3基因组片段。保守的Ets位点和E-box分别用编号为E1–E7和EB的圆圈表示；它们在突变处被划掉。(赖特)在416B细胞中对每个构建体进行稳定转染分析的结果。荧光素酶活性是pGL2启动子载体（SV）活性的倍增-卢克)独自一人。

评估Ets结合基序的作用体内，的大门2-3增强子片段被克隆到SV最小启动子上游(大门2-3/SV公司/lacZ公司在里面图4A类)在中lacZ公司报告载体和F测试0变性人。八个转基因胚胎中有四个在尾部DA中看到转基因表达(图4B类i–iii）。相比之下，六个转基因胚胎中没有一个是由GATA2协议E2–E6 Ets结合基序（mEts）的靶向突变片段大门2-3/SV公司/lacZ公司)显示了DA中的记者活动(图4 A类和B类iv–vi）。

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这个Gata2-3型增强子靶向血源性主动脉内皮，并需要Ets位点体内活动。(A类)转基因lacZ公司报告者使用WT增强器构建(大门2-3)或具有突变Ets位点（mEts）的增强子大门2-3). E10.5和E11.5 F总数中DA（AGM区域）或中脑染色的胚胎数量0每个构建体产生的转基因胚胎并列在一起。(B类)代表F0用X-Gal染色的胚胎lacZ公司表达式。（i）大门2-3/SV公司/lacZ公司E10.5整体安装，显示DA染色（装箱）。（ii）i中方框区域的放大视图，显示报告者沿DA腹侧表面的集中（箭头）。（iii）与（ii）中区域相对应的组织切片，显示出明显的内皮染色（箭头）。（iv）mEts大门2-3/SV公司/lacZ公司E11.5在DA区域显示非特异性染色的完整胚胎（装箱）。（v） iv.（vi）中与v中区域相对应的截面中方框区域的放大视图显示没有内皮染色。(C)X-Gal染色F的头部放大侧视图0胚胎B类.（i）大门2-3/SV公司/lacZ公司全山胚胎突出lacZ公司表达于后连合（方框箭头）和顶盖神经元进入中脑（箭头）。（ii）mEts大门2-3/SV公司/lacZ公司整个mount胚胎显示丢失我acZ染色。上颌部异位染色仅见于六个F中的一个0突变的转基因胚胎。（iii）Scl公司-第七届E3/lacZ公司整个胚胎显示出类似于大门2-3/SV公司/lacZ公司转基因。D、 间脑；ME，中脑；PC，后连合；T、 端脑。

全长3.1-kbGata2-EHRD公司启动子片段将报告活性导向胚胎中的神经和造血组织(9). 496个基点大门2-3增强子片段和异源启动子（SV最小启动子）也将报告活性导向神经组织(大门2-3/SV公司/lacZ公司在里面图4 A类和Ci） ●●●●。相比之下，用缺失E2–E6 Ets位点（mEts）的突变转基因产生的转基因胚胎大门2-3/蒸汽发生器/lacZ公司在里面图4A类)中脑没有活动(图4Cii）。因此，5H区域内的Ets位点对造血和中脑活动都是必需的大门2-3增强剂。此外，该增强子的神经活性与Scl公司启动子近端增强子1a和1b，也受Ets和Gata TFs调节(图4Ciii）(11).

在体内表达式分析和增强子占用与递归有线监管网络一致。

在小鼠发育过程中，第一个长期重建的HSC被认为是从E10.5的AGM区域的DA底部产生的。这些假定的HSC被认为是血簇，并被认为来源于主动脉内皮或潜在的间质。随后，佛罗里达州和其他地区的HSC数量有所增加（参见参考文献。25). 使用就地杂交结果表明，Scl、Gata2和Fli转录物均存在于DA底部的造血动脉簇、主动脉内皮和E11.5处的FL细胞中，这与它们在造血中的基本作用一致(图5A类). 正如所料，Gata2、Fli1和Scl的表达模式并不相同。例如，只有Scl在DA和FL的大多数循环血细胞中表达，与Scl（但不是Gata2或Fli1）在红系祖细胞中的表达相对应，后者构成E11.5的主要血细胞类型。然而，DA内皮细胞和血簇的共表达与我们对上述突变增强子结构的转基因分析所建议的交叉调节一致。

