母亲动脉血流与胎盘氧化应激的发生

摘要

成功妊娠的关键要求之一是充分的母胎交换。胎盘的进化满足了这一要求，并在母体和胎儿血流之间提供了广泛而紧密的接口。在人类中，这是通过精心制作一系列胎儿绒毛树来实现的，这些绒毛树直接由绒毛间隙中循环的母体血液沐浴。1多年来，人们普遍认为，胎盘植入后不久，通过胎儿滋养层侵入子宫内膜血管，在胎盘内建立了母体循环。2这一观点首先受到Hustin及其同事的质疑3,4世卫组织根据解剖和超声发现认为，孕妇在妊娠12周之前不会出现明显的血流。这些发现被批评为反映了体外人工制品和缺乏仪器敏感性，但如果得到证实，这一说法将从根本上改变我们对发育中人类胚胎的营养供应以及早期妊娠疾病的病理生理学的理解。因此，毫不奇怪，孕期至胎盘的母体动脉循环完全建立的阶段最近已成为一个备受争议的问题。5-8

利用多普勒超声技术解决这个问题的尝试得到了相互矛盾的结果，8-10很明显，当讨论集中在超声设备的相对灵敏度或胎盘内记录的精确定位等问题时，这场争论不会得到解决。因此，我们采用了生理学方法。这一新理论的主要含义之一是，早期胎儿-胎盘单元内的氧张力将大大低于先前的预期，并随着母体血流的开始而升高。我们通过在不同胎龄下使用一个高度准确和敏感的多参数探针测量胎盘绒毛间隙内的氧浓度来验证这一预测。

有氧代谢与活性氧的产生密不可分，其形成速度与主要的氧张力成正比。11这些物种具有潜在的极度危险性，因此一个复杂的抗氧化防御系统已经进化来应对这一挑战（图1）▶为了进一步证明细胞水平的氧浓度，我们检测了不同年龄胎盘组织中主要抗氧化酶过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、铜/锌和锰超氧化物歧化酶（SOD）的mRNA浓度和活性。

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图1。

氧自由基是通过线粒体和内质网中电子传输链的电子泄漏到分子氧上而产生的。产生的超氧阴离子不能通过细胞膜自由扩散，必须被分解就地通过Cu/Zn或Mn-SOD。尽管H₂O（运行）₂不是自由基，它可以与O反应₂^·−形成极为活泼的羟基。因此，过氧化氢酶和GPX必须与SOD协同工作，以将浓度保持在生理水平。

如果氧浓度波动过快或升高过高，细胞的抗氧化防御能力就会被淹没，从而导致氧化应激。在这种情况下，对蛋白质、脂类和DNA的不加区分的损伤会严重损害正常的细胞功能，甚至可能导致细胞死亡。我们之前已经发现早期胎盘的合胞体滋养层对快速上升的氧张力非常敏感在体外正在经历选择性退化。12因此，我们寻找与胎盘母体循环变化相关的滋养层细胞氧化应激的证据体内这是通过监测诱导型热休克蛋白70（Hsp 70i）的表达（其是其他系统中公认的氧化应激标志物）在免疫组织化学上实现的，13以及不同胎龄硝基酪氨酸残基的形成。我们还评估了线粒体形态，因为这些细胞器是自由基生成的主要场所，它们特别容易受到氧张力增加的影响。12

材料和方法

氧气测量

带有自动传感器校准的Paratrend 7监测系统（Diametrics Medical，明尼苏达州圣保罗）包含一个用于测量氧气浓度的无菌电化学传感器（克拉克电极）（图2）▶。使用制造商提供的三种精密气体进行校准，范围为0至120 mmHg，95%置信区间为±1 mmHg。0到90%的响应时间<150秒。

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图2。

答：Paratrend多参数探针直径为0.5 mm，含有PO₂、PCO₂pH和温度传感器。B类：Paratrend探针的样品输出说明了pH、PCO的稳定性₂和PO₂获得的测量值。在本例中，在妊娠60天时，首先将探针导入胚胎外体腔（EEC），然后通过胎盘绒毛膜板（CP）将其取出，进入胎盘绒毛间隙（IVS），最后进入胎盘下方的子宫内膜（END）。探针在每个新环境中都会迅速稳定下来，此后氧气测量值会有轻微下降的趋势。这很可能反映了克拉克电极消耗的氧气耗尽了探针附近的浓度。

探针通过连续超声引导下的18-G针纵向插入胎盘绒毛间隙内，随后插入胎盘基板下的子宫蜕膜。14稳定2至3分钟后，在每个位置每隔1分钟进行五次测量，并记录平均值（图2）▶.

