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基因发育。2007年10月15日；21(20): 2593–2606.
数字对象标识：10.1101/加1592107
PMCID公司：PMC2000324项目
PMID：17901218

以下方面的要求博士中枢神经系统轴突束的形成揭示了皮质纹状体边界是皮质轴突的选择点

A.约瑟夫·布卢姆,1 布拉德利·R·米勒,1 约书亚·R·桑斯,2和亚伦·迪安东尼奥1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

博士是无脊椎动物泛素连接酶基因中唯一保存良好的小鼠同源基因钢索（英寸果蝇属)和转速-1（英寸秀丽隐杆线虫). 的功能和作用机制钢索和转速-1是相似的两种细胞，通过下调丝裂原活化蛋白激酶激酶双亮氨酸拉链激酶（MAPKK-DLK）的同源基因，自主调节突触发生。在这里，我们使用靶向条件突变体证明博士在哺乳动物神经发育中也起着重要作用。与无脊椎动物一样，博士细胞自主地塑造运动神经末梢。此外，博士在中枢神经系统主要轴突束（包括内囊轴突束）的形成中发挥重要作用，部分通过细胞自主机制，这些结果揭示了皮质轴突在皮质纹状体边界的选择点。此外，尽管钢索和转速-1因失去DLK公司苍蝇和蠕虫，博士-依赖性中枢神经系统缺陷持续存在博士,DLK公司双突变体。因此，在哺乳动物的神经系统中第1页通过一种细胞自主和独立于DLK公司.

关键词：轴突引导、突触形成、内囊、神经肌肉接头、DLK

博士是调节突触生长和形态的无脊椎动物泛素连接酶的单一小鼠直系同源物。损失高线，这个果蝇属正交，导致幼虫神经肌肉接头（NMJ）突触显著过度生长和生理缺陷(Wan等人，2000年;DiAntonio等人，2001年)，而秀丽隐杆线虫正交曲线转速-1导致突触前活动区的形态、间距和数量缺陷(Schaefer等人，2000年;Zhen等人，2000年). 这种突触功能在脊椎动物中是保守的电子只读存储器斑马鱼直系图博士，在视网膜盖层标测过程中显示突触靶点选择缺陷(D’Souza等人，2005年). PHR家族的所有这些功能都是细胞自主的，可能反映了神经末梢中蛋白质的作用(Schaefer等人，2000年;Zhen等人，2000年;D'Souza等人，2005年;Wu等人，2005年). PHR家族成员与许多候选靶点相互作用，这与大的多域蛋白相适应(Guo等人，1998年;McCabe等人，2004年;Pierre等人，2004年;Murthy等人，2004年); 然而，遗传数据表明，Highwire/RPM-1的一个关键底物是丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKKK），称为Wallenda果蝇属和DLK（双亮氨酸拉链激酶）秀丽线虫在蠕虫和苍蝇中，这种激酶的水平在缺乏钢索/转速-1，突触缺陷钢索/转速-1突变体因丢失沃伦达/DLK增加Wallenda/DLK水平足以观察钢索/转速-1突变体(Nakata等人，2005年;Collins等人，2006年).

评估博士在哺乳动物的神经发育过程中，我们产生了一个有针对性的条件博士小鼠中的敲除等位基因。有条件切除博士运动神经元的研究表明，与无脊椎动物一样，博士是正常神经肌肉突触发生所需的细胞自主性，这与之前对小鼠进行的分析一致，这些小鼠的大量染色体缺失可以消除博士和邻近基因(Burgess等人，2004年). 此外，我们还发现中枢神经系统中主要轴突束的建立存在严重而特殊的缺陷，包括皮质和丘脑皮质轴突无法进入皮质下端脑并形成内囊，内囊是大脑皮层和神经系统其余部分之间信息流的主要途径。虽然前面描述的所有功能博士正交系是细胞自主的、有条件的博士证明了以下方面的细胞自主需求博士在皮质轴突的引导下。这些发现表明博士当皮质和丘脑皮质轴突进入皮质下端脑时，需要为它们生成一个宽松的环境，并揭示皮质纹状体边界作为下行皮质轴突的选择点。最后，我们测试了博士具有DLK公司(Holzman等人，1994年;红色与欢乐1994)，MAPKKK的鼠直系同源物，是无脊椎动物PHR基因的关键底物。我们生成了DLK公司突变体和博士 DLK公司双突变体，发现双突变体的内囊破裂持续存在，证明这种表型不是由于DLK上调所致。因此，除了其在进化上保守的、细胞自主调节突触发育的作用外，这些研究还显示了以下三个新的方面：博士哺乳动物神经系统的功能：博士是（1）在中枢神经系统中形成主要轴突束所必需的，并且它可以通过以下两种机制发挥作用：（2）细胞自主性和（3）独立于DLK公司.

结果

损失博士导致神经肌肉发育缺陷

博士在发育中和成年小鼠中枢神经系统中广泛表达(Yang等人，2002年;Burgess等人，2004年;Santos等人，2006年). 为了确定第1页，我们生成了条件博士利用Cre-lox系统敲除小鼠(图1A). 这个博士该基因包含超过80个外显子，跨度超过200kb。漂浮的外显子编码70个氨基酸，与RCC1结构域相邻，RCC1是一个高度保守的结构域，对钢索在里面果蝇属（C.Wu，个人通信）。随后从floxed等位基因中衍生出一个组成性敲除等位基因，并通过Southern blot证实了突变(图1B)、基因组PCR（数据未显示）和RT-PCR（见下文）。博士结构性基因敲除小鼠出生时会死而不呼吸，它们的膈神经比对照组明显狭窄，含有更少的轴突(图1C-E)它们通常缺乏隔膜最腹面区域的神经支配（补充图S1）。其他外周神经的形态和位置都很好，尽管很薄。运动轴突终止于与终板相对的正常突触前NMJ结构，但也延伸出充满轴突和突触标记物的形态异常的突触外静脉曲张(图1F，G). 这些数据证实了博士负责神经肌肉表型的报告Burgess等人（2004）缺乏染色体缺陷的小鼠博士和两个相邻的基因。