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Gata2、Fli1和Scl绑定大门2-3,飞行1+12和Scl公司+19体内. (A类)（i和ii）现场Scl表达的杂交。（i） 在AGM水平对E11.5胚胎进行横向冷冻切片，显示FL、DA（装箱）和神经组织中的表达（箭头所示）。（ii）显示内皮细胞和血簇中表达的方框区域放大图（箭头所示）。（iii和iv）现场Gata2表达的杂交。（iii）通过E11.5胚胎AGM区域的横向冷冻切片，显示Gata2在FL和DA中的表达（装箱）。神经组织中也可见显著的Gata2表达（箭头所示）。（iv）iii中方框区域的放大图，显示Gata2在内皮细胞和血簇中的表达（箭头所示）。（v和vi）现场Fli1表达的杂交。（v） 通过E11.5胚胎AGM区域的横向冷冻切片显示Fli1在FL中表达。（vi）通过AGM区域进行的横向石蜡切片显示内皮和血簇中表达（箭头）。(B类)（i–iii）对E11.5胚胎的血祖细胞（416B）、内皮细胞（MS1）细胞系和初级造血组织（腹主动脉和FL）进行ChIP分析。将富集水平标准化为用对照兔抗体获得的富集水平，并绘制为在对照区测量的富集水平的倍数增加(Scl公司+21). (C)期间Gata2、Fli1和Scl基因表达的变化在体外GFP-Bry ES细胞向EBs的分化。(D类)定量ChIP分析在体外分化的未分类GFP-Bry EBs，其中约49%的细胞为GFP+法兰1+第3天（DP）(SI图7). (E类)造血TF的完全连接三联体。具有假定起始物的Gata2/Fli1/Scl三联体。直接结合相互作用用实线表示。

关联转基因体内增强剂活性体内使用特征明确的抗体进行TF占用率和ChIP实验（参见SI材料和方法有关详细信息，请使用剖切的妊娠中期DA和FL，以及造血祖细胞（416B）和内皮细胞系（MS1）(图5B类). 在解剖的造血组织中，Gata2、Fli1和Scl在大门2-3,飞行1+12，和Scl公司+19种增强剂Scl公司+21（没有已知增强子活性的区域）。在AGM区域或FL细胞的三个HSC增强子中，所有三个TF在每一个都富集了至少2倍。值得注意的是，尽管HSC在这些部位富集，但并非解剖组织中的所有细胞都是HSC。TF浓缩大门2-3,飞行1+12，和Scl公司+显示19个克隆性血液祖细胞（416B）和内皮细胞（MS1）细胞群进行比较。

分化后，培养中的ES细胞形成集落，称为类胚体（EBs），含有中胚层（Brachyury+)显示血液和内皮潜能的祖细胞[原始集落形成细胞（BL-CFC）](26). 这个短暂的群体（分化的第2.5-4天）代表了在体外相当于卵黄-海绵状血管母细胞。ES/EB模型系统已应用于ES细胞系，其中GFP靶向Brachyury公司基因座（GFP-Bry ES）(27). 根据GFP和法兰1表达，可以确定三种不同的细胞群体，GFP−法兰1−（DN），GFP+法兰1−（SP）和GFP+法兰1+（DP），其代表从中胚层前（DN）到成血管细胞前中胚层（SP）再到成血管细胞（DP）的发育进程。Gata2、Fli1和Scl的表达在具有成血管细胞潜能的细胞中显著上调(图5C). 为了评估HSC增强子处的TF结合，在EB第3天进行ChIP分析。相对于对照区，所有三种TF在三种增强子中的每一种都富集了至少2.5倍，Scl公司+21 (图5D类).

综上所述，这些数据与胚胎中HSC规范化期间运行的递归连接基因调控亚电路一致(图5E类).

