T7 RNA聚合酶的特异性环首先与启动子和延伸的转录本，表明启动子清除机制

摘要

尽管缺乏明显的单个亚单位T7 RNA之间的序列或结构同源性聚合酶（RNAP）和多亚单位RNAP转录过程在两组中高度保守酶（参考文献综述。1). 与其他RNAP的情况一样，T7RNAP形成一种不稳定的起始复合物（IC）释放长度为2–8 nt的转录物（流产起始产物）在脱离促进剂并异构化到稳定状态之前伸长复合物（EC）。鉴于生物化学和有关于T7 RNAP起始复合物的结构数据，对于向EC的过渡或特性知之甚少稳定的复合物。对发起人的识别涉及RNAP中的特异性环（氨基酸残基739-770）投射到DNA结合间隙并与结合相互作用启动子区域，位于活性基因上游7至11 bp现场（即位置−7至−11）(2,三). 从双面打印过渡结合区域中的DNA在起始阶段打开或熔化DNA该区域开始于−5和−4之间，并涉及插入β发夹环；然后将模板链导入活动站点通过与酶表面的额外接触(三). 期间启动失败，与启动子保持在启动的前沿复杂的向下游移动，导致模板上的复杂(4,5). 将DNA打包到复合物中是通过将模板链进入疏水性结合袋(6).

当新生RNA具有长度约为9 nt，并伴随着上游启动触点(4,7). 然而，转录复合物具有完全加工EC的所有特性在合成12-14 nt RNA之前形成(8). 它有人提出，向稳定EC的发展是由以下因素触发的模板钢绞线绑扎袋的填充(6)和/或转录物与RNA产物结合位点的结合RNAP的N端域(9). 此处显示的工作表明新生RNA和特异性环之间的相互作用是这一转变中的重要因素。

材料和方法

结果

延伸复合物的特征。

确定T7 RNAP延伸中RNA的配置复合物，我们将其并入UTP的RNA类似物中与DNA或蛋白质交联，随后鉴定交联的位置。将类比置于定义的我们利用了修改后的T7RNAP有His₆N终点站的领导(10). 使用修饰的RNAP使我们能够固定转录镍上的配合物⁺²琼脂糖珠和通过连续的循环沿着模板“行走”复合体用有限的基质混合物清洗和培养（图。​（图1）。1). 这里研究的暂停复合体所有人的成绩单均至少为15 nt，且似乎属实伸长复合物；它们非常稳定（半衰期超过1小时）并在随后的每个循环中几乎定量地扩展，表明它们代表了反应途径或容易重新进入该途径。

在单独的窗口中打开

图1

RNA与DNA和RNAP的交联。一个120-bp的模板，用于指示合成具有指定序列的转录本(顶部)通过pPK10的PCR扩增构建(8). 启动综合体延伸到+15的是通过培养His形成的₆-第7天有GTP、ATP和U●（粗体）时的RNAP。这个复合物固定在镍上²⁺-琼脂糖珠和通过连续的洗涤周期，转录本逐渐延长并用指示的底物培养(11). 成绩单在每个循环中通过包含[α-³²P] NTP以粗体表示，每个样品分成两部分。其中一部分由20%凝胶电泳，以验证适当的延伸成绩单(下部; U模拟在中的位置转录物相对于RNA的3′端在-1）处表达。另一部分转录物的交联被激活接触NaBH₄(13)，样品分析在6M尿素存在下，在12%凝胶中的PAGE(上部).然而，在−5的所有位置都观察到了与RNAP的交联到−12时，仅在−5时观察到与DNA的有效交联至−8。使用其他模板（PK10、，PK12、PK13、PK14、D2和DT3；参见参考。11)允许U●从−1到−11(赖特). RNAP®RNA复合物通过对蛋白酶K和镍的保留²⁺琼脂糖珠；RNA●DNA复合物与交联到预期成绩单。