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博士运动神经元抑制突触前萌发的功能。(A类)目标的示意图博士突变等位基因。两个LoxP位点（三角形）通过同源重组引入到博士位于第八和第九翻译外显子两侧的基因座，产生“floxed”等位基因。在Cre存在的情况下，两个LoxP位点重组并切除干预基因组DNA，成为构成性敲除等位基因。(B类)Southern分析表明靶染色体存在于博士基因敲除纯合子（lane1)，野生型同窝繁殖的野生型染色体（泳道2)以及杂合子（lane）中的两条染色体三). 对照组的膈神经被神经丝染色，如图E18.5所示(C类)和博士本构击倒（KO）(D类)胚胎。膈神经轴突平均数量的量化如所示E类E18.5控件中的NMJ(F类,F类'）和博士构成击倒(G公司,G公司显示横膈膜上乙酰胆碱受体用银环蛇毒素（绿色）、突触素（蓝色）和神经丝（红色）染色。在博士结构性敲除，含有神经丝和突触素的突触外芽的例子用箭头突出显示。E18.5处用银环蛇毒素染色的乙酰胆碱受体终板带显示为对照(H（H）)和博士构成击倒(我)隔膜。定义的肌肉区域内终板的平均数量量化为野生型的百分比，如所示J平均端板带宽的量化如所示K（K）P3控件的NMJ(L（左）) (血红蛋白9-克里；+）和博士运动神经元击倒(M（M）) (血红蛋白9-Cre；博士弗洛克斯/博士弗洛克斯)横膈膜上的乙酰胆碱受体用银环蛇毒素（绿色）和神经丝（红色）染色。在博士运动神经元敲除，包含神经丝的突触外芽的例子用箭头突出显示。(*)P（P）< 0.01. 数据表示为平均值±SEM。

由于膈神经中的轴突较少，人们可能会在肌肉上发现较少的突触后终板。然而，隔膜的神经支配部分博士突变体与对照动物的终板数量相似，尽管终板在较窄的终板带内更密集(图1H–K). 所有终板都与突触前神经末梢相对，终板带的位置也没有改变。NMJ处的缺陷汇总在补充图S2中。这些结果的含义是，平均运动单位大小（由单个神经元支配的终板的补体）在博士突变体；也就是说，与对照组相比，敲除组中的每个运动神经元支配更多的终板。这类似于中的NMJ缺陷果蝇属突变体钢索每一个运动轴突都会产生比平时更多的突触泡。

突触前表型可能由运动神经元或肌肉的缺陷引起(Sanes and Lichtman 1999年)，因此重要的是要确定博士NMJ的缺陷是由于博士运动神经元。为此我们交配了第1页-将等位基因小鼠与运动神经元特异性Cre驱动因子结合HB9型-创建。因为HB9型-Cre小鼠在运动神经元中选择性表达Cre(Fox等人，2007年)，由此产生的后代发育出的NMJ缺乏博士只有突触前细胞。运动神经元特异性突变体的生存能力是可变的，不同于构成突变体博士淘汰：有些动物是死产的，但许多可以存活到成年，并且可以生育。因此，神经肌肉系统的缺陷对构成中的致命性起着重要作用博士尽管如此，还是被淘汰了博士其他组织的功能也可能起作用。

条件运动神经元NMJ的形态缺陷博士敲除类似于构成敲除物的敲除物-大量富含神经丝的芽细胞延伸到正常神经支配的终板之外(图1L、M). 有条件的博士显示这种NMJ形态改变的敲除基因可能具有完全神经支配的横膈膜，这表明横膈膜上明显的细胞形态缺陷并非继发于横膈膜腹侧缺乏神经支配。因此，鼠标博士，就像它果蝇属和秀丽线虫正交曲线(Schaefer等人，2000年;Zhen等人，2000年;Wu等人，2005年)，在运动神经元中发挥细胞自主功能，调节突触发育。

博士突变体缺乏丘脑的视网膜神经支配

较薄的周围神经和部分无神经支配的膈肌博士敲除小鼠让我们怀疑博士在轴突生长或引导以及突触发育中的功能。为了研究实验可触及神经的引导，我们分析了视网膜神经节细胞的投射，这些细胞表达博士（数据未显示），至丘脑外侧膝状体核（LGN）。用脂肪族染料DiI标记视网膜投影，我们发现新生儿的LGN没有神经支配第1页构成突变体(n个=4），而对照组幼崽的视神经束和背侧丘脑标记强烈(n个= 2) (图2). 在基因敲除中，缺陷的程度各不相同，但轴突总是离开视网膜，形成视神经，经常到达并穿过视交叉；在一只动物中，在视束开始时检测到一些标记的轴突，但没有一个到达背侧丘脑。因此，博士是大脑视网膜神经支配所必需的。

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博士突变体缺乏丘脑的视网膜神经支配。视网膜中DiI（红色）标记的P0头部的绿色Nissl染色连续冠状切片。标记的视神经(A类,D类)，视交叉(B类,E类)和丘脑(C类,F类)从控制和第1页结构性淘汰赛。轴突标记在敲除交叉处大大减少，在敲除丘脑中缺失。

缺少老鼠博士显示中枢神经系统形态缺陷

The broad expression of博士整个中枢神经系统，再加上视网膜投射的引导缺陷，使我们将研究范围扩大到大脑中的主要轴突束(图3). 在博士敲除脑：侧脑室的体积大大增加，在突变体中延伸到嗅球，海马结构较小且畸形(图3A-G). 间脑中，前丘脑体积缩小，组织改变(图3A-G). 尽管有这些明显的变化，大脑的整体组织没有明显的缺陷(图3H，I)和小脑皮质（补充图S3）在胚胎第18.5天（E18.5）-敲除的大脑皮质厚度正常（对照组的93±3%），皮质板厚度占总皮质厚度的百分比正常（对照组59.2±0.8%）；博士敲除62.7±0.5%），以及转录因子Tbr1的表达，Tbr1是皮质板有丝分裂后神经元的标记(图3J、K;Englund等人，2005年). 此外，中枢神经系统的细胞死亡在博士在任何研究时间点（E16.5和E18.5）发生突变，根据E12.5和E15.5出生的细胞的BrdU标记评估，细胞增殖也没有显著变化（数据未显示）。

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博士构成性敲除显示中枢神经系统的大体形态和轴突纤维束存在严重缺陷。E18.5对照组大脑一侧的Nissl染色冠状切片(A类,A类′),博士本构击倒（KO）(B类,B类′),博士缺陷突变体(15微米/15微米) (C类,C类′），以及构成等位基因和缺失等位基因的杂合子(D类,D类′). 尼氏染色细胞体，并显示白质束的浮雕。在博士击倒和博士缺陷突变体（Df），侧脑室增大，海马减少，穿过内囊的轴突束缺失。标记皮层（Ctx）、侧脑室（V）、伞（F）和丘脑（Th）。装箱区域如所示A类′,B类′,C类'，和D类'并显示对照组内囊中存在白质束（箭头）(A类'）但不是来自博士击倒和博士缺陷突变体(B类′,C类′,D类′). L1是包括内囊在内的主要纤维束的标记，其染色显示在E18.5对照组大脑一侧的冠状切片上(E类,E类′),博士本构击倒（KO）(F类,F类′），以及博士缺陷突变体（Df）(G公司,G公司′). 中显示的方框区域E类′,F类'，以及G公司'显示对照组内囊中存在L1-阳性轴突束（箭头）(E类'）但不是博士淘汰赛(F类'）或博士缺陷突变体(G公司′). 尼塞尔染色对照的冠状切片(H（H）)和博士本构击倒（KO）(我)E18.5大脑皮层突出显示皮质板（CP），其厚度（用括号表示）在突变体中占总皮质厚度的百分比不变。Nissl染色（绿色）和Tbr1染色（红色）对照的冠状切片(J)和博士本构击倒（KO）(K（K）)E18.5大脑皮层强调Tbr1+神经元已经迁移到皮层，并在突变体和对照中以相似的位置分化。GABA染色对照的冠状切片(L（左）)和博士本构击倒（KO）(M（M）)E18.5大脑皮层显示对照组和突变体中的GABA能细胞体（箭头），同时突出显示对照组中更显著的GABA能神经元染色（括号区域）。