讨论

自寒武纪早期（约5.4亿年前）以来，基本身体计划几乎没有发生进化变化(16). 这种显著的保守性归因于GRN核的进化稳定性，GRN核指定了身体的各个部位。在这两者中使用的核心字段规范内核果蝇属和脊椎动物(28)[原口和后口分裂≈7亿年前(29)]以及海胆和海星（海星上一个祖先在5亿多年前）共有的内胚层内核(15)，显示由不保守的网络链接包围的核心子电路的保守(16). 基于顺调控模块的序列保守性和TF在明确明确造血中的要求，我们在这篇手稿中描述的GRN核可能自大约4亿年前放线鱼（斑马鱼）和哺乳动物的分化以来就存在了(29)并且可能更古老，因为调节造血的几个关键成分在哺乳动物和果蝇属经过约7亿年的进化。果蝇属Gata因子（蛇）在使中胚层细胞参与血细胞命运中起着核心作用，是小鼠造血Gata因子Gata1、-2和-3的功能同源物(30).尖果蝇调节幼虫循环血细胞的数量(31)是Ets蛋白的定点结构域亚家族的原型飞行1是成员。A类果蝇Scl同源物（HLHB3）存在，但其在造血中的作用尚未得到严格评估(32).

造血内皮细胞的发育是Notch 1调节的事件，在Notch 1缺陷小鼠胚胎中受损(33). Notch 1和Gata2在E10.5处共同表达于主动脉底部内皮细胞中，Notch 1结合Gata2启动子，在胚胎最终造血开始时充当Gata2表达的上游调节器(33,34). 因此，作为Gata2表达的功能相关上游调节因子，Notch 1是电路的潜在启动子(图5E类). 在斑马鱼胚胎中，Notch 1是信号级联的一个组成部分，涉及Hedgehog和Vegf，需要指定DA和血干细胞(35,36). 在E11.5胚胎中，Bmp4转录物也集中在DA的腹侧(24). Gata2启动子响应Bmp4信号(37)，它也会启动飞行1-中的表达式爪蟾因此，Bmp4是电路的另一个候选启动器(图5E类). 血统标记研究爪蟾已经证明，背侧板（DLP）中胚层产生DA和附着在DA底部的细胞簇，可能代表HSC并表达Gata2、Scl和X（X）fli1.骨形态发生蛋白（BMP）信号是背侧板（DLP）形成所必需的，而BMP信号的中断会导致X（X）fli1和Scl表达(38).

我们之前已经报道过，Gata2和Fli1在胎儿造血过程中通过结合Scl公司+19和飞行1+分别有12种增强剂(17,21). 我们现在证明Scl也结合并调节这两种增强子。众所周知，Gata2负责管理大门2-3造血增强剂(9). 我们的数据显示，Fli1和Scl也将大门2-3增强并调节其活性。最近发现的Gata2内含子内皮增强子(39)有一组Gata、Ets和E-Box图案，并始终与大门2-3全基因组计算分析中的造血增强因子(SI表4). 在对Gata位点进行研究之前，Gata2内含子内皮增强子的全部活性取决于Ets和E-Box基序，Scl-E12异二聚体与E-Box基序结合在体外(39). 这个Scl公司+19元素没有E-Box基序，但Scl在FL细胞和原始集落形成细胞（BL-CFC）中富集于此元素。值得注意的是，包括Scl、Lmo2和Gata3在内的蛋白质复合物已被证明仅通过GATA位点结合DNA(40)以及−3.7-kb HS1内Gata–E-Box复合元件中的E-Box图案Gata1公司增强剂对于体内Gata1/Scl/Lmo2/Ldb1/E2A复合物的结合(41). 综上所述，Notch和/或Bmp可能启动Gata2和Fli1表达，然后自动调节并结合启动Scl。在Bmp和Notch信号停止后，这三个因素可以在HSC中维持彼此的表达。

大型集成转录网络由较小可识别网络基序的重复模式组成，这些基序的结构已在大肠杆菌和酿酒酵母(42). 血液/内皮祖细胞中的GRN内核最符合完全连接的三联体（也称为团），这种三联体在低等生物中很少见。此外，如果如我们的数据所示，所有这些相互作用都是积极的，那么Gata2/Fli1/Scl三元组将显示出锁定到ON状态的趋势(图5E类). 因此，完全连接的三联体将有能力赋予新指定的HSC“记忆”，使其在离开AGM生态位（可能接收启动电路的Notch/Bmp信号）并转移到FL，最终转移到骨髓生态位时保持多能性。单个TF的稳态动力学、它们触发表达的阈值浓度以及组合结合的要求都可能是HSC中此回路达到平衡的因素。有趣的是，Gata1已被证明通过精确地结合到大门2-3区域和调节区域染色质重塑(43). 这种Gata开关被认为是抑制HSC中Gata2表达并诱导分化的机制。在细胞分化过程中必要时，这种机制和其他机制可能在HSC中起作用，以解锁Gata2/Fli1/Scl三联体。

