巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞将病原体内化是先天免疫反应的重要组成部分。入侵的微生物被困在一个膜结合的液泡（吞噬体）中，随后被清除。吞噬体通过一系列融合反应（统称成熟）逐渐获得杀菌特性。内腔进行性且最终深度酸化是吞噬体成熟的一个独特且重要的特征。管腔pH值小于5.5(1,2)通过依赖液泡型ATP酶（V-ATP酶）的过程(三). 除了直接影响细菌生长外，吞噬体酸化对于多种杀菌成分的最佳活性至关重要，包括降解酶和几种活性氧中间体的生成。
虽然已知V-ATP酶参与酸化，但吞噬体pH值的决定因素尚不清楚。V-ATP酶存在于中性粒细胞和巨噬细胞中，但只有后者表现出快速而深刻的吞噬体酸化，而中性粒细胞吞噬体最初碱化，随后仅产生适度的酸化(1,4). 有人建议H+NADPH氧化酶副产物的消耗解释了这种差异行为(4)，但可能涉及其他因素。具体来说，因为V-ATP酶是电性的(5)酸化速度和/或程度的差异可能是由吞噬体膜的反离子渗透性的变化引起的。的确，最近的一份报告(6)注意到，在CFTR-null小鼠的巨噬细胞中，吞噬体的酸性较小，并将这种差异归因于氯离子（反离子）电导降低。
如果反离子电导受到限制，V-ATP酶将无法产生相当大的质子浓度梯度，而ATP水解产生的更大比例质子动力将用于产生跨膜电位（内部为正）。因此，质子动力的电气和化学成分之间的平衡逐渐发生变化(永磁同步电机)被认为是内吞和分泌途径进行性酸化的机制之一。尽管两个细胞器都含有V-ATP酶，但反离子通道（或其他导电实体）的日益丰富可以解释为什么溶酶体比早期内体酸性更强。或者，H的差异表达+“泄漏”可能是罪魁祸首。
要区分这些模型和更全面地了解细胞器酸化的决定因素，就需要精确定量细胞器的成分永磁同步电机.可靠的方法就地吞噬体和其他内吞细胞器的pH值测定已有十多年的历史(7,8). 相比之下，测量穿过内吞细胞器膜的电势几乎是不可能的。在这里，我们提出了一种基于FRET的方法来测量活巨噬细胞吞噬体膜产生的电位。从这些实验中获得的数据使我们能够获得有关吞噬体离子渗透性的信息，并对该细胞器的质子运动特征进行更定量的描述。
结果和讨论
内吞细胞器体积小且不易接近，因此无法通过常规电生理手段进行分析。为了规避这些限制，我们使用了电位荧光染料。这种探针是膜渗透的，可以进入内吞室。然而，内膜细胞器的高密度和多样性使得不可能分离出内体、溶酶体或甚至更大的细胞器如吞噬体的贡献。因此，必须将测量范围限定在感兴趣的细胞器。为此，我们设计了一种基于显微镜的方法，在细胞器特异性供体和膜电位敏感受体染料之间使用FRET。由于共振能量转移需要供体和受体之间接近（≤10nm），将FRET伴侣之一靶向吞噬体限制了对该细胞器的测量。
电位敏感探头第二类-（1,3-二丁基巴比妥酸）五甲基酮，称为DiBAC4(5)，用于测量吞噬体电位。这种脂溶性阴离子染料根据其跨膜电位在膜上进行分离。作为FRET的供体，我们用7-二乙氨基香豆素-3-羧酸（DACCA）共价标记吞噬颗粒。该反应是通过将羊红细胞（sRBC）与DACCA的琥珀酰酯衍生物孵育而完成的，从而形成稳定的酰胺键(A类). 如所示 C类和D类sRBC上活性氨基的丰富使得颗粒标记强烈且均匀。
FRET供体和受体的特征。(A类)sRBC通过与DACA的琥珀酰亚胺酯衍生物孵育来标记。(B类)DACCA的激发（固体）和发射（点）光谱：sRBC（黑色）和oxonol（灰色）。灰色条表示用于可视化FRET的激励和发射带宽。(C类和D类)盖玻片上标记的sRBC与(C类)或不带(D类)DiBAC公司4(5). 在DACCA、DiBAC中采集的图像4(5)图中显示了cFRET通道和相应的差分干涉对比显微镜（DIC）图像。（比例尺：10μm）
标记粒子（DACCA:sRBC）和DiBAC的激发（实线）和发射光谱（虚线）4(5)如所示B类。还显示了用于测量FRET的带宽。值得注意的是，施主发射光谱和受主激发光谱之间存在相当大的重叠，这预示着稳健的能量转移，以及激发和敏化FRET发射之间的较大（≈250 nm）斯托克斯位移，这将施主发射的泄漏降到最低。重要的是，两种DiBAC的荧光4(5)和DACCA:sRBC在pH值（4.5至7.5）范围内几乎对pH不敏感，这包括吞噬体内粒子遇到的条件[支持信息（SI）图5A类].