在博士主要轴突束中存在明显的突变体和显著缺陷：前连合缺失（补充图S3），胼胝体在前后轴和背腹轴上都较窄（见下文），大脑皮层中的神经突起广泛缺失(图3A-G). 此外，Nissl染色博士突变体胚胎脑和包括L1在内的轴突标记物的免疫组化(图3A-G)钙视网膜蛋白显示皮质下端脑皮质投射和丘脑皮质投射的丢失，而皮质下端脑是内囊的正常位置。缰趾关节束较短，相邻的趾间窝被夸大（补充图S3）。免疫组织化学显示大脑结构中的神经丝普遍减少，包括海马、大脑皮层、皮层下端脑和丘脑（补充图S3）。轴突缺陷并不局限于长轴索，例如穿过连合和内囊的轴突：GABA能中间神经元的轴突染色明显减少，大脑皮层中GABA能细胞体的数量没有明显减少(图3L、M).

在缺乏完整的博士构成基因的基因座和小鼠转基因博士等位基因与缺失染色体(图3C、D、G; 补充图S3K）。靶向杂合子博士敲除等位基因没有显示明显的缺陷。CNS和PNS表型的性质和严重性在所有三种基因型突变中无法区分博士证明我们的构成性靶向等位基因表现为遗传无效等位基因。

胼胝体缺损博士突变体具有区域特异性

有关详细分析博士函数，我们选择性地删除博士从大脑皮层使用Emx1型-Cre小鼠。Emx1型-Cre表达于大脑皮层和海马结构中兴奋性神经元的祖细胞，包括胼胝体和内囊的所有投射神经元。GABA能中间神经元不表达Cre，它们在别处出现，随后迁移到皮层。Cre仅在罕见的丘脑下结构细胞中表达(Gorski等人，2002年;Bareyre等人，2005年). 小鼠纯合子博士floxed等位基因及其表达Emx1型-Cre存活下来成为有生育能力的成年人，这表明博士结构性击倒不是由于博士在大脑皮层。Emx1型-Cre公司;博士然而，小鼠确实表现出许多在null中观察到的端脑缺陷。这些包括扩大的侧脑室、畸形的海马结构和狭窄的胼胝体。胼胝体缺陷在定性和定量上与本构缺陷无法区分第1页淘汰赛(图4A-C). 这些表型持续到成年（数据未显示）。

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胼胝体缺损博士突变体具有区域特异性。E18.5对照组大脑皮质特异性切片中胼胝体大小的量化博士击倒（C-KO，Emx1型-Cre公司;博士弗洛克斯/博士弗洛克斯)和构成博士击倒（KO）显示前-后深度(A类)，背部-腹部厚度(B类)，和横截面积(C类). 在A类，星号表示P（P）<0.01，英寸B类，星号表示P（P）<0.005，英寸C类，星号表示P（P）与对照组相比<0.0005，表明博士是正常胼胝体形成所必需的。胼胝体的大小在大脑皮质特异性和组成性之间没有差异博士等位基因，证明Emx1型-Cre有效删除博士胼胝体的投射神经元。皮层轴突的DiI标记如E18.5冠状切片所示D–L.DiI置于对照组的体感皮层（Ctx）(D类)，大脑皮层特异性博士击倒（Cortical-KO）(E类)，和组成博士击倒（KO）(F类)标记穿过胼胝体中线（虚线）的轴突。星号表示染料在皮层中的位置。DiI位于控制的视觉皮层(G公司,J)，大脑皮层特异性博士击倒（Cortical-KO）(H（H）,K（K）)和构成博士击倒（KO）(我,L（左）)在对照组中标记穿过中线（虚线）的轴突，但不标记大脑皮质特异性或组成性轴突博士淘汰赛。中的装箱区域G–I放大倍数为J–L型并强调，来自视觉皮层的轴突在对照组中穿过中线，但未能穿过，反而在大脑皮层特异性和组成性的“Probst束”中积聚博士淘汰赛。数据表示为平均值±SEM。

胼胝体的减少可能是由于胼胝方向轴突的缺失或此类轴突未能穿过中线所致。在这两种情况下，这种减少可能是一种皮层范围的缺陷或局限于特定的皮层区域。为了区分这些替代品，我们使用亲脂染料DiI对E18.5胚胎进行了轴突追踪实验。DiI大约位于早期体感皮层的区域，通常穿过对照组胼胝体、大脑皮层特异性和构成突变胚胎（五分之五的对照组、四分之四的大脑皮层特异敲除组和三分之二的构成敲除组）(图4D–F). 对照组和突变体之间的染料杂交没有一致的差异。当DiI大约放置在早期视觉皮层时，它总是穿过对照胚胎的胼胝体(n个= 5) (图4G，J)尽管在对照动物中观察到从视觉皮层穿过的胼胝体轴突比从体感皮层穿过的少得多(图4，参见D和G）。相反，早期视觉皮层的胼胝体轴突从未穿过博士敲除胚胎(n个= 3) (图4I、L)或大脑皮层特异性博士击倒(n个= 4) (图4H、K). 相反，在博士突变体，来源于早期视皮层的染料标记轴突向前和中间延伸，远离染料放置位置，并像往常一样接近中线，但终止于称为“Probst束”的大灯泡中，而不是进入胼胝体。DiI实验表明，皮质敲除中这种缺陷至少持续到出生后第8天（P8）（数据未显示），因此这种缺陷不太可能是由于轴突生长或交叉延迟所致。从这些结果中，我们得出结论：博士突变动物是由于后脑皮层产生的轴突缺乏交叉，而不是整个皮层的普遍缺陷。