确定成绩单保持关联的范围在DNA模板中，我们使用了一种UTP类似物（U•），如图所示只与配对的腺嘌呤形成交联在RNA-DNA杂交中(13). 除了形成与DNA的特定交联，这种类似物也能形成通过活性醛基团与蛋白质交联(13). 鉴于当模拟物置于任何在−1和−17之间，与DNA的有效交联是仅当模拟位于上游1至8 nt转录本的3′端（即位置−1到−8）。（在此工作时，我们确定了成绩单中相对于在-1处拉长RNA的3′端；参见参考。15.）这些结果证明EC中的RNA与DNA保持接近（可能是RNA和DNA杂交）从-1到-8。

为了确定RNA在哪一点能被溶剂接触到，我们在稳定的EC中标记17-nt转录物的3′端，然后用RNase T1处理配合物（图。​（图2）。2). 新生RNA的12个核苷酸在完整的EC中受到保护，表明转录物确实直到此时才从RNAP内部出现。A类似之前的研究通过使用模板得出结论指导RNA中自分裂锤头结构的合成(16). 在这里，我们观察到13个核苷酸超过了裂解点必须在转录本折叠和自清之前进行合成，这表明RNA在这之前并不是没有空间限制的点。

在单独的窗口中打开

图2

新生RNA的12个核苷酸在EC中受到保护扩展到+14的启动复合体是在派生的模板上形成的来自pPK12(11)，并且通过与UTP，[α-³²P] ATP和[α-³²P] GTP（粗体）。将样品分成三份，分别暴露于0.1%的溶液中如图所示，SDS和/或RNase T1（0.1单位，25°C下15分钟），以及在6M尿素存在下，在20%凝胶中通过PAGE进行分析。一个完整的在未经治疗的患者中观察到预期长度（17nt）的转录本样品。该成绩单的限制大小为12 nt（阴影部分盒），但在复合物中降解这已被SDS暴露所破坏。限额的大小消化物是从曝光过度的胶片中测定的观察到转录本的阶梯延伸至+17（数据未显示）。

为了探究新生转录物和RNAP之间的联系，我们将4-thio-UTP（sUTP）并入RNA。该类似物仅起反应蛋白质残留物接近碱(17). 作为如图所示。​图3，三，抄本包含这种类似物在−1到−17的所有位置都与RNAP。然而，当模拟物位于−1和−9。之前已经展示过T7 RNAP可以以非特异性结合单链RNA（ssRNA）以及外源性ssRNA或ssDNA低聚物是有效的此绑定的竞争对手(9). 基于RNase T1保护上述实验表明−12以外的转录物涉及一个表面结合位点。一致通过这个概念，我们发现ssDNA抑制了sUTP位于−12及以上的成绩单（未显示）。

在单独的窗口中打开

图3

新生转录物与RNAP的交联(左侧). 在+14合并sUTP的创业综合体是通过使用指导转录的合成模板形成的序列显示，并且转录本被扩展增量，如图。​图1。1.复合物暴露于紫外线在10%的凝胶中用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析(11). 箭头表示RNA-RNAP复合物的位置；这个物种只被观察到当sUTP被纳入成绩单时，对蛋白酶K，并保留在Ni上²⁺珠子(11,12).转录本在交联前通过掺入[α-³²P] 启动综合体形成期间的ATP，或通过与下一个培养物进行交联后[α-³²P] 纳入NTP(赖特).与左侧面板，紫外线照射，并通过与GTP孵育进一步延长3 nt，ATP，然后UTP（斜体）。样品被分成四份并与所示底物一起培养；最小长度在交联后必须延长转录本以合并给出了标记底物。

为了确定交联RNA是否可以进一步延伸，在未标记底物存在下形成的络合物是交联，随后与[α-³²P] NTP（图。​（图3）。三). 鉴于从−1到−7交联的转录物延伸得很差，在−9和−11交联的转录物很容易延伸（图。​（图3）。三).前一个观察结果与RNA的概念一致−1到−7的核苷酸接近活性位点或参与RNA和DNA杂交，这种交联会改变杂种的结构和/或运动。转录物交联at−9和−11可以延长至少10 nt（图。​（图3），三),表明RNAP中转录物所连接的元件交联是柔性的，和/或RNA被挤压在其从模板上位移的位置和与之交联的蛋白质。有趣的是，抄本从−13到−17的交联延伸很差，可能因为受这些交联影响的RNAP区域至关重要加工伸长率（参见讨论).

