介绍
一氧化氮（NO）是一种重要的调节分子，参与多种生理过程(1–三). 这个分子是由L（左）-通过一氧化氮合酶（NOS）产生精氨酸。已经鉴定出三种不同的NOS亚型：神经元型NOS（nNOS或NOS I）、诱导型NOS（iNOS或NOS II）和内皮型NOS（eNOS或NOS III）(4,5). 尽管NO在许多生理过程中发挥着重要作用，但NO的过度生成与多种病理条件有关，包括炎症、感染性休克、糖尿病和神经退行性变(6–9). 因此，通过抑制NOS来阻断NO的生成，可能有潜力治疗这些病理状况。由于NOS的不同亚型涉及不同的病理条件，因此有必要选择性抑制NOS的特定亚型，以加强这种方法在鉴别治疗这些疾病中的治疗应用。已经确定了几种对不同NOS亚型具有选择性的抑制剂(10,11). 使用这些抑制剂已被证明有助于治疗与人类和实验动物NO过度生成相关的各种疾病(12,13).
NOS抑制剂的疗效预计会受到这些抑制剂进入靶细胞与NOS相互作用的效率的显著影响。此外，这些抑制剂在肠道中的转运将影响其口服生物利用度。因此，有关NOS抑制剂细胞摄取机制的信息对于评估其治疗潜力至关重要。大多数NOS抑制剂在结构上与精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸有关(10,11). 因此，氨基酸转运系统在NOS抑制剂的细胞摄取中起着关键作用。哺乳动物细胞中有多种系统参与调节氨基酸的转运，这些转运系统在底物特异性、底物亲和力、驱动力和组织表达模式方面存在显著差异(14). 其中许多运输系统最近被克隆并具有功能特征(15,16). 过去有几项研究旨在确定介导NOS抑制剂摄取的氨基酸转运系统(17–21). 到目前为止，已确定两种氨基酸转运系统参与NOS抑制剂的细胞摄取。这些是系统y+和系统L都是Na+-独立的转运系统，因此仅表现出很弱的浓缩底物的能力，包括细胞内的NOS抑制剂。据我们所知，没有其他氨基酸转运系统被证明参与NOS抑制剂的转运。最近，我们开始研究确定氨基酸转运系统B的作用0,+（自动变速箱0,+)NOS抑制剂的细胞摄取(22). 这些研究表明系统B0,+可能参与NOS抑制剂的转运N个G公司-硝基-L（左）-精氨酸(L（左）-国家核管理局）。系统B0,+与系统y不同+和系统L在两个重要方面。首先，与系统y不同+和L分别针对阳离子或两性离子氨基酸，系统B0,+可以接受阳离子和两性离子氨基酸作为底物。这一特性很重要，因为有阳离子型NOS抑制剂和两性离子型NOS抑制剂已被鉴定为不同NOS亚型的特异性抑制剂。第二，系统B0,+是一个高度集中的运输系统，由多种驱动力（Na+梯度，Cl–梯度和膜电位）。因此，系统B的能力0,+将底物集中在细胞内比系统y大几倍+和L.自B起0,+在肠道中表达(16)该系统有潜力作为NOS抑制剂的药物输送系统。本研究旨在研究多种结构多样和异构体特异性NOS抑制剂通过ATB的转运0,+从小鼠肠道克隆而来。
方法
材料。
[三H] -甘氨酸购自Moravek生化公司（美国加利福尼亚州布雷亚）[三【H】-L（左）-NNA购自Amersham Pharmacia Biotech（美国新泽西州皮斯卡塔韦）。所有其他放射性标记氨基酸均来自NEN生命科学产品公司（美国马萨诸塞州波士顿）或美国放射性标记化学公司（美国密苏里州圣路易斯）。NOS抑制剂从Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）或Calbiochem-Novabiochem Corp.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）获得。
小鼠ATB基因的克隆0,+.