将探头置于手指上，通过脉搏血氧饱和度持续评估母亲外周动脉血氧饱和度。

结果

探针测量

平均PO之间存在高度显著的正相关₂在绒毛间隙和胎龄内记录(n个= 26,第页= 0.80,P（P）< 0.001). 然而，一个双变量散点图表明，数据分为两组，一组早期数据包括第7至11周，另一组包括第12至15周。如果单独分析每个数据集，则不存在相关性(n个= 14,第页=0.46，P（P）>0.05和n个= 12,第页=0.02，P（P）>早期值和晚期值分别为0.05）。鉴于这一发现，使用LOWESS技术将张力为60的乙状曲线拟合到数据中（图3）▶该分析表明，在妊娠10至12周期间，胎盘内的氧张力急剧上升。

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图3。

胎盘和子宫PO的双变量散点图₂根据胎龄进行测量。采用LOWESS技术对曲线进行拟合，张力为60。采购订单₂胎盘在10至12周内急剧上升，反映出母体血流开始自由流入绒毛间隙。

采购订单₂胎盘下的子宫内膜也与胎龄相关(n个= 18,第页= 0.68,P（P）= 0.001). 这些数值以更线性的方式增加，远高于胎盘内的测量值。因此，子宫内膜和绒毛间隙之间始终存在氧梯度，但随着胎龄的增加，氧梯度的大小下降（图3）▶这一模式证实，随着妊娠的进展，更多的母体血液从子宫内膜进入胎盘，而不是母体氧合发生显著变化。

抗氧化剂防御

胎盘组织中的GPX活性与胎龄呈正相关（表1）▶，直到第十周结束，活动缓慢增加，之后增加更快（图4a）▶在还原型谷胱甘肽的浓度中观察到类似的模式，尽管这些数据在早期表现出相当大的分散性（表1▶和图4b▶)。过氧化氢酶活性也与胎龄相关（表1）▶，但在这种情况下，活动稳步上升，然后在～12周时趋于稳定（图4c）▶虽然总SOD活性显示出随着年龄增长活性增加的趋势，但这并没有达到统计显著性（表1▶和图4d▶).

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图4。

抗氧化酶胎盘活性和还原型谷胱甘肽浓度随胎龄变化的双变量散点图。除总SOD活性外，所有指标均表现出显著相关性（表1）▶，并且使用LOWESS技术拟合线。答：GPX活性，LOWESS张力70。b：谷胱甘肽浓度降低，LOWESS张力70。抄送：过氧化氢酶活性，LOWESS张力75。日期：总SOD活性。

表1。

胎盘抗氧化剂与孕龄和产房内氧张力的相关系数

	妊娠年龄	簇间PO2
谷胱甘肽过氧化物酶活性	0.763	0.784
	(n个= 19,P（P）< 0.001)	(n个= 18,P（P）< 0.001)
还原型谷胱甘肽浓度	0.536	0.408
	(n个= 20,P（P）= 0.014	(n个= 19,P（P）= 0.083)
过氧化氢酶活性	0.544	0.532
	(n个= 20,P（P）= 0.012)	(n个= 19,P（P）= 0.018)
总SOD活性	0.392	0.491
	(n个= 20,P（P）= 0.088)	(n个= 19,P（P）= 0.032)

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抗氧化酶的活性与绒毛间隙中测得的氧张力表现出同样强烈的相关性（表1）▶然而，尽管还原型谷胱甘肽的浓度似乎随着氧张力的升高而增加，但这一趋势并未达到统计显著性。

mRNA浓度

图5显示了一个具有代表性的印迹▶为了进行统计分析，根据胎龄将样本分为两组；分别在10周前和10周后。第一组的平均胎龄为56天(n个=5，SD=9.3），第二组为92.7天(n个=6，标准偏差=6.7）。相对于18S核糖体RNA的密度测量读数显示，过氧化氢酶、Cu/ZnSOD和GPX的mRNA浓度都随着胎龄的增加而增加(t吨= 2.51,P（P）= 0.033;t吨= 2.60,P（P）=0.029和t吨= 2.21,P（P）分别为0.05）。在1 kb和4 kb下观察到MnSOD的两条谱带。前者没有变化，尽管后者似乎有所增加，但差异没有达到统计显著性(t吨=1.56，P（P）= 0.15).