当用不断增加的DiBAC滴定DACCA:sRBC悬浮液时4(5)观察到施主的发射降低，而受主的发射相应增加(SI图5B类)，表示荧光团经历FRET。同样，当标记的sRBC在显微镜下可见并与DiBAC孵育时4(5)，FRET信号很容易检测到。FRET通道中检测到的并针对任何泄放（cFRET）进行校正的发射如所示C嵌入如预期的那样，当任一供体(D嵌入)或仅存在受体（未显示）。
在确认FRET对的有效性后，我们继续测量吞噬体膜电位（ΨΦ). 将RAW264.7系培养的小鼠巨噬细胞（以下简称RAW细胞）内化DACCA标记的或未标记的IgG调理的sRBC 5分钟。去除多余颗粒后，低渗溶解所有粘附（未内化）的sRBC，然后将形成的吞噬体静置15分钟。成像前，250 nM生物活性炭4(5)添加到培养基中，使其在细胞膜上达到平衡。在整个巨噬细胞中都可以看到oxonol( B类和E类)但从吞噬体发出的信号很难辨别。然而，在摄入DACCA:sRBC的巨噬细胞中，cFRET信号明显可检测到，并且仅限于吞噬体（相比之下 C类和F类). 请注意，即使在同一巨噬细胞内，cFRET信号的强度也因吞噬体而异，这表明存在固有的异质性。
活巨噬细胞中的FRET。RAW细胞被允许内化标记的(A–C)或未标记(D–F)sRBC，与250 nM DiBAC平衡4(5)、和图像。驾驶员信息中心(A类和D类)，接受者(B类和E类)和cFRET(C类和F类)给出了一个典型场的荧光图像。DiBAC公司4(5)分布于整个巨噬细胞(B类和E类)与cFRET相比，cFRET仅限于吞噬体(C类). 这个插图在里面C类和F类显示供体信号。（比例尺：10μm）
由于与标记的sRBC相关联的DACCA的量是固定的，实际上是恒定的，cFRET信号将主要随着DiBAC浓度的变化而变化4(5)在他们附近。因此，cFRET荧光实际上是Ψ的间接测量Φ。我们设计了一个校准程序来推导Ψ的大小ΦcFRET强度。校准的基本原理如图所示A类我们设想该系统由三个隔间组成：（隔间1）细胞外介质，（隔间2）细胞溶质和（隔间3）吞噬体内（管腔）隔间，由两层膜隔开。电位差（Ψ颗粒物)已知存在于分隔隔间1和隔间2的质膜上，而不同的电位（ΨΦ)推测存在于吞噬体膜上。每个隔室中的酮醇浓度将由这两个串联的电位决定。具体而言，对于给定的氧代醇细胞外浓度(C类1)，游离细胞溶质浓度(C类2)平衡态严格是Ψ的函数颗粒物反过来，自由吞噬体内浓度(C类三)将是两者的函数C类2和ΨΦ假设根据能斯特方程，自由氧酚在膜上进行分配，五个变量之间的关系可以用方程明确描述
哪里R（右）,T型、和F类分别是气体常数、温度（开氏度）和法拉第常数，以及z（z）=−1，DiBAC的电荷4(5). 因此，ΨΦ可以计算以下值C类2和C类三定义。的价值C类三通过外部校准确定，通过测量自由DACCA:sRBC中记录的cFRET强度，同时使用越来越多的DiBAC进行滴定4(5)在体外即，在没有RAW单元的情况下。然后使用得到的校准曲线计算吞噬体内DiBAC4(5)来自在任何给定吞噬作用实验中记录的吞噬体cFRET信号的浓度。B类给出了平均14个外部滴定实验得到的校准曲线。虚线表示最适合的对数最小二乘(R（右）2=0.991）用于插值C类三根据测量的cFRET值。