SuperScript质粒系统（美国马里兰州罗克维尔市生命技术公司）用于建立含有poly（a）的单向cDNA文库+如前所述，从小鼠结肠中分离出RNA(23–25). 用小鼠ATB特异性引物通过RT-PCR制备文库筛选探针0,+基因库中报告的cDNA（登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF161714”，“term_id”：“5732879”}}AF161714型). 引物为5′-GTT GGC TAT GCA GTG GGA TT-3′（正）和5′-GAG GCC AAG GAG AAA CAA AA-3′（反义），分别对应于cDNA序列中的核苷酸位置396–415和1606–1625。使用poly（A）进行RT-PCR+从小鼠结肠制备的RNA和生成的约1.2 kbp大小的产物被亚克隆并测序以确认其身份。该cDNA标记有[α-32P] dCTP随机启动，作为探针筛选小鼠结肠cDNA文库。使用自动377 Prism DNA测序仪（美国加利福尼亚州福斯特市Perkin-Elmer Applied Biosystems）进行测序。最长的阳性克隆（～3 kbp）用于功能研究。
Northern印迹分析。
ATB的表达模式0,+通过Northern印迹分析研究了沿小鼠肠道纵轴的mRNA。整个小肠被分成四个相等的节段，第一节代表最近的小肠，第四节代表最远的小肠。聚乙烯（A）+从这四个片段以及盲肠和结肠中分离出mRNA，并用于Northern blot分析。在高严格条件下，用[32P] 小鼠ATB特异的标记cDNA探针0,+小鼠肽转运蛋白1（PEPT1）和小鼠β-肌动蛋白。
功能表达式ATB0,+HRPE细胞中。
使用痘苗病毒表达系统进行功能表达(23–25). 以放射性标记氨基酸或NOS抑制剂为底物，在37°C下进行15分钟的转运测量。转运缓冲液为25 mM HEPES/Tris（pH 7.5），含有140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2，0.8 mM硫酸镁4和5 mM葡萄糖。内源性转运活性总是使用单独转染载体的细胞平行测定。在大多数实验中，甘氨酸作为底物，内源性转运占转染cDNA的细胞中测量的转运的不到5%。通过调整内源性活性计算cDNA特异性转运。动力学参数，Michaelis-Menten常数(K（K）t吨)和最大速度(V（V）最大值)通过将cDNA特异性转运数据拟合到描述单个饱和转运系统的Michaelis-Menten方程来计算。Na人+-和Cl–-通过将cDNA特异性转运数据拟合到Hill方程来分析活化动力学，并计算Hill系数。
功能表达式ATB0,+非洲爪蟾卵母细胞中。
克隆小鼠ATB的cRNA帽0,+cDNA是使用mMESSAGE mMACHINE试剂盒（美国德克萨斯州奥斯汀Ambion Inc.）合成的。成熟卵母细胞非洲爪蟾通过胶原酶A（1.6 mg/ml）处理分离，手动除泡，并在补充有10 mg/ml庆大霉素的改良Barth培养基中保持在18°C(23–25). 第二天，卵母细胞注射50 ng cRNA。未注射的卵母细胞作为对照。注射cRNA后6天，将卵母细胞用于电生理研究。采用双微电极电压灯法进行电生理研究(23–25). 卵母细胞与含NaCl的缓冲液（100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl）融合2，1 mM氯化钙23 mM HEPES、3 mM Mes和3 mM Tris，pH 7.5），然后使用含有不同NOS抑制剂或氨基酸的相同缓冲液。将膜电位固定在-50 mV。以20 mV的增量在+50和-150 mV之间施加电压脉冲100 ms，并测量稳态电流。在存在和不存在衬底的情况下测量的稳态电流之间的差异被认为是衬底感应电流。动力学参数K（K）0.5通过将底物诱导电流的值拟合到Michaelis-Menten方程，计算底物饱和输运所需的底物浓度（即诱导半最大电流所需的基质浓度）。用来自两个不同批次的至少三个不同卵母细胞重复实验。
结果
ATB的表达模式0,+mRNA在小鼠肠道中的表达。
确定ATB的表达模式0,+沿着肠道纵轴，我们分析了ATB的稳态水平0,+通过Northern杂交在小鼠肠道不同区域的mRNA（图). 自动变速箱0,+小肠前三段未检测到mRNA。然而，mRNA的表达在小肠、盲肠和结肠的第四段明显。结肠和盲肠中的mRNA水平比远端小肠更丰富。相反，PEPT1，a H的mRNA+-小肽的偶联转运蛋白在小肠的所有四个节段中都能检测到，但在盲肠和结肠中没有检测到。这些数据表明ATB的表达0,+mRNA仅限于小鼠肠道的远端区域。
ATB的Northern印迹分析0,+沿着小鼠肠道纵轴的信使核糖核酸。小肠被分成四个相等的段，第一段代表小肠的最近端区域，第四段代表小肠的最远端区域。在高严格条件下，用[32P] 小鼠ATB特异的标记cDNA探针0,+、小鼠PEPT1和小鼠β-肌动蛋白。
鼠标ATB的功能特性0,+.
