有限来源新鲜冷冻和石蜡包埋DNA的全肿瘤基因组扩增和基因组畸变的逐基因定位

DNA的分离

10个4μm FFPE组织切片在3×1ml二甲苯和2×1ml 100%乙醇中脱蜡10分钟。空气干燥后，将样品悬浮在1 ml DNA提取缓冲液中，该缓冲液由900μl ATL缓冲液和100μl蛋白酶K组成（均为加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen的DNeasy组织试剂盒），并在55°C下培养过夜。24小时和48小时后添加额外的蛋白酶K（50μl），总培养时间为72小时。在55°C的DNA提取缓冲液中消化25 mg新鲜冷冻的胶质母细胞瘤组织过夜。根据制造商的方案，使用DNeasy组织试剂盒在新鲜冷冻和FFPE样品中进行DNA的硅胶膜提取。DNA浓度通过260和280λ的分光光度吸收测定，纯度通过A计算₂₆₀/A类₂₈₀比率。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色（Invitrogen）评估DNA大小。根据制造商的说法，使用血液和细胞培养DNA maxi试剂盒（Qiagen）提取来自BT474和MCF-7细胞系以及来自男性和女性捐献者的全血的DNA。

基于Phi29的基因组DNA扩增

GenomiPhi DNA扩增试剂盒（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）的组件用于扩增反应。将总体积为1μl的各种数量的纯化基因组DNA（0.25至30 ng）添加到9μl样品缓冲液中，并加热至95°C 3分钟以使模板DNA变性。在冰上冷却5分钟后，将样品与10μl预处理反应混合物（9μl反应缓冲液和1μlPhi29电话每个反应），并在30°C下培养数小时（2至18小时）。放大后，Phi29电话在65°C下加热灭活10分钟，并将样品冷却至室温。使用1.5 mol/L醋酸钠/250 mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液（pH>8.0）通过乙醇沉淀纯化扩增产物。依次向20μl扩增产物中添加20μl无核水、4μl乙酸钠/乙二胺四乙酸缓冲液和100μl 100%乙醇，并以12000 rpm离心15分钟。去除上清液，并在400μl 70%乙醇中清洗DNA颗粒2分钟。3200×离心后克在5分钟内，去除上清液，干燥DNA颗粒，并将其重新悬浮在10μl的1×三乙二胺四乙酸（TE）缓冲液中（西格玛，密苏里州圣路易斯）。在每个实验中，共扩增10 ng对照λDNA，以评估每个扩增反应的效率。每个模板扩增同时进行至少三个独立实验。反应产物用分光光度法定量，并用琼脂糖凝胶电泳进行分析。BT474和MCF-7 DNA（以及相应的正常雄性/雌性参考DNA）基本上如上所述由Molecular Staging Inc.扩增。

DNA的消化和纯化

对于标记反应，分别用Dpn公司II限制性内切酶（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州贝弗利）在37°C下放置1.5小时（总体积为40μl，1.5μlDpn公司二、 和6微升Dpn公司II缓冲器）。之后Dpn公司通过在65°C下加热20分钟灭活II，将样品在冰上快速冷却2分钟。按照制造商的说明，使用QIAquick聚合酶链反应纯化试剂盒（Qiagen）纯化消化液。将样品重新悬浮在50μl EB缓冲液中，通过在260和280λ下的分光光度吸收定量消化产物，并将其储存在−80°C下。

DNA标记

对于微阵列杂交，使用随机引物（Bioprime标记试剂盒，Invitrogen）分别标记体积为22.5μl的2μg未扩增和扩增消化DNA，修改后包括由dATP、dGTP和dTTP各1.2 mmol/l和0.6 mmol/LdCTP组成的10×dNTP混合物。向每个样品中添加20μl的2.5×随机引物，将混合物在100°C下煮沸5分钟，并在冰上快速冷却5分钟。向配对杂交样品（Amersham Biosciences）中添加5μl 10×dNTP混合物、3μl Cy3-CTP和Cy5-dCTP荧光染料以及1μl浓缩Klenow酶后，样品在37°C下培养2小时。通过添加5μl停止缓冲液停止反应，置于冰上5分钟，并在18000×克持续2分钟。在扩增和非扩增DNA之间进行染料切换，以排除染料偏置效应。