咽粘膜电位测量。(A类)用于计算Ψ的变量Φ该系统由细胞外（隔室1）、细胞内（隔室2）和吞噬体内（隔室3）空间组成。游离DiBAC的浓度4(5)在每个隔间中显示为Cx个，其中x个表示隔间。隔室1和隔室2由质膜分隔，隔室2和隔室3由吞噬体膜分隔，每个隔室的跨膜电位为Ψ颗粒物和ΨΦ,分别是。(B类)用于计算C的外部校准三从游离DACCA:sRBC中记录.cFRET，同时滴定更多的DiBAC4(5). 然后将吞噬体内测得的cFRET量转化为吞噬体内的DiBAC4(5)浓度（C三)通过使用经验生成的校准曲线。每个数据点代表14个单独校准的平均值±SEM；用于插值C的对数最小二乘最佳拟合三测量的cFRET值用虚线表示。(C类) Ψ颗粒物使用DiBAC进行测量4(5)（填充钢筋；n个=10个实验）和电流钳模式下的细胞贴附膜片钳记录（开条，n个=三个实验中的10个细胞）。DiBAC的代表性校准曲线4(5)荧光vs.Ψ颗粒物如所示SI图6. (D类)两种不同的细胞外DiBAC4(5)在吞噬DACCA后，将浓度添加到RAW细胞中：测量sRBC和cFRET。数据说明了ΨΦ使用125 nM（填充钢筋）和250 nM DiBAC测量4(5)添加1μM康那霉素A之前（基线）和之后（开条）。数据分别为从左至右的8、24、5和6个实验的平均值±SEM。星号表示具有统计显著性(P（P）<0.05）与相应基线的差异，通过使用不成对t吨测验。
C类2可以计算知道C类1和Ψ颗粒物前者等于加入到沐浴液中的羟酚的量。Ψ颗粒物通过两种不同的方法进行经验测定(C类). 首先，我们测量了Ψ颗粒物电生理学上，在细胞附着结构中修补巨噬细胞并以电流灯模式记录(9). 这些测量得出的平均电势为−69.1±3.7 mV(n个=10个单元格；C类). 其次，我们使用了DiBAC4(5)和阳离子电离层校准程序(2)估计Ψ颗粒物荧光测定（代表性校准曲线如所示SI图6). 该方法估计的电势平均为−69.7±5.7 mV(n个=10个实验；C类). 这些测量结果不仅相互吻合，而且与早期RAW巨噬细胞膜电位的测定结果也一致(10).
使用这些参数，我们继续估计ΨΦ.两种不同的细胞外DiBAC4(5)浓度(C类1=125和250 nM）用于最小化因低浓度结合导致的染料耗尽或因过量游离染料导致的毒性效应或信噪比降低导致的可能混淆效应。在中使用外部校准曲线B类，我们计算了一个ΨΦ当使用125 nM染料时，+27.2±5.1 mV（相对于细胞质的流明）(n个=8次实验）和+27.8±2.0 mV(n个=24）当使用250 nM时(D类). 根据对氯化物浓度的测量以及对该阴离子的电导占主导地位的假设，推测内体中存在类似的（10–20 mV）内正电位(11).