克隆小鼠ATB的功能鉴定0,+通过在哺乳动物细胞中异源表达克隆并研究其转运功能，首次建立了cDNA。我们研究了几种两性和阳离子氨基酸在表达克隆小鼠ATB的人视网膜色素上皮（HRPE）细胞中的转运0,+在相同条件下，也测量了单独转染载体的细胞中这些氨基酸的转运，以控制内源性转运活性。小鼠ATB中所有13种被测氨基酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His、Gln、Asn、Leu、Ile、Phe、Trp和Arg）的转运活性均显著升高0,+cDNA转染细胞比载体转染细胞（数据未显示）。除甘氨酸外，所有氨基酸的cDNA诱导的转运活性增加在16%至190%之间。在cDNA转染的细胞中，甘氨酸的转运异常高。与载体转染细胞的转运活性相比，增加了38倍。
由于甘氨酸通过小鼠ATB运输0,+与其他氨基酸的转运相比明显更高，我们使用甘氨酸作为底物进一步表征克隆的转运蛋白。图中给出的结果仅代表ATB0,+-修正内生运输活动后的具体运输活动。ATB公司0,+-介导的甘氨酸转运必须依赖钠的存在+和Cl–.通过小鼠ATB运输甘氨酸0,+用迈克尔利斯·曼顿常数饱和(K（K）t吨)210±18μM。Na的数量+和Cl–然后，Na对运输过程中涉及的离子进行分析+-活化动力学和氯离子–-活化动力学。小鼠ATB的转运活性0,+钠的浓度与乙状结肠有关+和Na活化过程的希尔系数+为2.0±0.1。相反，小鼠ATB的转运活性0,+与Cl浓度呈双曲线关系–Cl活化过程的希尔系数–为0.7±0.1。这些结果表明Na+/氯离子–/甘氨酸的化学计量比为2:1:1。这个K（K）0.5Na的值+和Cl–（即诱导半最大转运活性所需的离子浓度）分别为25±1和18±8 mM。
小鼠ATB的功能特性0,+在以甘氨酸为底物的哺乳动物细胞表达系统中。结果仅代表ATB0,+-特定转运活性，通过从cDNA转染细胞的转运中减去载体转染细胞中的转运来计算。(一)ATB的离子依赖性0,+-介导甘氨酸（60 nM）转运。(b条)ATB饱和动力学0,+-介导的甘氨酸转运。(c)纳+-ATB活化动力学0,+-介导甘氨酸（60 nM）转运。(d日)氯–-ATB活化动力学0,+-介导甘氨酸（60 nM）转运。
小鼠ATB的氨基酸特异性0,+然后通过评估各种氨基酸的竞争能力进行研究[三H] -甘氨酸（60 nM）用于克隆转运体介导的转运过程（表). 在2.5 mM的浓度下，所有测试的两性离子和阳离子氨基酸都抑制了[三H] -小鼠ATB介导的甘氨酸0,+抑制率从70%到100%不等。相反，天冬氨酸阴离子氨基酸和N个-甲基化氨基酸，α-（甲胺基）异丁酸（MeAIB），没有表现出任何明显的抑制作用。这些数据表明克隆小鼠ATB0,+能够调节钠中两性和阳离子氨基酸的运输+-和Cl–-耦合方式。
通过ATB转运NOS抑制剂0,+.