大脑皮层下降和丘脑上升投射的引导缺陷博士突变体

进行染色试验以分析通过E18.5内囊的轴突丢失程度博士突变体大脑。DiI标记的穿过内囊的轴突在所有对照E18.5大脑中都是明显的，这些大脑在早期体感中引入了DiI(图5A)或视觉（数据未显示）皮层(n个=10个实验）。对照动物中也可见逆行标记的丘脑神经元(图5D). 然而，在相同处理的E18.5中博士我们从未观察到构成突变胚胎，即穿过皮层下端脑的DiI-标记轨迹，或大脑皮层外的逆行标记细胞体(图5C、F) (n个=6个实验）。此外，放置在敲除大脑皮层下端脑中的DiI并没有显著延伸到皮层下端脑骨之外，这表明构成大脑皮层下端脑的白质博士敲除是由于局部神经元而不是丘脑或皮层的输入（补充图S4）。从这些结果中，我们得出结论，降皮质激素轴突博士突变体在E18.5时无法离开大脑皮层，而丘脑皮层轴突在E18.5.时无法到达其在皮层中的目标。

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皮质轴突生长缺陷博士突变体是细胞自主的。DiI标记如E18.5冠状切片所示A–F.DiI置于对照组的体感皮层（Ctx）(A类)和大脑皮层特异性博士击倒（Cortical-KO）(B类)标记穿过皮质纹状体边界（CSB，虚线）并穿过内囊的轴突。(C类)当DiI被放置在构成的体感皮层时博士敲除（KO）后，轴突仍留在皮层。当DiI被置于控制的视觉皮层时(D类)或大脑皮层特异性博士淘汰赛(E类)，背侧丘脑的细胞体被标记，表明这些基因型的丘脑皮质投射已经到达皮层。(F类)DiI在构成性视皮层中的位置博士敲除（KO）不能标记逆行性丘脑神经元。为了选择性地可视化C表达的皮层神经元，Thy1-停止-YFP转基因小鼠交配产生对照(Emx1型-Cre公司,Thy1-停止-YFP) (G公司,我)和大脑皮层特异性博士击倒（Cortical-KO：Emx1型-Cre公司,博士弗洛克斯/博士弗洛克斯,Thy1-停止-YFP) (H（H）,J). YFP阳性轴突穿过中线（虚线），在对照组和对照组的胼胝体（括号区域）中起作用(G公司)和皮质击倒(H（H）). 注意，胼胝体在皮质敲除时较薄博士淘汰赛。YFP阳性轴突也有助于两种对照的内囊(我)和皮质击倒(J). 在我和J，内囊中表达Cre的皮质轴突用YFP标记（绿色），而内囊中的丘脑皮质轴突用钙视网膜蛋白标记（红色）。大脑皮质特异性内囊中皮质轴突的存在博士击倒，但不是结构性的博士敲除，表明这种皮质轴突缺陷是非细胞自主的。

丘脑投射缺陷博士突变体可能反映了轴突通过特定制导选择点时的寻路错误。丘脑背侧轴突博士突变体延伸到细胞核以外，但避开端脑，而是沿着间脑-端脑边界异常延伸，而野生型丘脑轴突在到达大脑皮层的过程中穿过该边界(图6E、F). 转录因子缺乏的小鼠马什-1丘脑轴突突起的缺陷与博士淘汰赛(Tuttle等人，1999年). 这个马什-1这种缺陷可能是由于细胞分化或迁移不当造成的，这些细胞构成了一条允许胰岛1阳性细胞穿过皮层下端脑的走廊(Lopez-Bendito等人，2006年). 然而，Islet1阳性细胞的良好结构域经常存在于博士E13.5处的敲除，与对照组一样（补充图S5），表明丘脑轴突导向缺陷不可能是由于该走廊的丢失。

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轴上的投影博士突变体显示皮质纹状体边界的引导线索。(A类)在E14.5处放置在对照组体感皮层（Ctx）的DiI标记穿过皮质纹状体边界的轴突（CSB，虚线）。装箱区域放大A类'，突出显示轴突（箭头）延伸至皮质下端脑的深处。(B类)DiI放置在构成的体感皮层（Ctx）博士E14.5处的敲除（KO）标记停在皮质纹状体边界（CSB，虚线）的轴突。装箱区域放大B类'，显示没有轴突延伸到皮质下端脑。(C类)在E15.5，DiI放置在对照组的体感皮层（Ctx）中，标记穿过间脑-端脑边界（DTB，虚线）并进入丘脑（Th）的轴突。(D类)在E15.5，DiI被放置在构成的体感皮层（Ctx）第1页敲除（KO）标记仍停滞在皮质纹状体边界的轴突。这些结果表明，大脑皮层轴突博士突变体不跨越皮质纹状体边界。(E类)放置在E14.5对照组丘脑（Th）中的DiI标记丘脑轴突，这些轴突穿过间脑-端脑边界（DTB，虚线）并进入端脑。(F类)DiI放置在构成的丘脑（Th）中博士E15.5处的敲除物（KO）标记的丘脑轴突未能穿过间脑-端脑边界（DTB，虚线），而是沿着端脑和下丘脑之间的边界在腹侧行进。(G公司)示意图总结了大脑皮层特异性对照组的结果博士击倒（Cortical-KO）和结构性博士击倒（KO）出现在图5和​和6，6，其中野生型组织为绿色博士突变组织是粉红色的。标记结构包括大脑皮层（Ctx）、丘脑（Th）、下丘脑（Hyp）、胼胝体（CC）、内囊（IC）、皮质纹状体边界（CSB）和间脑-端脑边界（DTB）。该示意图强调第1页敲除，（1）皮质缺损是非细胞自主性的，（2）皮质功能和丘脑皮质轴突不能分别跨越皮质纹状体边界（CSB）和间脑-端脑边界（DTB），因此两者都避免了皮质下端脑。

博士自主调节皮层轴突外生长细胞

通过胼胝体的皮质轴突引导缺陷在构成性敲除和皮质特异性敲除之间无法区分；然而，对于这两种基因型，通过内囊的皮层轴突导向是显著不同的。与构成性敲除不同，大脑皮质特异性敲除具有内囊，通过尼塞尔染色可见，并含有神经丝、L1和钙调素阳性的轴突（数据未显示）。将DiI置于早期躯体感觉中的实验(图5B)E18.5的视皮层（数据未显示）也显示了穿过内囊的标记轨迹和丘脑中逆行标记的细胞体(图5B、E).