作为V-ATP酶，吞噬体酸化的主要贡献者(三)，是一个电动泵，我们评估了它对Ψ的贡献Φ在监测电位的同时，通过添加特异性抑制剂康那霉素A阻止质子泵送。抑制V-ATP酶使电压降低了近50%，降至+10.7±1.4 mV(n个=5）当使用125 nM DiBAC测量时4(5)至+17.1±4.7毫伏(n个=6）当使用250 nM时(D类)表明V-ATP酶是Ψ的主要决定因子Φ然而，尽管V-ATP酶被完全抑制，但吞噬体膜上的电位并没有完全消失，这意味着存在其他参与过程。
向内K产生的扩散势+梯度原则上可以解释残留的吞噬体电压。在本研究中使用的巨噬细胞中，细胞内（主要是细胞溶质）[K+]通过火焰光度法测量的平均值为136±11 mM（四个实验的平均值±SE）（参见SI图6). 吞噬体内[K+]然而，这一点尚未明确确立。使用电子探针x射线显微分析测量中性粒细胞中的K+含量≈300 mM(12). 尽管本报告的作者认为+这一假设是自由的，但有争议的，因为它意味着吞噬体内的渗透压将大大超过胞浆的渗透压。获得自由吞噬体[K的独立估计+]我们使用基于电中性K的零点滴定法+/H（H）+交换电离层（参见SI图7详细信息）。这些测定得出自由[K+]≈20 mM。细胞溶质到管腔K的方向和大小+因此，梯度足以解释（或促成）抑制电动质子泵后剩余的电位差。确认存在K+-传导通路必须等待电生理手段的直接测量。
虽然质子泵在稳态下对跨膜电压的贡献相对较小（≈14 mV），但预计在酸化的早期阶段会更大。这一预测源于观察到吞噬体封闭后立即记录的酸化速率(SI图8)远大于稳定状态下康乃霉素暴露的质子泄漏初始速率(D类)，这反过来等于该阶段的泵送速率。V-ATP酶周转减少，至少部分是由于永磁同步电机穿过吞噬体膜，阻止ATP驱动的质子移位。腔H的变构抑制作用+也可能导致经济放缓。无论是何种机制，我们都能通过使用NH将吞噬体pH值固定在正常稳定状态以上的水平，证明V-ATP酶对膜电位的贡献增加三，一种膜渗透性弱的基底。添加10 mM NH4Cl，与90μM NH平衡三在使用的pH值下，导致吞噬体pH值快速持续升高（未显示）。这种碱化伴随着吞噬体膜电位增加到+59.1±3.3 mV(n个=12）相对于细胞质(). 连接霉素A消除了超极化，反映出V-ATP酶活性增加(). 因此，在吞噬体成熟过程中，吞噬体膜电位可能会发生变化，在早期达到最大值，并随着腔内酸化降低泵送速率而下降。
V-ATP酶的能量学。FITC-标记sRBC(A类)作为吞噬性猎物添加到RAW细胞中(插入)用于吞噬体pH值测量。吞噬作用持续5分钟，然后在比率成像前进行15分钟的成熟期。获取实验数据后就地进行了校准。代表性校准曲线如所示B类.平均基线管腔pH值为5.22±0.03(n个=37个实验）。(C类)单个吞噬体的典型pH值曲线。在获得基线pH值后，添加康那霉素A以抑制V-ATP酶，并监测pH值的增加。全日空航空公司4添加Cl（2 mM）使吞噬体暂时碱化，以计算缓冲力，然后就地校准。(D类)允许噬菌体形成并达到稳定pH值。接下来，如箭头所示，通过添加1μM康那霉素a抑制V-ATP酶，并以指定浓度添加FCCP，如记录所示。痕迹代表每种条件下的三到五次实验。(E类)碱化率与FCCP浓度的关系，如D类数据是至少三个单独实验中≥25个吞噬体的平均值±SEM。(插入)数据的Eadie-Hofstee线性化。