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图5。

抗氧化酶的代表性Northern斑点。过氧化氢酶、GPX和Cu/ZnSOD的表达随着胎龄的增加而显著增加，而MnSOD则没有。

诱导性Hsp 70表达

Hsp 70i在最早的6-7周组织中的表达极低（图6a）▶，但在8至9周的绒毛中显示出显著增加，在合胞体滋养层细胞和内皮细胞中具有特别强的免疫标记（图6b）▶此后，在胎龄较大的组织中的表达似乎下降，并且在不同的细胞类型之间变得一致（图6c）▶所有阴性对照组显示出最小的背景染色（图6d）▶由于免疫标记和在相同条件下观察大量切片的物理限制，进行了两次定量程序。每次测试都包含完整的年龄范围，尽管第二次测试集中在7到10周的样本上。因此，每次运行的数据在内部是一致的，但由于标记条件或显微镜激光功率可能发生变化，因此这两次运行的数据并不是严格可比的。因此，这两个数据集绘制为散点图（图7）▶在每种情况下，在最早样本的滋养层细胞中都观察到低水平的表达。然而，在孕8至9周的样本中，荧光强度出现了一个峰值，随后的样本显示出中等水平的表达。基质的值始终低于滋养层的值，但遵循相似的模式。

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图6。

6周时用异硫氰酸荧光素标记的次级抗体对绒毛中诱导性Hsp70表达的免疫组织化学定位(一)，9周(b条)和13周胎龄(c（c）).日期：6周时阴性对照和带有显色底物的硝基酪氨酸(e（电子）)，9周(如果)和13周胎龄(克).小时：阴性对照。9周时两者都有较强的免疫标记，尤其是在合胞体滋养层(箭头).

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图7。

不同胎龄的合胞体滋养层细胞中诱导型Hsp70表达的平均荧光强度散点图。进行了两次单独的运行，用符号表示。每次运行的切片都被免疫标记在一起，并在同一天在共焦显微镜设置保持不变的情况下进行观察。两次跑步均在8至9周时出现Hsp70i表达高峰，表明存在氧化应激期。

线粒体形态学

在6周后的组织中，线粒体轮廓呈平滑的椭圆形或圆形，嵴清晰可见，呈一系列典型的交叉指状褶皱。基质的电子密度适中（图8a）▶在9到10周时，他们的表现大不相同。轮廓的面积较小，轮廓更不规则。可见的嵴较少，通常在基质内呈单个圆形。嵴内的嵴内空间大幅度扩张（图8b）▶到12至14周时，嵴可以再次清晰地确定，尽管它们的排列比早期标本更不规则（图8c）▶定量分析证实，嵴内间隙所占细胞器的体积百分比最初与Hsp 70的表达同步上升，随后随着胎龄的增加而下降（图8d）▶二阶多项式回归表明这些变化具有统计学意义(F类= 3.94,P（P）< 0.05).

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图8。

合胞体滋养层增生线粒体的电子显微照片(箭头)在不同胎龄时，显示嵴变形和嵴内间隙扩张，这与6周时Hsp70的表达和硝基酪氨酸残基的形成一致(一)，10周(b条)，14周(c（c）).日期：不同胎龄时嵴内间隙所占线粒体体积百分比的散点图。使用LOWESS技术安装管线，张力为66。

讨论

本文提供的数据提供了确凿的证据，证明人类胎盘内的氧张力在妊娠早期结束时迅速增加。这种增加不能用母亲麻醉或引入探针在早期病例中选择性诱发的血管痉挛或类似伪影来解释，因为它与抗氧化酶mRNA浓度和活性的升高相匹配。抗氧化剂基因的表达对普遍的氧张力有反应，15,16但在转录和翻译过程中，不可避免地会出现延迟。因此，抗氧化剂数据提供了细胞水平的氧张力在组织移除前一段时间的证据。

我们的数据与胎盘早期发育的经典形态学描述一致。这些状态表明，在植入过程中，滋养层细胞侵入子宫内膜表面的毛细血管和静脉，母血红细胞存在于绒毛间隙的前体中。然而，这仅代表毛细血管循环，在妊娠第九周之前无法观察到螺旋动脉和绒毛间隙之间的直接连接。17,18在这一阶段之前，动脉的远端被发育中的细胞滋养层外壳和绒毛细胞柱所产生的细胞滋养细胞聚集物堵塞。4,19因此，与扩大的绒毛间隙的动脉通讯被限制在一个狭窄的细胞间隙网络中，以确保任何流动都是缓慢的或仅限于血浆滤液。这两种现象都可以解释胎盘内测量到的低氧张力，因为它们输送的氧气量很小。大约10周时，一些动脉塞松动，使得母体血液能够更自由地进入绒毛间隙，这是多普勒超声在妊娠早期检测到的血流模式变化的原因。7,9因此，输送到胎盘的氧气总量将增加，导致PO增加₂在绒毛间隙内。