为了研究组成性敲除和皮质特异性敲除之间下降皮质轴突投射的差异，我们在皮质特异性敲出中测试了是否（1）下降皮质功能投射有助于内囊，以及（2）这种皮质轴突是否表达Cre。这个Emx1型-据报道，Cre线在皮层的所有投射神经元中表达Cre(Gorski等人，2002年). 为了有选择地可视化这些表达Cre的神经元，我们使用了一个Thy1-停止-YFP只有当Cre切除阻断表达的终止盒时，在神经元中表达YFP的转基因。转基因被交叉到对照组和皮质特异性的博士淘汰赛。与上述结果一致，Cre-expressing，cortical-derived第1页敲除轴突导致皮质特异性敲除中胼胝体比正常胼胝体薄(图5G、H). 此外，C表达的皮质神经元在对照组和皮质特异性的内囊中形成皮质突起博士淘汰赛(图5I，J)与结构中的皮层神经元相比博士敲除，不会形成内囊。作为第二种评估方法Emx1型-Cre有效地去除了牙线博士我们检测了大脑皮层和海马的等位基因野生型和突变型博士脑相关区域的信使核糖核酸Emx1型-Cre公司,用鞭子抽打-博士鼠标和控件。E16.5皮层的RT-PCR显示野生型博士在存在Emx1型-Cre（补充图S6）。此外，由于大脑皮层中GABA能中间神经元不表达Emx1型-Cre公司(Gorski等人，2002年)，这些RT-PCR结果表明GABA能中间神经元不表达明显数量的博士信息，因此不太可能直接导致胼胝体或内囊因失去第1页综合起来，我们的结果表明，皮质轴突的丢失对内囊的形成有贡献第1页构成性突变体是一种细胞非自主缺陷，最有可能是由于失去博士在大脑皮层以外的细胞体中。

这个博士表型揭示了皮质纹状体边界处皮质轴突的选择点

进一步分析博士构成突变体显示，下行轴突延伸穿过大脑白质，并在皮层和纹状体之间的边界突然终止(图5C). 皮质下端脑中皮质轴突的缺失是由于轴突未能穿过皮质纹状体边界，而不是轴突回缩到该边界。在E13，来自野生型和组成型的皮质轴突博士基因敲除动物延伸到皮层内（数据未显示）。到E14.5，野生型皮质轴突已经越过皮质纹状体边界(图6A)并延伸到早期纹状体(图6A′). 相反，在E14.5，皮质轴突博士突变体延伸至大脑白质，但终止于皮层边缘，形成类似Probst束的灯泡(图6B，B′）。到E15.5，野生型轴突已经到达丘脑，而第1页轴突留在皮质纹状体边界(图6C、D). 在正常发育过程中，丘脑皮质和皮质丘脑轴突与皮质下端脑的相互投射接触，随后相互引导至目标组织(Hevner等人，2002年). 皮质轴突缺损博士然而，突变体不能继发于与丘脑轴突缺乏直接接触，因为皮层轴突博士突变体永远不会离开大脑皮层(图6). 相反，在丘脑投射缺陷继发于皮质投射缺陷的突变体中，例如Gbx2淘汰赛(Hevner等人，2002年)，皮质轴突穿过皮质纹状体边界并在皮质下端脑内停滞。

由于下行的皮质功能轴突通常不接触丘脑轴突而离开皮质第1页构成性敲除不能归因于与丘脑轴突没有直接接触。然而，在大脑皮质特异性中存在下降的皮质激素投射博士丘脑轴突最终到达皮质纹状体边界仍可能促进突变。如果是这样的话，那么人们会期望皮质敲除物显示出与完全敲除物相同的皮质轴突生长缺陷博士早期敲除，但随后丘脑轴突到达后恢复正常生长。没有观察到这一点。在大脑皮层或丘脑中放置DiI的实验显示，在所有时间点，大脑皮层特异性敲除的结果与对照组相似：在E12.5，轴突不会伸出实验动物或对照动物的大脑皮层（数据未显示），但在E13.5，丘脑轴突到达大脑皮层之前，来自对照和实验动物的皮质轴突已经开始将角落变成皮质下端脑（补充图S7），到E15.5时，两种基因型的皮质轴轴突已经进入丘脑（补充图纸S7）。因此，细胞自主生长缺陷博士内囊中存在野生型丘脑轴突并不能拯救突变的皮层轴突。总的来说，我们的结果表明，皮质轴突在结构中未能穿过皮质纹状体边界博士击倒不是因为没有博士来自大脑皮层神经元或胶质细胞Emx1型-表达谱系或来自通常将轴突延伸到皮层的丘脑神经元。相反，我们的研究结果表明博士在皮层下端脑的神经元或胶质细胞中需要，使皮层轴突穿过皮质纹状体边界。这突出了以前未被证实的皮质纹状体边界作为下行皮质轴突的选择点的作用。

博士不通过下调DLK来调节中枢神经系统轴突束的形成

在苍蝇和蠕虫中，泛素连接酶Highwire/Rpm-1下调MAPKKs Wallenda/DLK的水平，以及与之相关的主要形态缺陷高线/rpm-1功能丧失是由于Wallenda/DLK过量所致。这一结论的最有力证据是高线/rpm-1在缺乏这两者的双突变体中，形态表型受到抑制高线/rpm-1和沃伦达/DLK.在小鼠中进行平行实验，DLK公司产生了突变体（补充图S8A）。这个DLK公司敲除缺乏前连合（补充图S8B，C），但突变株的内囊很明显（补充图S8D，E）。这种表型与最近描述的一个独立产生的等位基因非常相似DLK公司(Hirai等人，2006年). 调查博士中枢神经系统表型是由于DLK过量，博士和DLK公司突变体交配产生双基因敲除。这些动物表现出与博士单个突变体，包括缺少内囊(图7A–C). 我们也没有发现任何证据可以抑制神经根结处的突触萌芽缺陷博士,DLK公司双突变体（数据未显示），尽管DLK公司单个突变体偶尔有突触萌芽，这使得评估抑制更加困难。

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中枢神经系统缺陷持续存在博士,DLK公司双突变体。E18.5对照组大脑一侧的Nissl染色冠状切片(A类,A类′),博士构成击倒(博士KO）(B类,B类'，和博士;DLK公司双重击倒(博士让开；DLK公司KO）(C类,C类′). 在博士击倒和博士,DLK公司双敲除，侧脑室增大，缺乏穿过内囊的轴突束。标记皮层（Ctx）、侧脑室（V）和伞（F）。中显示的方框区域A类′,B类'，和C类'证明对照组内囊中存在白质束（箭头）(A类'）但不是来自博士淘汰赛(B类'）或博士,DLK公司双重淘汰赛(C类′). 这些数据表明博士基因突变不会抑制基因敲除DLK公司.英寸D类，Western分析显示DLK和β-微管蛋白（β-tub）来自条件性博士淘汰赛(博士-KO）和匹配控件。直方图显示了DLK水平相对于β-微管蛋白负荷控制的水平，并归一化为控制水平。本构关系之间的DLK水平没有显著差异博士击倒和控制(n个=每个基因型4个）。(E类)DLK在E13.5大脑皮层组织切片中的免疫组织化学定位博士淘汰赛(博士与对照组相比，DLK蛋白的水平或定位没有明显差异。数据表示为平均值±SEM。