表1。
| 条件 | ΨΦ，毫伏 | 扫描电镜 | n个 | P（P）价值 |
|---|
| 基线 | +27.8 | 2.02 | 24 | — |
| +混凝土。A类 | +17.1 | 4.70 | 6 | 0.03 |
| +NH公司三 | +59.1 | 3.29 | 12 | <0.0001 |
| +混凝土。A+NH三 | +15.7 | 3.83 | 6 | 0.0119 |
通过结合吞噬体电压记录和跨膜pH梯度的独立测量，我们能够直接估计永磁同步电机穿过吞噬体膜。测量永磁同步电机然后可以应用于更好地制定V-ATP酶的能量学。用pH-敏感荧光染料共价标记sRBC测定管腔pH值( A类和B类). 如前所述(1–三)，我们发现吞噬体酸化在封闭后很快开始，在几分钟内达到一个稳定值，并持续很长一段时间(SI图8). 在摄入颗粒15–25分钟后进行的37次测定中，吞噬体pH值平均为5.22±0.03。同时，我们还使用SNARF-5F测定了细胞溶质的pH值。这些测量得出的pH值为7.37±0.03(n个=7个实验，每个实验测量≥40个细胞），用于RAW细胞的胞浆，因此吞噬体膜的ΔpH值为2.15个pH单位。根据这些测量结果永磁同步电机在稳定状态下（摄入颗粒后15–25分钟），通过吞噬体膜计算达到15.4 kJ/mol，其中2.7 kJ/mol。
我们对pmf公司使我们能够评估当吞噬体pH值达到稳定值时，质子泵是否处于或接近电化学平衡。最大值永磁同步电机由V-ATP酶产生的自由能可以从ATP水解的自由能计算出来，在胞浆中普遍存在的条件下，自由能约为58 kJ/mol(13). 在大的pH梯度下，假设酶复合物每水解一个ATP就转移大约两个质子(14,15)，在这种情况下永磁同步电机不能超过29 kJ/mol。该值几乎是永磁同步电机我们通过实验确定，这意味着整个过程的耦合是不完美的。这种不完美的耦合可能是由于泵送反应的效率不完全（即，在泵送循环期间，ATP的一些能量可能会作为热量耗散）和/或存在显著的H+（等效）稳态泄漏，在这种情况下，V-ATP酶不会达到电化学平衡。后一种可能性在药理学上得到了解决。如所示C类，在监测管腔pH值的同时用刀豆霉素A阻断V-ATP酶，导致缓慢但可重复的碱化，表明持续的H+泄漏。总之，这些观察结果表明，吞噬体的pH不是处于热力学平衡，而是处于由内源性H决定的稳定状态+（等效）泄漏途径，正如其他人早些时候得出的结论(2).
为了使pH值保持不变，泄漏通量的大小必须与泵送速率相同。因此，我们能够通过更精确地定量稳态泄漏，进一步了解吞噬体V-ATP酶的特性。泄漏通量是pH变化率乘以吞噬体缓冲能力的乘积，测定为113.8±4.6 mM/pH(n个=26）用所述的弱电解质脉冲(16). 这个大值可能是由于用作吞噬目标的红细胞的高蛋白（主要是血红蛋白）浓度所致。假设平均吞噬体直径为4μm，我们计算泄漏通量为1.92×10−10摩尔/厘米2因此，在稳定状态下，V-ATP酶必须泵出H+在相反方向上具有相同大小的通量。