值得注意的是，尽管完全连接的三联体在原核网络中非常罕见（这些基序已经被系统地研究过），但它可能被用于后生动物的转录网络，以将干细胞“硬连接”到干细胞中。TFs Oct4、Sox2和Nanog在维持ES细胞的多能性方面发挥着关键作用，并且ES细胞中这些基因的启动子受到所有三个因素的结合体内(44). 这些基因及其启动子可能代表了完全连接的三联体的另一个例子，但所有的调控输入首先需要通过适当的转染和转基因检测进行验证。

打开Gata2/Fli1/Scl三元组可能是指定HSC的先决条件。一旦建立，该电路可以维持其成分TF的表达，进而调节造血所需的其他基因，并与指定各种造血谱系的基因分化电池相互作用。

材料和方法

硅胶材质保守结合位点簇的鉴定。

如参考文献所述，使用TFBScluster鉴定保守TF结合位点簇。21.

Reporter构造。

从人类基因组DNA中扩增出候选增强子序列。使用错配的寡核苷酸通过PCR产生突变，并通过DNA测序进行验证(SI材料和方法和参考。13).

转基因分析和组织学。

F类0转基因小鼠胚胎是通过原核注射lacZ公司记者片段(13).现场用地高辛标记的核糖探针进行杂交，并用碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体进行检测(45).

细胞转染和分析。

对于416B稳定转染，共电穿孔10μg线性质粒DNA和1μg线性pGK-neo。通过添加500μg/ml G418在24小时时选择转染细胞，并在2周后进行检测(17).

FACS公司。

E12.5 FLs（L5760×WT）的单细胞悬浮液按SI材料和方法和参考。13.FDG公司+和FDG−对活细胞群体进行分类在体外集落和移植分析(10,13).

体外菌落分析。

对分选的E12.5 FL细胞进行计数，并在添加细胞因子的Methocult GF-3434中培养，以形成红系和髓系集落(10). 请参见SI材料和方法了解详细信息。

移植试验。

对分选的E12.5 FL细胞进行计数，将其悬浮在PBS中，并注入3-5个月龄辐照（CBA×C57Bl/6）F的尾静脉1小鼠和2×105用于辐射防护的非转基因脾细胞(10). 请参见SI材料和方法了解详细信息。

ES细胞培养与分析。

维持和分化Bry-GFP-ES细胞，如参考文献所述。27。请参阅SI材料和方法了解详细信息。

ChIP分析。

请参见SI材料和方法了解详细信息。

补充材料

支持信息：

鸣谢

我们感谢Aimee Parker在胚胎解剖方面的帮助；Paula Braker、Sandie Piltz和Michelle Hammett用于生成转基因小鼠并帮助移植；Rachael Walker寻求FACS帮助；Martin Gering、Aldo Ciau-Uitz、Uri Alon、Diego Miranda-Saavedra和Brian Huntly进行了有益的讨论；以及Catherine Porcher（英国牛津大学），以获取ChIP中使用的抗Scl抗体。这项工作得到了白血病研究基金、生物技术和生物科学研究委员会、Wellcome信托基金的资助，以及国家卫生和医学研究委员会（澳大利亚）（给J.E.P.）、凯·肯德尔白血病基金（给K.O.）和加拿大卫生研究院（给J.R.L.）的研究金。

缩写

年度股东大会主动脉-性腺-中层肾
陆军部背主动脉
E类n个胚胎期n个
电子束胚状体
FDG公司氟脱氧-d日-葡萄糖
飞行胎儿肝脏
GRN公司基因调控网络
HSC公司造血干细胞
TF公司转录因子。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0707045104/DC1.

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院