测试是否博士调节DLK的水平，如无脊椎动物直系动物所示，我们通过Western分析从博士构成性击倒。在与主要轴突束发育相关的时间点，我们观察到DLK水平没有差异(图7D). 此外，我们在胚胎皮层中观察到DLK蛋白的水平或定位没有明显差异博士用免疫组织化学方法评估突变脑(图7E). 来自负责人的DLK水平博士缺陷胚胎也不大于对照组（86±6%，n个= 3,P（P）> 0.2). 最后，我们测量了与DLK最接近的哺乳动物同源物LZK的水平(Sakuma等人，1997年)，通过对胚胎头部的西方分析发现，野生型和博士击倒（110±14%的控制，n个= 4,P（P）> 0.6). 因此，我们没有证据表明糖尿病患者大脑中DLK或LZK水平升高博士突变体。这些数据，结合上述双突变分析，表明博士CNS突变表型并非由于不能下调DLK。

讨论

在进化上保守的作用博士神经肌肉发育

无脊椎动物直系图博士是神经肌肉正常发育所必需的。在这里，我们演示了此函数的进化守恒博士在哺乳动物中。在两者中果蝇属与小鼠相比，NMJ末端形态的精细结构很容易评估，并且显示了两种表型之间的相似性和差异性钢索苍蝇和第1页老鼠。在飞行中，没有钢索导致运动神经元轴突过度分支，肌肉上的突触束数量大幅增加(Wan等人，2000年). 在小鼠中，运动神经元末梢也表现出额外的分支，并有大量的突触外芽(图1F、G;Burgess等人，2004年). 在苍蝇和小鼠中，这些表型反映了对博士/钢索在运动神经元中，提示其在抑制神经末梢分支中的作用。然而，与苍蝇不同，小鼠体内多余的芽不会形成突触，这可能反映了苍蝇和小鼠NMJ形成机制的不同。在飞NMJ上，每一个肌肉细胞都面对一个分支轴突，形成突触束树干，因此钢索突变体可能利用正常的肌肉机械来建造这种隆起。相反，在小鼠中，每根肌肉纤维只有一个终板(Sanes and Lichtman 1999年)，并且可能不接受构建异位突触后结构以响应额外的突触前分支。

博士是中枢神经系统主要轴突投射形成所必需的

膈神经和膈肌的部分神经支配博士突变体指示功能博士除了神经末梢形态的调控之外，这表明运动轴突对其肌肉靶点的导向存在缺陷。这与果蝇高线突变体，显示正常运动神经元轴突引导和所有靶肌肉的完全神经支配(Wan等人，2000年). 视网膜神经节细胞轴突显示出更明显的导向缺陷，生长于视网膜外，但在视神经内或视交叉处停滞。事实上，整个中枢神经系统的轴突束都有严重和特异性的丢失：胼胝体厚度减少，原因是从大脑后皮质穿过的轴突丢失，前连合完全缺失，丘脑和皮层轴突无法进入皮层下端脑形成内囊。While期间博士突变体轴突在轴突生长中可能存在普遍缺陷，表现型与轴突导向缺陷更为一致。轴突停在特定的边界，包括间脑-端脑边界和皮质纹状体边界，来自大脑皮层同一区域的轴突未能进入纹状体，但成功穿过胼胝体。因此，博士不仅像无脊椎动物一样调节突触连接的精细结构，而且哺乳动物大脑中神经元连接的大规模模式也是必需的。

博士自主调节中枢神经系统细胞中的轴突导向

所有先前描述的博士细胞是自主的(Schaefer等人，2000年;Zhen等人，2000年;D'Souza等人，2005年;Wu等人，2005年). 因此，轴突导向缺陷博士突变体自然会被认为是由于对分子指导线索的误读博士突变体轴突，这可能是胼胝体皮质轴突的情况。然而，对于下行皮质轴突，情况并非如此。什么时候？博士使用Emx1型-Cre是内囊的形式，皮质神经元支配丘脑，反之亦然，Cre阳性标记的皮质轴突穿过皮质下端脑（数据汇总于图6G). 令人惊讶的是，这并不是皮质轴突独有的结果。在博士结构性敲除，视网膜神经节细胞投射未能达到目标；然而，当博士突变体轴突在视网膜中选择性地被删除，使其丘脑中的靶点充分神经化，揭示了非细胞自主性对博士视网膜外用于神经节细胞轴突寻路（S.Cullican，A.J.Bloom和A.DiAntonio，未出版）。

丘脑皮质束严重缺陷的突变体出现皮层轴突导向的细胞自主缺陷(Hevner等人，2002年)这表明皮层轴突需要丘脑轴突才能到达丘脑中的靶点。在正常发育过程中，皮质先锋轴突穿过皮质纹状体交界处，在大约E13.5时迅速进入内囊，但在E14.5时到达内囊中部，似乎在假定的新纹状体中暂停24–48小时。Jacobs等人（2007年）推测新纹状体的这种停顿表明皮层轴突聚集并“匹配”相应的丘脑皮层传出所需的时间。事实上，缺乏丘脑轴突突变体的皮质轴突缺陷与错过预约是一致的；也就是说，皮层轴突在E14.5中段延伸到皮层下端脑，但没有进一步进展(Hevner等人，2002年). 情况并非如此博士突变体。相反，皮质轴突完整博士突变体似乎避开了早期的纹状体，而皮质特异性博士敲除细胞在所有发育时间点都会将轴突伸入内囊。这是皮质轴突缺陷的证据第1页突变体不是继发于丘脑轴突的缺失，而是类似于丘脑的特定寻路缺陷丘脑的中的投影博士突变体。