然后，我们评估了浓度为2.5 mM的NOS抑制剂及其母体氨基酸（精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸）与[三H] -小鼠ATB介导的转运过程中的甘氨酸（10μM）0,+在HRPE电池中（表). 所有四种亲本氨基酸均显著抑制小鼠ATB的甘氨酸转运0,+抑制率在55%到85%之间。同样，所有测试的NOS抑制剂也抑制ATB0,+-介导的甘氨酸转运。精氨酸型一氧化氮合酶抑制剂的抑制作用L（左）-国家核管理局；N个G公司-硝基-L（左）-精氨酸甲酯(L（左）-名称）；N个G公司-一甲基-L（左）-高精氨酸(L（左）-NMMHA）；N个G公司,N个G公司-二甲基-L（左）-精氨酸(L（左）-NDMA）；N个G公司-单乙基-L（左）-精氨酸(L（左）-NMEA）；N个G公司-一甲基-L（左）-精氨酸(L（左）-NMMA）；和N个G公司-L（左）-硝基-L（左）-精氨酸苄酯(L（左）-NABE）在30–80%的范围内。赖氨酸型一氧化氮合酶抑制剂L（左）-N个6-（1-亚氨基乙基）-赖氨酸(L（左）-NIL）引起35%的抑制。L（左）-硫菌灵(L（左）-TC）和S-甲基-L（左）-硫代瓜氨酸(L（左）-MTC）是基于瓜氨酸的NOS抑制剂，作为ATB抑制剂非常有效0,+-介导甘氨酸转运，抑制率在70-85%之间。鸟氨酸衍生物L（左）-N个5-（1-亚氨基乙基）-鸟氨酸(L（左）-NIO）引起40%的抑制。L（左）-Canavanine和α-胍基谷氨酸(L（左）-GGA）都是胍基衍生物，也是有效的抑制剂，分别造成75%和40%的抑制。
图描述了抑制ATB的剂量-反应关系0,+-通过六种NOS抑制剂介导甘氨酸转运。抑制效力的顺序如下：L（左）-TC（牵引力控制）>L（左）-NNA>L（左）-MTC公司=L（左）-NMMA>L（左）-NIO公司=L（左）-无。IC50值（即引起50%抑制所需的化合物浓度）如下：L（左）-TC（0.21±0.03 mM），L（左）-NNA（0.56±0.04mM），L（左）-MTC（0.73±0.09mM），L（左）-NMMA（0.77±0.12 mM），L（左）-NIO（2.65±0.25 mM），以及L（左）-零（2.60±0.29 mM）。
抑制ATB的剂量反应关系0,+-NOS抑制剂在表达克隆小鼠ATB的HRPE细胞中特异性甘氨酸（10μM）转运0,+.
这些结果表明，所有测试的NOS抑制剂都与克隆小鼠ATB的底物结合位点相互作用0,+然而，这些数据表明但不能证明这些NOS抑制剂是转运蛋白的可转运底物。一些化合物可能会通过与甘氨酸竞争结合到底物结合位点而阻止转运，而自身却不会跨膜转运。为了确定这些抑制剂是否真的是转运蛋白的可转运底物，直接测量ATB0,+-必须进行这些抑制剂的介导转运。为了实现这个目标，我们使用了[三【H】-L（左）-NNA作为ATB基板0,+并研究了其在表达克隆转运体的HRPE细胞中的转运（图). 运输L（左）-ATB中的NNA0,+-表达细胞是载体转染细胞的四倍，表明L（左）-NNA确实是这种转运体的可运输基质。ATB的抑制进一步支持了这一结论0,+-特定的L（左）-NNA通过作为转运蛋白底物的甘氨酸、丝氨酸和精氨酸转运。相反，非转运蛋白底物的MeAIB和谷氨酸不能抑制ATB0,+-特定的L（左）-NNA运输。ATB公司0,+-特定的L（左）-NNA转运是饱和的，迈克利斯·蒙顿常数为0.75±0.10 mM。
的特征L（左）-通过ATB传输NNA0,+克隆小鼠ATB0,+在HRPE细胞中表达[三【H】-L（左）-研究了NNA（10μM）。结果仅代表ATB0,+-特定运输。(一)运输L（左）-载体转染细胞和ATB中的NNA0,+cDNA转染细胞。(b条)抑制ATB0,+-特定的L（左）-NNA通过氨基酸（5 mM）运输。(c)饱和动力学L（左）-通过ATB传输NNA0,+.