−9处的交联映射。

由于一些原因，−9的交联是特别的利息。首先，如上所述，似乎在此基础上位置靠近笔录移位的点模板。更重要的是，它对应于从不稳定的IC至稳定EC开始(4,7,8). 要在EC中映射此联系人，我们结合了传统的蛋白质定位方法采用定点突变。

天冬酰胺（N）和甘氨酸（G）残基之间的HA裂解(11). 那里是T7 RNAP中的两个NG对，位置289和588，HA解理预计产生≈30-kDaN端和C端以及两个≈60 kDa的部分消化产物。如图所示。​图4，4，这些大小的肽片段是由在−9交联的转录物标记。辨别是否是C末端还是N末端的片段我们构建了一个突变体T7 RNAP，其中N末端用天冬氨酸取代Asn-289消除了解理位点（N289D）。对交联突变蛋白的消化导致标记的30-kDa片段，但60-kDa碎片中没有标记（图。​（图4）。4).因为突变蛋白中唯一的切割位点是589的NG，与RNA在−9的交联必须涉及氨基酸残基589和883之间的30-kDa片段。

在单独的窗口中打开

图4

−9处交联的粗略映射。具有转录本的复合体如图所示，使用WT或突变RNAPs形成−9交联。样品用HA消化(左侧) (11)或NTCB(赖特) (17)并如图所示进行分析。​图3。三。酒吧底部提供了观察到的匹配的示意图标记肽到RNAP中预测的裂解位点。劈开在467到540的六个半胱氨酸残基中表现为C467处的单一解理事件。

NTCB修饰和切割半胱氨酸残基的蛋白质(17)，其中T7 RNAP中有12个。再次与该代理发生冲突与C末端交联相一致的标记模式（图。​（图4）。4). 澄清此模式的解释并验证在交联位置，我们使用了C723和C839具有被突变以消除这些位点的分裂。结果表明交联度在残基723和839之间。因此，这两个野生型聚合酶的最小标记条带均通过以下方法消除C723S突变，与它们代表的724-839一致片段（13kDa）和724到883（18）的部分消化产物kDa）。最小的标记带和较大的标记带都是通过C839N突变消除，与它们的代表性一致724-839片段和468-839部分消化产物，但标记的724–883和468–883片段仍然存在。

为了进一步定位−9交联，13-kDa和18-kDaNTCB用凝胶纯化野生型（WT）酶的片段电泳，然后用NCS或CNBr裂解。如所示图。​图5，5，每个处理产生一种混合物部分消化产生的标记产品。唯一的对这些数据的一致解释是NCS消化后明显的条带代表区间W737–W797，CNBr处理后的最小标记带代表从A724到M750的间隔。（在这些实验中，标记带迁移速度比同等大小的蛋白质标记物稍慢因此，−9交联必须存在在残基737和750之间。这项任务得到了用NTCB、CNBr和NCS（非如图所示）。

在单独的窗口中打开

图5

交联在−9处的进一步定位。(左侧)对应于WT酶中724-839和724-883的区间（图。​（图4）4)是从凝胶中切下，用NCS或CNBr消化，在色氨酸（W）或蛋氨酸（M）残留物(17,31).使用MES在4–12%NuPage Bis-Tris梯度凝胶中运行样品缓冲系统和Seeblue大小标记（Invitrogen）；的位置尺寸标记位于右侧。识别单个肽通过信函；这些片段与预测的解理位点的匹配显示在底部。(赖特)具有与WT RNAP或双突变体C723S形成−9交联，I743C，并用NTCB处理。