虽然很明显是绒毛间PO增长最快₂发生在第十周左右，无法准确确定何时开始上升。8周前，胎盘太小，无法容纳探头，因此无法获得早期数据。然而，循环的开始可能是一个渐进的过程，胎盘之间会发生相当大的个体差异。有氧代谢不可避免地与自由基物种的产生有关，主要是通过单电子在线粒体电子传输链上传递给分子氧。这发生在NADH脱氢酶或辅酶Q的水平上，并导致形成超氧阴离子O₂^·−.形成速度与主要氧气浓度成正比，11一系列酶促抗氧化防御系统已经进化，以消除这种自由基和其他生成的自由基。位于线粒体基质中的SOD的锰形式容易分解O₂^·−到过氧化氢，H₂O（运行）₂（图1）▶虽然不是根式，H₂O（运行）₂能与游离亚铁反应生成高活性的羟基自由基HO^·因此，H₂O（运行）₂保持在生理浓度，酶GPX和过氧化氢酶将其解毒为氧气和水。GPX位于线粒体基质和细胞质内，而过氧化氢酶主要局限于过氧化物酶体。GPX使用还原型谷胱甘肽作为底物，因此这种三肽的细胞内池代表了一种重要的氧化还原缓冲液。事实上，据估计，该池包含所有细胞还原当量的90%以上。20超氧化物阴离子也可能在内质网内形成，此处SOD的Cu/Zn形式是解毒途径中的第一种酶（图1）▶因此，必须保持抗氧化酶活性的正确平衡，以确保全球细胞保护。21我们的数据证实，主要抗氧化酶的表达和活性随胎龄增加而增加，这可能是对母亲血流变化的反应。曾尝试使用氰化钠阻断细胞质酶来分离Cu/Zn和MnSOD的活性，但由于结果高度不一致，这被证明是不可能的。先前使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳活性凝胶的研究表明，这两种酶的活性随着胎龄的增加而增加，12这得到了这里报道的mRNA数据的支持。检测到MnSOD的两个剪接变异体，在人类细胞系中，已证明4-kb变异体是这两个变异体中反应更快的。22在我们的样本中，尽管差异没有达到统计学意义，但这种变异显示出与胎龄的更大差异。因此，我们的结果与Takehara等人23据报道，从妊娠5周到足月，胎盘总SOD和过氧化氢酶活性增加。相关的是，从他们的散点图中可以看出，大多数增加发生在头三个月的末尾。

如果自由基的生成超过抗氧化防御能力，则会导致氧化应激。在这种情况下，可能会对蛋白质、脂质和DNA造成不加区分的损害，导致细胞功能丧失。最近的工作已经证实，氧化应激引起的蛋白质变形以类似于热疗的方式诱导Hsps的表达。13蛋白质巯基的氧化修饰使热稳定蛋白质变得不稳定，并在生理温度下发生热变性。合成的熔球中间产物导致转录因子Hsf-1三聚化，从而赋予DNA结合活性，从而导致基因激活。热休克蛋白作为分子伴侣来隔离受损蛋白质，使其有机会重新折叠或引导其进入蛋白水解途径。它们的表达代表了一种适应性反应，旨在防止变性蛋白在胞浆内聚集，Hsp 70的组成形式和诱导形式的过度表达增加了细胞系对氧化应激的抵抗力。24因此，我们在8至9周时观察到的合胞体滋养层细胞内Hsp70的表达高峰为氧化应激的发生提供了一个敏感标记体内.

同时检测到浓度升高的硝基酪氨酸残基进一步支持了这一结论。尽管O₂^·−它还与一氧化氮发生强烈反应，形成过氧亚硝酸盐，这是一种强有力的氧化剂，能够引发脂质过氧化并硝化多种蛋白质上的酪氨酸残基。这可以导致酶活性的失活，例如MnSOD已经证明了这一点。25由于过氧亚硝酸盐具有相对较长的半衰期（～1秒），并且可通过生物膜自由扩散，因此其潜在靶点广泛存在。