哺乳动物表达系统不适合用于研究广谱NOS抑制剂通过ATB的转运0,+由于放射性标记形式的NOS抑制剂的商业可用性有限。因此，我们不得不使用另一种方法直接测量大量NOS抑制剂通过ATB的转运0,+。我们使用了X·莱维斯卵母细胞表达系统。克隆小鼠ATB0,+通过注射cRNA在这些卵母细胞中进行功能性表达，然后使用双微电极电压灯技术通过这些抑制剂诱导的内向电流监测NOS抑制剂（1 mM）通过转运体的转运。由于ATB的电性，这种方法是可行的0,+ATB暴露时的向内电流的感应0,+-在电压钳制条件下将卵母细胞表达到受试化合物中，表明化合物进入卵母细胞后，膜发生去极化。在这些实验中，未注射的卵母细胞作为阴性对照。这些卵母细胞实验的结果见表.所有测试的NOS抑制剂，除了L（左）-名称，L（左）-NABE，以及L（左）-GGA在表达克隆ATB的卵母细胞中诱导显著内向电流0,+电流在30–500 nA范围内变化。相对而言，L（左）-姓名，L（左）-NABE和L（左）-GGA感应的电流很小（10–15 nA）。氨基酸精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸诱导的电流范围为130–550 nA。
进一步详细分析NOS抑制剂通过ATB的转运0,+在卵母细胞表达系统中，我们选择了三种NOS抑制剂，即L（左）-无，L（左）-MTC，以及L（左）-NIO公司。我们根据这些化合物对不同NOS亚型的选择性选择这些化合物：L（左）-NOS II为零，L（左）-NOS I的MTC，以及L（左）-NOS III的NIO图描述了由L（左）-NIL和L（左）-MTC公司。在NaCl存在下，L（左）-1 mM浓度的NIL诱导82±18 nA内向电流。然而，当在NMDG氯化物存在下测量时，卵母细胞暴露于该化合物后没有可测量的内向电流，表明L（左）-NIL诱导电流必然依赖于钠的存在+在葡萄糖酸钠存在的情况下（即在没有氯化物的情况下），该化合物确实诱导了一个小而显著的电流（～10 nA）。然而，由于L（左）-本实验中使用的NIL是氯化物盐，在这些实验条件下存在少量氯化物。这导致观察到的电流感应。这得到了以下数据的支持L（左）-MTC，以无氯化物形式提供。在存在NaCl的情况下，L（左）-浓度为1mM的MTC诱导了116±34nA的内向电流。但当Na+或Cl–缺席，表明L（左）-MTC诱导的内向电流完全依赖于两种钠的存在+和Cl–.由L（左）-NIL和L（左）-关于Na存在的MTC+和Cl–与用精氨酸获得的数据相似。当用作不含氯化物的盐时，精氨酸诱导382±57nA的内向电流。在没有Na的情况下，未观察到精氨酸的可测量电流+或Cl–.