737间隔内交联的进一步定位和750涉及T7 RNAP双突变体的构建723的半胱氨酸被消除，一种新的半胱胱氨酸被插入位置743（C723S，I743C）。的标签模式NTCB-叶突变酶与WT酶相似，但最小交联肽的尺寸减小了2.5 kDa（图。​（图5）。5). 这种规模的变化与半胱氨酸残基的位置，定义了断裂片段从723到743，表明交联存在残留物744和750之间。

讨论

T7 RNAP的特异性环（包括氨基酸残基739–770）投射到RNAP和在绑定和启动。Q744和M750之间的7-aa间隔EC中RNA的−9交联对应于这个循环的一个臂，包含直接参与启动子识别。这些残留物包括N748与启动子DNA的−10和−11处的碱基对相互作用，以及R746，它与−7处的碱基对相互作用(2,三). 观察结果当RNA达到长度≈9(4,7,8)以及对EC中RNA中的−9核苷酸与聚合酶的启动子识别区表明新生转录物与特异性环的相互作用在启动子清除和/或稳定也许不断增长的RNA链破坏了特异性环和启动子，或稳定抑制其与DNA重新结合的环。

T7 RNAP已经解决了四个独立的晶体结构：脱辅酶，与T7溶菌酶（T7抑制剂）复合的酶RNAP），与启动子结合的RNAP的二元复合物，以及RNA的前三个核苷酸具有的起始复合物已合成(三,6,18,19). 到目前为止，还没有关于关于伸长率复合物的结构这里的特点。

在早期的研究中，Jeruzalmi和Steitz(19)模拟假定RNA-DNA杂交到T7 RNAP-溶菌酶结构中通过与Taq公司I DNA聚合酶引物/模板复合物，发现结合间隙可以整齐地适应6-8bp的杂交，几乎没有空间冲突。然而，在最近解决的引发复合物结构中GTP的存在（仅允许合并前三个G残留物），Cheetham和Steitz(6)观察到不同的轨迹对于3-bp RNA●DNA杂交，并指出，进一步扩展杂交将导致空间位阻与N端域冲突。此外，他们还指出在转录本的5′端，似乎是从模板（即不涉及真正的Watson-Crick基础配对）。根据这些观察结果，作者建议RNA●DNA杂交在IC中不能超过3bp。出口通道后一项研究中提出的替换RNA不一致根据此处获得的结果（图。​（图6），6),但可能对应于以下聚（G）产品的路径用+1启动子的转录滑移合成GGG公司(7)或流产期间释放的短产品启动。

在单独的窗口中打开

图6

T7 RNAP转录复合物的模型。所示结构为基于T7 RNAP的实验确定结构引发复合物(6). 在聚合酶中，N末端结构域是褐色，拇指区域是绿色的，是指向的插入发夹进入活性位点（残基230–250）的模板链为粉红色，外源RNA的N末端表面暴露结合位点(21)是棕色，特异性环（）为深蓝色，7-aa进行−9交联的间隔（744）为黄色。A类假定的8个碱基的核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交体已被模拟成脱氧核糖核酸结合通过同源建模分裂Taq公司I DNA聚合酶底漆/模板复合体(20)通过叠加D537、D812和Y639英寸T7 RNAP（PDB ID QLN），在Taq公司I DNAP（PDB ID TAU）使用网络日志观众录3.5（分子模拟，Waltham，MA）。模板链为绿色，非模板链为青色新生成的RNA呈红色。从这个角度来看，启动子在右边活性位点位于RNA-DNA杂交体的左端裂缝的前部遮挡了活动部位和大部分模板RNA-DNA杂交的链。箭头显示建议的退出Cheetham和Steitz提出的新生转录物的途径(6)或在本工程中（分别为箭头I和II）。位于的右侧整个综合体显示了特异性循环的特写视图，RNA●DNA杂交，启动子的结合区域两种不同的观点。复合体经过旋转视图现在位于specification循环和RNA●DNA杂交现在可见。The first two nucleotides of the线框中显示了新生的RNA，以及这两种RNA的α-碳定义活性位点（D537、D812）的Asp残基显示为黑色球体。RNA延长了1 nt（黑色），以显示−9处的模型基底与特异性环的接近程度。在这个模型，运输需要2–3吨未成对的模板链特异性环和在上游边界重建双链DNA转录泡沫。