这个第1页突变体揭示了皮质纹状体边界处皮质轴突的选择点

轴突的进程受投射神经元及其最终目标的属性以及沿其路径调节分子环境的因素的影响。这种环境包括允许和非允许生长的基质，以及促进向靶细胞生长或将轴突排斥在不合适靶细胞之外的扩散因子(Tessier-Lavigne和Goodman，1996年). 因此，细胞在投射神经元与其靶细胞之间的不适当发育和组织会导致轴突生长和导向中的细胞自主缺陷(Tuttle等人，1999年;Lopez-Bendito等人，2006年). 不同组织之间的边界可以是生长轴突的选择点；间脑-端脑交界处有强有力的证据证明这一点(Tuttle等人，1999年;Jacobs等人，2007年). 在博士敲除后，丘脑皮质轴突停在这个边界。皮质纹状体边界是一个明显的解剖标志，是端脑中不同分子细胞类型之间的边界，也是丘脑轴突进入皮质的确定边界(Molnar和Blakemore 1995年;Chapouton等人2001;Inoue等人，2001年;Jones等人，2002年;莫尔纳和巴特勒2002;Carney等人，2006年). 然而，先前发现的具有皮层轴突缺陷的突变体要么将轴突延伸到纹状体，穿过该边界(Bagri等人，2002年;Hevner等人，2002年;Tissir等人，2005年)或显示影响皮层内轴突生长的缺陷(Wang等人，2002年). 相反，大脑皮层的轴突第1页敲除继续到皮质纹状体边界并停止。这些结果揭示了皮质纹状体边界是轴突离开皮质的选择点。我们在这里表明，皮质轴突在构成中未能越过这一边界博士淘汰赛不是因为缺少博士大脑皮层神经元或胶质细胞Emx1型-表达谱系或丘脑神经元，通常将轴突延伸到皮层。相反，这些结果表明，皮质下端脑中存在一个不典型的神经元或神经胶质细胞群体，需要博士使这个边界可以通过皮质轴突。皮质轴突无法进入皮质下端脑，这与突变丘脑轴突的缺陷非常相似，也无法进入皮质下端脑，导致我们怀疑共同的细胞自主机制。这些发现表明了一个模型博士需要使皮层下前脑允许皮层和丘脑轴突进入。

博士CNS轴突束表型不需要DLK

在苍蝇和蠕虫中进行的大规模无偏遗传筛选表明，在以下情况下观察到的主要形态表型需要MAPKKK-Wallenda/DLK高线/rpm-1是变异的(Nakata等人，2005年;Collins等人，2006年). 在这些系统中，Highwire/Rpm-1调节Wallenda/DLK的水平，而Wallenda/DLK的上调对于引起突触形态缺陷是必要的，也是足够的钢索和转/分-1突变体(Nakata等人，2005年;Collins等人，2006年). 苍蝇和蠕虫之间惊人的进化保守性使我们怀疑这条途径也将是博士哺乳动物的表型。然而，我们观察到DLK或其近同源物LZK在发育中的中枢神经系统中的水平或定位没有变化博士突变小鼠。此外DLK公司不抑制CNS中的大体形态变化，如内囊丢失，这是CNS的标志性表型博士突变体。这些结果并不表明第1页从未调节过DLK，但他们确实证明了，与无脊椎动物不同，DLK的上调对博士突变体，表明无脊椎动物研究未预期的机制。

材料和方法

第1页和DLK公司老鼠

从129细胞系的胚胎干（ES）细胞基因组DNA的PCR产物中构建靶向载体，随后用于产生博士靶向等位基因小鼠。扩增了基因组DNA中彼此相邻的三个PCR片段：一个1.3 kb的“短臂”，一个1.6 kb的包含翻译的外显子8和9的“固定区”，以及一个3 kb的“长臂”。用于产生固定区的3′引物还包括34个碱基对（bp）loxP序列，以便在漂浮区域和长臂之间引入loxP位点。将每个片段亚克隆到载体pGEM-Easy（Promega）中，并对每个连接的多个克隆进行测序。将每个片段的准确拷贝克隆到载体pSV-LoxP-FRT-neo-FRT中，该载体包含一个TN5 neo酪蛋白，其两侧是邻近第二个LoxP位点的FRT位点。因此，外显子8和9两侧是loxP位点。将构建物电穿孔到ES细胞中，并通过Southern blot证实含有这两个loxP位点的同源重组体。将两个不同的克隆注射到小鼠囊胚中以产生种系嵌合体。将种系嵌合体培育至C57黑小鼠，以产生漂浮等位基因的杂合子。种系嵌合体也被培育成β-肌动蛋白核心系(Lewandoski和Martin 1997年)删除生殖系中的漂浮外显子并产生构成博士敲除等位基因。在这个基因敲除过程中，RT-PCR证明这些外显子在转录的RNA中缺失，留下的转录物可能编码携带内部缺失的蛋白质。两个克隆产生的组成等位基因被判断为具有相同的表型，随后被相同地处理。

这个DLK公司基因陷阱突变体嵌合体是通过将小鼠ES细胞注射到胚泡中而产生的，所述ES细胞来自含有插入DLK 5′非翻译区内含子中的基因陷阱构建体pGT0Lxf的系RRN366（BayGenomics Consortium）（参见http://baygenomics.ucsf.edu). 将种系嵌合体培育至C57黑小鼠，以产生基因陷阱等位基因的杂合子。子代随后与靶向小鼠交配第1页敲除等位基因以最终生成DLK基因陷阱，博士敲除双纯合子。

老鼠

不同的博士用三种不同的引物对尾部DNA进行PCR检测等位基因：来自Neo盒的5′引物（CACACATCCACCTGGTTCC GCCTCAG），来自博士基因座（TTTTT CAATC CCAAATAAGGTTTAGAAG）和来自博士基因座（ACACAGACGACGTCTGCAGCTTCAAGAGAA）。

15微米和1警报花斑缺失小鼠(Roix等人，2001年)来自Timothy P.O'Brien（纽约州伊萨卡市康奈尔大学）。本文中称为“缺陷”小鼠的胚胎和新生小鼠是通过交配获得的15微米和1克库存老鼠或15微米老鼠们在一起。Thy-Stop YFP15(Feng等人，2000年)，Emx-1 Cre公司(Gorski等人，2002年),HB9型-Cre公司(Fox等人，2007年)和βactin-Core小鼠(Lewandoski和Martin 1997年)如前所述。

所有胚胎都是通过剖腹产从定时交配中采集的，其中阴道塞的检测结果被定义为E0.5。对于细胞增殖研究，在E12.5或E15.5向怀孕小鼠注射50 mg/kg BrdU（Roche）。

Southern印迹

用ApaI和PacI切割从ES细胞培养物或小鼠肝脏制备的基因组DNA。使用Rediprime II随机素标记系统（Amersham）生成放射性探针来自两个PCR片段中的一个：引物GTATTTTACTCAAGATAATAATATTTGA和AAAGCTAACGAACCTCATGTGC生成的结构体的5′，或引物AGTAGGCTTGAGTT TTTAAAAGCCATCC和AAAATCTAAAGTTTA TATCTTTC生成的结构物的3′。探针通过ProbeQuant G-50微柱（Amersham）。用荧光成像板（Amersham）和分子成像仪FX（Bio-Rad）检测放射性标记