诱导的内向电流的离子依赖性L（左）-精氨酸，L（左）-无，以及L（左）-MTC输入X·莱维斯表达克隆小鼠ATB的卵母细胞0,+卵母细胞在含有氯化钠、葡萄糖酸钠或NMDG氯化物的缓冲液中与1 mM底物融合。
然后我们分析了L（左）-MTC、，L（左）-无，以及L（左）-通过ATB的NIO0,+在卵母细胞表达系统中，使用相应抑制剂诱导的内向电流作为其转运的测量。这些实验的结果如图所示，证明ATB0,+-所有三种化合物的介导转运都是饱和的。这个K（K）0.5在膜电位-50 mV下计算的值（诱导半最大电流所需的化合物浓度）分别为1.36±0.08 mM、2.72±0.29 mM和2.24±0.35 mML（左）-MTC、，L（左）-无，以及L（左）-分别为NIO。这个K（K）0.5然而，这三种化合物的值都受到膜电位的影响。这些值随着膜的超极化而降低，随着膜的去极化而增加。
NOS抑制剂通过ATB转运的饱和动力学0,+在里面X·莱维斯卵母细胞表达系统。表达克隆小鼠ATB的卵母细胞o、+随着L（左）-MTC、，L（左）-NIL，以及L（左）-并且在电压箝位条件下测量向内电流。上面板表示基板浓度和-50 mV内向电流之间的关系。下面板表示K（K）0.5值和膜电位。
讨论
在本文中，我们提供了NOS抑制剂通过钠转运的证据+-和Cl–-耦合ATB0,+这是首次发现离子梯度驱动的这些潜在治疗药物的集中转运系统。支持ATB的证据0,+-通过ATB获得NOS抑制剂的介导转运0,+从小鼠结肠克隆。克隆ATB的转运功能0,+通过在哺乳动物细胞以及X·莱维斯卵母细胞。这种方法使我们能够直接研究多种NOS抑制剂通过转运体的转运。NOS抑制剂在性质上可以是阳离子型或两性离子型。先前的研究表明，阳离子NOS抑制剂通过系统y运输+而两性离子型一氧化氮合酶抑制剂由系统L转运(17–21). 系统y+不与两性离子NOS抑制剂相互作用，系统L不与阳离子NOS抑制剂交互作用。我们目前的研究表明，ATB0,+能够运输阳离子和两性离子NOS抑制剂。这与该转运体的底物特异性相一致。自动变速箱0,+识别阳离子氨基酸以及两性离子氨基酸作为底物。在ATB的氨基酸底物中0,+转运蛋白如何处理氨基酸精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸与本研究直接相关，因为目前正在研究中使用的大多数NOS抑制剂在结构上与这四种氨基酸有关。尽管精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸是阳离子的，瓜氨酸是两性离子的，但我们目前的研究表明，这四种氨基酸都是ATB的可运输底物0,+类似地，大多数与四种氨基酸结构相关的NOS抑制剂，无论是阳离子型还是两性离子型，都是通过ATB转运的0,+.
在迄今为止已知的识别NOS抑制剂为底物的三种氨基酸转运蛋白中，ATB0,+是最集中的。这种转运体由钠的跨膜梯度联合激发+和Cl–以及膜电位。相反，系统y+仅由膜电位驱动，系统L最有可能是促进性的，没有已知的驱动力。因此，NOS抑制剂进入表达ATB的细胞0,+很可能是高度集中的。这些细胞中NOS抑制剂的细胞内浓度可能会达到细胞外浓度的几倍。
我们测定了6种NOS抑制剂对ATB的亲和力0,+在哺乳动物细胞表达系统中，它们能够与氨基酸底物竞争进行转运过程。这些是L（左）-NNA和L（左）-NMMA（两者在结构上均与精氨酸有关），L（左）-NIL（与赖氨酸结构相关），L（左）-TC和L（左）-MTC（两者在结构上均与瓜氨酸有关），以及L（左）-NIO（在结构上与鸟氨酸有关）。IC50这六种化合物的值在0.2–2.7 mM范围内变化L（左）-NNA，我们还直接通过ATB转运确定亲和力0,+在同一哺乳动物细胞-表达系统中。常量K（K）t吨通过直接测量输运计算得出的结果与IC非常相似50竞争抑制研究计算的值（0.75±0.10 mM vs.0.56±0.04 mM）。