合胞体滋养层细胞特别容易受到氧化应激的影响，这有两个原因。首先，由于其位于绒毛表面，该组织将是第一个经历绒毛间PO增加的组织₂因此，这将是有氧呼吸的主要受益者。其次，我们之前已经证明，在妊娠早期，合胞体滋养层细胞所含抗氧化酶的浓度比其他绒毛组织低得多。12,26,27低水平的MnSOD将使线粒体面临O的特殊风险₂^·−-介导的损害。多年来，人们已经知道线粒体的超微结构形态根据其代谢活性发生可逆变化。28在低氧消耗期间出现的叉指嵴的正统外观反映了低呼吸率。相比之下，高呼吸率与体积减少、基质凝结和椎间隙增大有关。在此基础上，我们的研究结果与妊娠早期合体滋养层细胞内从无氧代谢到有氧代谢的一般转变相一致。然而，正常代谢变化和氧化应激导致的损伤之间的界限尚不清楚，它们可能代表一个渐进谱的不同阶段。例如，肿瘤坏死因子的细胞毒性作用是通过线粒体内自由基生成增加介导的，并与线粒体嵴的破坏和酶功能的丧失有关。29我们在9至10周时观察到的嵴的圆形排列可能代表了肿瘤坏死因子诱导的洋葱皮螺纹形成的早期阶段，表明存在一定程度的氧化应激。我们之前已经观察到，在21%氧气条件下，绒毛线粒体形态发生了质的相似变化，并伴有酶活性和线粒体膜电位的丧失，如罗丹明-123荧光所示。12,30因此，线粒体功能很可能在母体循环开始时受损，尽管这种情况显然是可以恢复的，因为我们的样本代表了正常持续妊娠的快照。我们认为这可能是一个线粒体快速转换的时期，新线粒体的形成具有高浓度的抗氧化防御能力，以应对不断增加的氧张力。

因此，总的来说，在正常妊娠中，母体完全动脉循环至胎盘的开始似乎与胎盘氧化应激的短暂期有关（图9）▶我们假设，这是因为氧张力迅速上升导致自由基物种生成增加，而抗氧化剂防御适应能力减弱，两者之间暂时不平衡。这种压力爆发可能通过触发分化途径在正常胎盘发育中发挥重要的生理功能。31,32例如，它可以将细胞滋养层细胞从增殖表型转换为侵袭表型，从而刺激绒毛外滋养层细胞向子宫内膜迁移，在子宫内膜螺旋动脉的转化中发挥关键作用。33-35这一过程的失败与子痫前期有关，子痫是一种常见的妊娠并发症，与胎盘灌注不良和慢性氧化应激有关。36,37

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图9。

说明合胞体滋养层增生性氧化应激的起源和可能影响的总图。可能调节压力程度的因素由虚线.

然而，同样，如果胎盘氧化应激过大，并且滋养层细胞发生变性，也可能会产生潜在的非常有害的影响在体外（图9）▶.12,38线粒体内膜中蛋白质上巯基的氧化被认为通过打开BCL-2调节的大通道来促进线粒体通透性的转变。离子梯度的丧失和细胞色素等小蛋白的释放c（c）进入细胞质可能导致caspase级联激活，从而导致细胞凋亡。39位于基质和内膜上的酶，包括呼吸链上的酶，也容易被直接氧化，但除此之外，膜脂质的过氧化会严重损害它们的功能。25,40,41如果这些变化足够严重，则会导致三磷酸腺苷储备耗尽，并可能导致细胞坏死或凋亡。因为合胞体滋养层负责所有胎盘激素的合成和主动转运，42妊娠失败很快就会接踵而至。应力的大小取决于PO的增长率₂绒毛间隙内以及胎盘抗氧化防御系统的状态（图9）▶在不可避免的持续流产和流产失败的情况下，母亲的血液会过早过度进入绒毛间隙。9,43这些病例的蜕膜组织学检查表明，滋养层细胞的侵袭范围比正常情况小，细胞滋养层细胞血管内聚集物对螺旋动脉顶端的堵塞不完全。44因此，母体循环的开始可能是突然的。胎盘组织在胎龄7周时最易发生脂质过氧化，23如果抗氧化防御能力被耗尽，这将进一步加剧。有研究表明，血清硒（GPX中嵌入的过渡金属）浓度低的女性早孕失败率较高，尽管这一点尚未得到最近一项病例对照研究的证实。45,46据报道，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（一种维持还原性谷胱甘肽可用库的酶）缺乏的小鼠显示出比对照组更高的宫内死亡和胎儿吸收率。47这一现象可能是人类的必然结果，因为欧洲所有G6PD缺乏人群中出生的G6PD缺失男性和女性的发病率比预期低50%以上。48这些数据表明，受影响胚胎的存活率低于预期。因此，合胞体滋养层细胞的氧化应激可能是许多与早期妊娠失败相关的不同疾病的最终共同途径。

致谢

脚注

工具书类