因为泵是电动的，这个流量相当于3.09×10的电流−3pA/微米2通过将这些泵电流测量值与早期测定的V-ATP酶周转率相结合，我们可以估计吞噬体内活性V-ATP酶的数量。经计算，摄入sRBC形成的噬菌体含有2300个V-ATP酶。该计算假设人员流动率≈200 ATP/s（M.Forgac，个人通信），化学计量比为2H+每个ATP(15)，并可能提供吞噬体V-ATP酶密度的下限估计值。
尽管可以测量，但Ψ的贡献Φ到吞噬体永磁同步电机相对较小（2.7 kJ/mol为15.4 kJ/mol.）。这一观察表明存在相当大的反离子电导。为了通过实验验证这一概念，我们通过测量吞噬体pH梯度的耗散率间接估计了反离子的渗透性。如所示 C类和D类加入康那霉素后，自发碱化速度较慢。导电原卟啉羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）的加入以浓度依赖的方式显著加速了碱化( D类和E类)这意味着抑制V-ATP酶后pH梯度的消散受到H的低固有通透性的限制+FCCP的效果是饱和的，在≥10μM时达到最大碱化速率(E类). 由于FCCP诱导的流变通量必须与相同的反离子通量相匹配，以保持电中性，因此可以使用碱化速率的测量来指定反离子电导的下限。通过使用Eadie-Hofstee公式对数据进行线性化，计算出0.11 pH/min的最大碱化速率（图。4E嵌入). 考虑到sRBC吞噬体的缓冲能力和表面积，我们估计反离子电流至少为13×10−3pA/微米2.在所使用的高浓度原藻时，ΨΦ可以假设接近H+逆转电位，可通过测定吞噬体内和细胞溶质pH值计算得出。使用计算出的ΨΦ，我们估计反离子电导为0.089–0.11 pS/μm2该电导携带的电流大大超过V-ATP酶在稳态下产生的电流（3.1×10−3pA/微米2)表明泵送不受反离子渗透率的限制。
后一结论与使用缬氨霉素（一种导电K+电离层。在达到稳态pH的吞噬体中加入缬氨酸霉素不会促进进一步的酸化，即使管腔中含有高[K+]因为K的存在+-吞噬过程中的富液。此外，抑制V-ATP酶后pH梯度的消散速度同样不受缬霉素（未显示）的影响，这证实了内源性反离子电导超过了H+泄漏渗透性和后者限制了pH值的变化速率。
基于上述观察结果，我们提出了以下模型来解释稳定吞噬体pH值的获得和维持。在封闭后不久，吞噬体迅速酸化，因为V-ATP酶的运行不受阻碍，H的回流+等价物最少。反离子电导丰富，因此，虽然产生了可测量的电压，但它不会停止泵送，因为它对永磁同步电机与ATP水解能量相比较小（2.7 kJ/mol vs.29 kJ/mol的H+泵送）。当吞噬体腔变酸时永磁同步电机生长，逐渐对抗V-ATP酶的活性。酸性管腔pH值也可能导致泵的变构抑制。同时，被动H的大小+随着向外[H+]梯度增大。最终，泵送速率和泄漏速率变得相同，此时达到稳定的pH值。注意，在这个阶段，膜电位很小，这表明反离子电导不是最大吞噬体酸化的重要决定因素。这一结论适用于正常巨噬细胞，但不一定适用于反离子通透性异常降低的细胞，例如CFTR突变体，其阴离子电导降低可能限制质子泵，正如Di最近所描述的那样等。(6).