对于其他三种NOS抑制剂(L（左）-MTC、，L（左）-无，以及L（左）-NIO），我们确定了它们通过ATB传输的迈克利斯·蒙顿常数0,+使用X·莱维斯卵母细胞表达系统。这个K（K）t吨从这些实验中计算出的值与相应的IC相似50使用哺乳动物细胞表达系统进行的竞争性抑制研究确定的值（1.36±0.08 mM对0.73±0.09 mML（左）-MTC；对于L（左）-零；和2.24±0.35 mM对2.65±0.25 mML（左）-NIO）。
NOS抑制剂通过ATB的转运0,+具有重要的药理和临床意义。这表明ATB0,+有潜力用作NOS抑制剂的药物输送系统。我们克隆了ATB0,+从鼠标的结肠。但是，有足够的证据表明，这种转运系统不仅在结肠中表达，而且在远端小肠中也表达(16,27). 运输功能已被证明存在于回肠粘膜细胞的刷状缘膜中(16,27). 自动变速箱0,+在本研究中，仅在肠道远端（回肠、盲肠和结肠）检测到mRNA。ATB的表达模式0,+沿着肠道纵轴的mRNA很有意思，并且与该转运体作为NOS抑制剂传递系统的潜在用途有关。据我们所知，ATB的限制表达0,+在远端肠道中，氨基酸转运蛋白是唯一的。来自膳食蛋白质的氨基酸主要在近端小肠吸收，因此肠道远端的氨基酸浓度较低。因此，NOS抑制剂和内源性氨基酸之间通过ATB转运的竞争将很小0,+这将提高NOS抑制剂的肠道吸收效率。
肠道刷状缘膜中还有另外两个氨基酸转运系统，可能参与NOS抑制剂从肠腔的摄取。这些是系统y+和系统b0,+.系统y的能力+输送阳离子NOS抑制剂的方法已经很成熟。相比之下，关于系统b能力的可用信息非常少0,+运输NOS抑制剂。由于该转运系统能够与两性和阳离子氨基酸相互作用，我们预测该系统能够处理两性和阳离子NOS抑制剂。我们最近的研究确实证明了系统b0,+至少部分负责两性离子NOS抑制剂的摄取L（左）-NNA穿过肠道刷状缘膜(22). 然而，两个系统y+和系统b0,+不受任何离子梯度的驱动。因此，我们推测ATB0,+与Na跨膜梯度的能量耦合+和Cl–，可能比系统y效率更高+和系统b0,+NOS抑制剂从内腔吸收到肠道和结肠吸收细胞。
NOS抑制剂的口服生物利用度不仅取决于这些化合物在肠道和结肠刷状缘膜中是否存在进入途径，还取决于基底侧膜中是否有退出途径。肠道基底外侧膜中有两个氨基酸转运系统，可能与NOS抑制剂从肠道和结肠吸收细胞进入血液有关。这些是系统L和系统y+L（左）(16). NOS抑制剂通过ATB被肠道和结肠上皮细胞吸收0,+，系统y+和系统b0,+，可以通过系统L和y穿过基底外侧膜离开这些细胞+L。
本研究也可能与NOS抑制剂治疗肠道和结肠炎症具有临床相关性。有令人信服的证据表明炎症期间肠和结肠上皮细胞中NOS II的诱导(28,29). 一氧化氮在肠道的正常生理功能以及细菌性脓毒症和炎症性肠病等病理状况中起着重要作用(30). 值得注意的是，炎症性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩病主要涉及结肠和/或回肠，即ATB的部位0,+主要表达于肠道。使用ATB的想法0,+由于NOS抑制剂的输送系统在炎症性肠病的临床治疗中特别有吸引力，在肠道和结肠上皮细胞中诱导NOS II。自动变速箱0,+是一种高浓度的转运蛋白，因此NOS抑制剂将被肠道和结肠上皮细胞非常有效地吸收，并在细胞内高浓度积聚。这将导致有效抑制这些细胞中NOS II的方法。此外，肠腔中的一氧化氮合酶抑制剂将与精氨酸竞争，精氨酸是一氧化氮合酶II的底物，通过ATB转运到细胞中0,+从而降低精氨酸对NOS II活性的可用性。因此，ATB0,+将允许NOS抑制剂代替精氨酸进入细胞。这将通过降低精氨酸（NOS II底物）的可用性和增加NOS抑制剂的细胞内浓度，有效抑制NOS II活性。