RT–PCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从解剖的（1）皮层和海马或（2）剩余大脑中提取RNA，并使用SuperScript一步RT-PCR试剂盒（Invit罗gen）进行RT-PCR。引物为AAACAGATTATGAG GTTGGGCTTGTGAA和AAAAGGGCATGCGAGCCAT CATGTCCCACA，位于floxed结构域的侧面。反应在55°C下培养30分钟，然后在94°C下进行40次15秒变性循环，在60°C下退火30秒，在68°C下延长1分钟。

组织学

对于全山神经和肌肉染色，将组织固定在2%的副甲醛-PBS中2 h。肌肉在室温下在兔抗神经丝200（Sigma，1:80）或小鼠抗泛神经丝混合物（SMI，1:1000）和兔抗突触素（Zymed，1:500）中孵育至少24 h。使用的二级抗体是Cy3山羊α-兔和Alexa 488-结合的银杏毒素（均来自分子探针，1:1000）。

对于免疫组织化学分析，除α-GABA外，将大脑在4°C下放置在4%的副甲醛-PBS中过夜，沉入30%的蔗糖中，冷冻在OTC中，用冷冻器切割成20μm的漂浮切片，并安装在Superfrost Plus玻片上。为了用α-GABA染色，将大脑在4°C下固定在2%副甲醛-PBS中2h，并切下14-μm的切片；载玻片在1%对甲醛-PBS中固定1min，与Fab片段（1:100）连续孵育；PBS中0.1 M甘氨酸，0.5%硼氢化钠；最后，在兔α-GABA（Sigma，1:500）之前，在PBS中加入3%的正常山羊血清和1%的Triton X-100。其他主要抗体包括大鼠α-L1（Chemicon，1:100）、小鼠α-泛神经丝混合物（SMI，1:1000）、兔α-钙调素（Swant，1:2000）、家兔α-胰岛（由纽约哥伦比亚大学T.Jessell提供，1:5000）、兔β-DLK C末端(Holzman等人，1994年，1:500）（由密歇根大学密歇根州安娜堡分校的L.Holzman提供）和兔子α-Tbr-1（由华盛顿大学西雅图分校的R.F.Hevner提供，1:2500）。尼塞尔染色玻片在甲酚紫中培养。荧光次级产物为Cy3山羊α-大鼠、Cy3羊α-兔、Alexa488山羊α-小鼠和Neurotrace 640/660 Nissl染色（均来自分子探针）。

按照试剂盒程序，使用兔α-裂解半胱天冬酶-3（Cell Signaling，1:200）和原位细胞死亡检测试剂盒TMR red（Roche）评估细胞死亡。小鼠α-BrdU（Beckton Dickson，1:100）用于检测BrdU以分析细胞增殖。

蛋白质印迹

用于分析中的DLK水平博士敲除小鼠，从E12.5和E14.5胚胎中取出整个头部并冷冻在液氮中2为了分析DLK基因陷阱小鼠中的DLK水平，从P7动物的大脑中解剖出来，用中矢状切口将其一分为二，并冷冻在液态N中2在含有10份悬浮缓冲液（100 mM NaCl，100 mM Tris-Cl，pH 8，1 mM EDTA），4份8 M尿素和1份20%十二烷基硫酸钠的冰镇缓冲液中均匀化整个头部或大脑。然后将样品在2×SDS加载缓冲液中稀释（100 mM Tris-Cl，pH 6.8，200 mM DTT，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油），煮沸10 min，并通过23-G针。使用4%–20%SDS-PAGE凝胶（Cambrex）分离蛋白质并转移到PVDF膜（Bio-Rad）。在含有0.1%吐温20（Amresco）和5%脱脂干乳的PBS溶液中封闭膜。然后用以下在封闭缓冲液中稀释的主要抗体标记斑点：DLK C末端（密歇根大学安娜堡分校Lawrence B.Holzman的礼物，1:500）或β-微管蛋白（发育杂交瘤库，1:100）。然后用适当的HRP结合二级抗体标记斑点，并使用LumiLight Plus溶液（Invitrogen）进行显影。

DiI标签

放置DiI晶体后，在室温下将固定的大脑恢复到4%的副甲醛-PBS。E12.5–E15.5大脑保持固定状态至少10天，E18.5大脑保持固定至少14天，P6和P8保持固定至少21天。在可控震源上切割一个微米至200微米的切片。根据侧脑室和大脑皮层腹侧的弧线估计皮质纹状体边界；从组织形态学上看，切片中间脑-端脑边界明显。

成像和分析

Nissl染色切片和DiI-标记切片的图像通过安装在Eclipse 80i显微镜（尼康）上的Cool SNAP cf相机（光度计）获得。在尼康C1共焦显微镜上采集标记有荧光二级物的载玻片的图像。使用相同的共焦增益设置对每个实验的样品进行成像。使用Adobe Photoshop CS2将合成图像拼接在一起。对于轴突和终板计数以及终板带宽测量，使用EZ-C1软件（Nikon）将共焦图像堆叠合并在一起。MetaMorph软件（Molecular Devices）用于测量平均终板带宽，方法是在合并图像中围绕终板带宽绘制多边形，测量面积，然后除以终板带宽。选择膈肌的等效区域进行成像，以膈神经在肌肉上的主要分支点为标志进行终板计数和带宽测量。在不考虑基因型的情况下进行量化。使用MetaMorph软件（Molecular Devices）在用户定义的盲区皮层区域内自动计数BdrU标记的细胞。使用ChemiDoc XRS扫描仪（Bio-Rad）获取Western blot图像，并使用Quantity One软件（Bio-Rad）测量带强度。用振动仪或冷冻器从E18.5大脑冠状切片上测量胼胝体背腹侧厚度和前后长度。中线处的横截面积估计为测量长度和厚度的乘积。使用Origin 7.0（Origin Laboratory）进行统计分析并生成图表。使用t吨-测试或方差分析（如适用）。

鸣谢

我们非常感谢Janice Brunstrom博士、Susan Culican博士、Steven Mennerick博士、David Ornitz博士、Joshua Weiner博士、Thomas Baranski博士和Brad Miller博士的建议和帮助。我们还感谢DiAntonio实验室的其他成员，特别是Catherine Collins博士和Chunlai Wu博士，以及我们熟练的技术人员Sylvia Johnson。ES细胞的电穿孔是由Siteman癌症中心胚胎干细胞核心的亲切工作人员进行的，小鼠集落的维护是由华盛顿大学动物设施的技术人员精心管理的。这项工作得到了凯克和麦肯奈特学者奖（Keck and McKnight Scholars Awards to A.D.）的支持。

脚注

补充材料可在网址：http://www.genesdev.org.

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期在线http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1592107

工具书类

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文章来自基因与发育由提供冷泉港实验室出版社