最后，我们认为，本文介绍的基于FRET的测定吞噬体膜电位的分析可以进行修改和扩展，以测量其他迄今为止仍无法通过其他方法获得的其他内膜室的膜电位。这些测量将提高我们对分泌和内吞途径中离子运输和pH稳态的理解。
材料和方法
试剂。
sRBC和抗sRBC的兔IgG购自MP Biomedicals（Solon，OH）。DACCA琥珀酰酯，DiBAC4(5)、异硫氰酸荧光素（FITC）和尼日尔金来自分子探针（尤金，OR）。除非另有规定，否则所有其他试剂均来自Sigma–Aldrich（密苏里州圣路易斯）。
细胞系和组织培养。
RAW264.7细胞（ATCC编号TIB-71）取自美国型培养物收集中心（Rockville，MD），并在37°C和5%CO下生长2在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中添加5%FBS（Wisent，St.Bruno，QC，加拿大）。
颗粒标记和表征。
在室温下旋转培养90分钟，在PBS（pH 8.7）中进行sRBC标记。为了与DACCA偶联，0.15%sRBC悬浮液与25–50μg/ml DACCA-SE孵育；通过使用具有0.5mg/ml FITC的6%sRBC悬浮液进行FITC标记。DACCA标记的sRBC（DACCA:sRBC）和DiBAC的激发和发射光谱4(5)通过使用F-2500荧光分光光度计（日本东京日立）获得。
实时细胞成像和FRET。
盖玻片安装在Leiden小室中，该小室温度保持在37°C，位于Leica DM IRB显微镜的工作台上，该显微镜配备有过滤轮（加利福尼亚州诺瓦托Sutter Instruments），用于在不同的激发和发射过滤器之间独立切换。使用二色镜将EXFO X-Cite 120灯（EXFO生命科学集团，加拿大安大略州米西索加）发出的光照射到样品上。发出的光由Cascade II CCD相机捕捉（Photometrics，亚利桑那州图森）。滤光片轮和相机由Metamorph/Metafluor软件（Molecular Devices，Downingtown，PA）控制。
在FRET实验中，连续获得了三个荧光通道。FRET实验中使用的滤波器组配置（列为激发/二向色/发射滤波器，均以nm±带宽为单位）如下：施主（DACCA）417±60/425/470±40；受体4(5)] 543 ± 22/565/640 ± 25; 和FRET 417±60/565/640±25。使用Youvan方法计算校正FRET（cFRET）等。(17). 在独立的实验中，供体和受体通过分别与供体或受体单独采集图像来确定供体和接收器的流出系数。所有显微镜参数，包括曝光时间和相机增益，在所有实验中都保持不变。使用Volocity 3软件（Improvision，Inc.，Lexington，MA）进行荧光强度测量。分析前对图像进行背景提取。
吞噬细胞测定。
在室温下用兔抗红细胞（20μg/ml）调理标记或未标记的sRBC 20 min。为了同步吞噬作用，在177×克然后在37°C下培养细胞5分钟，以使颗粒内化。通过在水中孵育20 s，然后进行广泛清洗，低渗溶解剩余的非内化sRBC。在成像前允许噬菌体成熟15分钟，将细胞维持在37°C。
吞噬体膜电位测量。
DACCA吞噬作用：如前所述启动sRBC。125或250 nM DiBAC4(5)将其添加到沐浴液中，并在成像前平衡7.5分钟。采集供体、受体和FRET通道的基线图像10分钟。然后用刀豆霉素A（1μM）、NH处理细胞4Cl（10 mM），或两者兼而有之。孵育3分钟后，在7分钟内采集三个通道中的图像。
确定DiBAC的量4(5)在吞噬体内，游离DACCA:sRBC放在盖玻片上并成像。增加DiBAC的数量4(5)添加到颗粒中，并对FRET的量进行成像。这样，将cFRET与[DiBAC相关的校准曲线4(5)]构建，并且吞噬体内[DiBAC4(5)]已确定。使用对数函数拟合校准数据(R（右）2= 0.991). ΨΦ按中所述进行计算结果和讨论.
噬菌体pH值测量。
如前所述，通过比率成像测量咽胃体pH值(1). 简言之，含有FITC:sRBC的吞噬体的RAW细胞成熟15分钟后，通过在485±20 nm和438±24 nm激发滤光片之间快速交替，同时使用505 nm二向色性和535±40 nm发射滤光片对其进行成像。获取实验数据后就地通过在等渗K中连续浸泡细胞进行校准+溶液（145 mM KCl/10 mM葡萄糖/1 mM MgCl2/1 mM氯化钙2/20 mM Hepes或Mes）缓冲至pH值4.5至7.0，并含有1μM nigericin。通过绘制荧光强度比（490 nm/440 nm）与pH值的关系，生成校准曲线。
测定含有sRBC的吞噬体（1 mM或2 mM NH）的缓冲能力4将PBS中的Cl添加到培养基中，监测pH值的变化，并按照Roos和Boron所述计算缓冲功率(16).
质膜电位测定。
使用标准的斑贴灯和荧光法协议测量质膜电位（参见SI图6).