微阵列的CGH

使用YM-30微中子过滤器（密立波公司，马萨诸塞州贝德福德）对标记产品进行纯化。将相应的Cy3-和Cy5-标记探针组合到离心过滤装置中，添加400μl 1×TE缓冲液（pH=7.4），将混合物倒置数次，在13800×克持续7分钟。在用450μl的1×TE、380μl的1×TE、20μl的5μg/μl酵母tRNA（Invitrogen）、50μl的1μg/μl人Cot-1DNA（Invitrogen）和2μl的10μg/μl聚（dA-dT）（Sigma）额外洗涤两次后，加入以阻断非特异性结合、与重复元件的杂交以及与延伸的聚（A）尾部的不期望的杂交，分别是。通过12000×离心将混合物浓缩至<32μl克持续12到14分钟。通过将过滤器倒置为新的微子管并在14000×克持续2分钟。用1×TE将体积调节至32μl后，添加6.8μl 20×标准柠檬酸盐（SSC）（Invitrogen）和1.2μl 10%十二烷基硫酸钠（Sigma），并在100°C下变性2分钟。在37°C下经过30分钟的Cot-1预退火步骤后，将探针在22×60-mm玻璃盖玻片下与包含43000多个cDNA序列的cDNA微阵列（由斯坦福功能基因组设施制造）杂交，并在65°C的杂交室中培养15至18小时。

微阵列的清洗

过夜杂交后，通过将微阵列短暂浸入65°C 2×SSC，0.03%十二烷基硫酸钠洗涤液中，去除盖玻片。为了去除未结合的标记DNA，微阵列依次在2×SSC、0.03%十二烷基硫酸钠中于65°C洗涤5分钟，在2×SSC中于65°C漂洗，然后在室温下分别在1×SSC（一次洗涤）和0.2×SSC（两次洗涤）中振荡洗涤5分钟。微阵列以500转/分的速度离心干燥5分钟，然后放置在一个光线保护的盒子中。

微阵列成像与数据缩减

在GenePix 4000B扫描仪（加利福尼亚州联合市Axon Instruments）上立即对微阵列进行双波长扫描。使用GenePix Pro 5.1软件进行背景减影后，计算微阵列上每个cDNA元素的荧光强度比。排除了具有上覆荧光碎片的阵列斑点，以及平均斑点大小<25%或>400%的斑点。为了纠正样本之间DNA标记效率的差异，使用斯坦福微阵列数据库对荧光比率进行了标准化，以达到平均对数比率0。在任一波长通道（信号高于背景>2.0）中具有一致（回归相关>0.6）和足够荧光强度的测量被认为是可靠的。如有指示，基因剂量比报告为对称五近邻移动平均值。1

数据分析和地图位置

GoldenPath人类基因组组装(http://genome.ucsc.edu美国国家生物技术信息中心34）被用于将人类cDNA阵列的荧光比率映射到染色体位置。CaryoScope软件(http://genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/caryoscope/nph-aCGH-dev_update.pl)用于显示人类染色体上基于基因对基因的移动平均基因剂量比。

GC含量和GC异质性分析

使用鹅EMBOSS套件中的函数。15自由分布程序draw_chromose_gc.pl(http://genomat.img.cas.cz)按照Paces及其同事的描述，在100-kb大小的窗口中沿染色体分析和绘制全基因组GC含量。16序列数据来自美国国家生物技术信息中心34号楼的人类基因组大会。

Phi29-扩增DNA的全基因组基因剂量表示

然后，我们在43000元件cDNA微阵列上，基于基因对基因的基础上评估了不同扩增倍数下扩增的肿瘤DNA与CGH未扩增的模板肿瘤DNA在人类基因组中的基因剂量表示（图2）该分析显示，原始红/绿（R/G）荧光比率存在相当大的、与扩增水平相关的散射，这表明存在大量克隆错误表达（图2、b和c）当沿着基因组绘制所有分析克隆的R/G比值时，大多数高代表性克隆和大多数低代表性克隆在不同染色体图坐标下聚集在一个较大的亚群中，如垂直向上和向下的峰值所示图2b在FFPE组织中，与新鲜冷冻组织相比，这些比率的分散性更大。