在考虑RNA-DNA杂交在我们重复了Jeruzalmi和斯泰兹(19)通过同源建模Taq公司I DNA聚合酶底漆/模板复合体(20)进入T7 RNAP启动复合体，将高度保守的残基D537、D812和Y639叠加在T7 RNAP活性位点及其相应残基Taq公司DNAP（图。​（图6）。6). 与早期研究一样(19)，我们观察到RNA-DNA杂交和结合间隙中的残留物。尽管混合动力应被视为暂时性的，该模型预测−9处的转录核苷酸将位于形成交联的特异性环。此外转移的RNA的轨迹将引导它朝向先前的在N末端区域确定的表面结合位点(21).

如上所述，当RNA已达到≈9 nt的长度，但过渡尚未完成直到合成了12-14nt(8). 中的后期阶段这个过程可能涉及将新出现的转录本绑定到表面结合位点。初步实验表明在−14交联的转录物连接到RNAP的一个区域位于289位HA解理位点附近，即与此期望一致（未发表的观察结果）。一个数字影响加工性和终止的突变与此相关RNAP区域(22–24)，这可以解释为什么超过−13的转录物阻止进一步延伸。

图中所示的模型。​图66表明特异性的可能性循环可能继续参与转录本的移位聚合酶清除后转录气泡的消解启动子，也可能监测DNA和/或RNA的序列涉及终止或暂停的(25). 显然，实质性在从IC过渡到一个EC，以适应提出的模型。概念是异构化过程中发生了显著的结构变化与T7系统中的各种实验数据一致以及多个子单位RNAP的结果(1,15,26–29). 进一步支持RNA-DNA杂交在T7中的拟议位置EC，我们注意到与DNAP pol I家族中引物/模板的相互作用在T7 RNAP中保守(19)，表明这些区域可能参与RNA和DNA聚合的类似功能。

所述T7伸长复合物的整体组织这里与三元结构有着惊人的相似性多亚单位RNAP形成的复合物(15). 因此，对于这两种类型在RNAP中，RNA-DNA杂交体的长度建议为8–9 bp，RNA直到12-14才能出现在酶的表面合成了nt。在这项工作中，我们建议T7 RNAP结合新生转录物和解析转录气泡的后缘。类似的角色已建议用于中的“方向舵”元素大肠杆菌属大肠杆菌核糖核酸聚合酶链式反应(15,30). （我们更喜欢更符合逻辑的术语marlinespike，一种用于分离绳索股的工具在拼接过程中。）有趣的是，我们注意到表面保守的碱性残基（精氨酸和赖氨酸）方向舵面对假定的RNA-DNA杂交E.公司。大肠杆菌RNAP和保守精氨酸残基的存在（R746）在相互作用的T7 RNAP特异性环区域带着初生的成绩单。而方向舵不是直接的参与启动子相互作用，一种线圈结构这个元素的投影，以及下面的灵活“襟翼”新的RNA在置换后出现，这两种情况都被认为是与sigma亚单位（转录特异性因子参与启动子识别）(15,29). 因此，正如T7 RNAP的情况下，新生RNA与舵或皮瓣可能触发启动子相互作用的释放和/或稳定欧盟委员会。

转录物在−9交联的观察可能更深入延伸，也许是通过RNA的循环，表明欧共体的组织可能有些灵活。这个发现有暂停和终止模型的潜在影响减缓新出现的转录本在保持高聚合速率的RNAP表面也可能导致RNA的挤压，为与酶的其他表面接触的转录本。

致谢

缩写

脚注

工具书类