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图2

基于阵列CGH的基因剂量表征全基因组评估功率因数29-扩增DNA。答：描述未扩增男性基因组与未扩增女性基因组DNA阵列-CGH实验的信号强度比的图表。通过将等量的Dpn公司将II消化、纯化和荧光染料标记的非扩增模板和扩增产物扩增到43000元件微阵列。每个点表示微阵列上单个克隆的原始强度比，这反过来表明该克隆在相对于非扩增DNA的扩增DNA中是如何表示的。根据人类基因组中从第1染色体到第Y染色体的基因顺序绘制比率。b：对应的未扩增与扩增（a）新鲜冷冻胶质母细胞瘤（GBM）DNA的阵列CGH结果，后者已扩增3750倍。与理想1.0值相比，比率的分散程度要深得多一，表明扩增DNA中许多克隆的严重错误。红色和蓝色线条分别表示高平均值低表达和高表达的基因组区域，如在同一染色体图坐标下排列为垂直向上和向下峰值的克隆簇所证明的那样。c：同一GBM的非扩增与扩增DNA杂交实验中的信号强度比b条其中扩增产物扩增了250倍。尽管比率的分散度小于b条，与相比一大量克隆错误表达明显，不同的基因组区域表现出比其他区域更大的扭曲。d日到传真：对数直方图₂与实验相对应的数据点的比率分布一到c（c）.克：CaryoScope绘图比较了第3、4和11号染色体的克隆表现b条和c（c）.红色和绿色条表明克隆在扩增DNA中的代表性分别过高和过低。尽管两个实验的放大程度相差15倍，但错误陈述的区域模式高度一致。

Phi29-Amplified DNA克隆错误表达的模式和再现性

然后，我们使用CaryoScope软件对序列变异的基因组模式进行了详细分析。虽然一些代表性不足的基因座分散在不同的染色体内区域，但最显著的代表性不足被映射到染色体末端区域（图3a）在重复实验中，即使选择不同的扩增水平，在扩增的肿瘤DNA中代表性不足的位点之间也有很高的一致性（图2g）.扩增的肿瘤DNA序列表现的一致性畸变与扩增的正常基因组DNA的区域性错误表达模式高度匹配（图3d）.

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图3

扩增DNA中的区域错误表达模式和GC含量。一到抄送：在扩增的（a）胶质母细胞瘤（GBM）DNA与非扩增的GBM DNA阵列CGH实验中，沿着染色体的全基因组错误表达模式的相互关系图，并通过CaryoScope分析显示为移动平均值（对称的五个最近邻居）(一); 根据基因的基因组顺序绘制的代表性不足克隆的相应原始强度比(b条); 和所选染色体末端区域的平均GC含量测量(c（c）). 原始密度比图中高度缺乏代表性的克隆簇可与约50%的终端染色体区域相关联。在扩增的DNA中表现出最大代表性不足的六个染色体末端是带圆圈的在里面橙色（5便士_特，7便士_特，第9季度_特，16便士_特，17季度_特，20个_特). 正常代表的六个染色体末端是带圆圈的在里面蓝色（第1季度_特，第3季度_特，第4季度_特，12便士_特，18便士_特，20便士_特). 对这12个末端长度为2.5 Mb的染色体末端的GC含量分数进行比较评估，结果显示正常末端（42.3%；范围，39-45%）和代表不足末端（54.7%；范围，51-57%）的平均GC含量存在显著差异(P（P）=0.002，双样本Wilcoxon检验），平均基因组GC含量为41%棕色线条.日期：在扩增的正常男性DNA与未扩增女性DNA以及扩增的肿瘤DNA与未放大肿瘤DNA阵列-CGH实验中，对选定区域的染色体末端和染色体内克隆表现进行比较，例证了扩增正常和扩增肿瘤DNA的代表性模式的高度一致性。

Phi29扩增DNA中偏向性基因表达的决定机制

值得注意的是，在扩增的肿瘤和扩增的正常DNA中，只有末端染色体区域的一个子集（～50%）表现不足（100%一致）。由于有证据表明DNA的GC含量会影响聚合酶的加工效率以及DNA启动，因此我们检查了区域GC含量与区域扩增效率之间的关系。将6个最不常见的末端位点的GC含量与扩增基因组DNA中具有平均基因表达的6个位点进行比较，发现2.5 Mb末端区域内的平均GC含量存在显著差异（分别为54.7%和42.3%；P（P）=0.002，两个样本的Wilcoxon检验）（图3c）.

然后，我们将此比较分析扩展到整个基因组，并通过平均100-kb窗口中以10-kb步长跨越染色体的GC含量，获得染色体宽GC含量剖面。图4描述了染色体3、16和20的扩增与非扩增正常人类DNA中的组分GC异质性的固定长度、移动窗口图以及区域基因剂量表示。这幅图形显示了染色体上平均GC含量的深刻变化，并揭示了人类基因组末端和染色体内区域的区域扩增效率与GC含量之间的重要关系。

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图4

3号、16号和20号染色体上区域GC含量异质性与区域扩增效率的图示，这是因为它们朝向染色体末端的克隆表现模式不同而选择的样本。答：区域扩增效率的逐基因显示，如扩增与未扩增正常人类基因组DNA的移动平均比率所示。b：彩色编码、固定长度、移动窗口图，描绘了100 kb窗口中GC含量的变化。这些窗口之间的GC水平有明显差异，在染色体臂16p、16q和20q末端的GC含量特别高。值得注意的是，染色体的区域代表性不足，因此区域扩增效率与区域GC水平密切相关。在染色体臂16p、16q和20q末端，基因密度最大，18克隆在扩增DNA中的表达不足和GC含量均达到最大值。

Phi29扩增DNA中基因表达畸变的全基因组补偿

由于区域GC水平和扩增效率之间的联系，我们测试了在完全相同的条件下使用扩增的人类参考DNA是否可以平衡扩增的肿瘤DNA中的整体克隆畸变。因此，我们进行了一系列的阵列CGH杂交，包括1）未扩增男性DNA与未扩增女性DNA的杂交，2）扩增男性DNA对未扩增女性DNA的杂交，3）扩增男性DNA对扩增女性DNA，4）未扩增肿瘤DNA对未经扩增的正常人类DNA，5）扩增肿瘤DNA对比未扩增人类DNA，和6）扩增的肿瘤DNA与扩增的人类DNA。在扩增样本与非扩增样本实验中，观察到基因表征的显著但可重复的区域异质性（图5）相比之下，在同时扩增了测试DNA和参考DNA的杂交实验中获得的表征图谱与将未扩增测试DNA和参照DNA杂交时获得的表征谱极为相似（图5）在扩增的正常人DNA和新鲜冷冻和FFPE肿瘤的扩增DNA中均观察到这种误报补偿（图5和6、b和c）。

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图5

对扩增DNA代表性畸变的补偿。一到抄送：CaryoScope图（移动窗口大小，五个克隆）显示了三个使用正常基因组DNA的独立阵列CGH实验，分别包括未扩增男性DNA与未扩增女性DNA、扩增（a）男性DNA与非扩增女性DNA以及扩增男性DNA和扩增女性DNA杂交。d日到传真：CaryoScope图显示了与男性胶质母细胞瘤（GBM）DNA的相应杂交实验，特别是未扩增的肿瘤DNA与未扩增的正常女性DNA、扩增的肿瘤DNA与未扩增女性DNA、以及扩增的肿瘤DNA-扩增女性DNA。作为内部控制，X连锁基因的比值表明男性测试DNA与女性参考DNA中这些基因的预期剂量为0.5。扩增的正常DNA或扩增的肿瘤DNA与未扩增的参考DNA的杂交显示出一种可复制的错误表达模式，这表现在两种DNA的克隆表达谱之间存在显著差异一和b条以及介于d日和e（电子）分别是。正如以下两个组织之间几乎相似的代表概况所证明的那样一和c（c）以及介于d日和（f）使用在完全相同的实验条件下扩增的参考DNA，通过平衡扩增效率的区域差异，显著补偿了扩增研究DNA中的克隆错误。

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图6

扩增的肿瘤细胞系、新鲜冷冻和FFPE（p）肿瘤DNA中基因改变的表现。一到抄送：与移动平均对数相关的散点图₂肿瘤和参考DNA均扩增的独立实验的杂交比率(年axis）或两者都不简化（a）(x个轴）。除了显示微阵列上所有基因之间的相关性外，特征性的基因改变——包括ERBB2/TOP2ABT474细胞17q11-22号染色体上的扩增子和血小板衍生生长因子受体A(PDGFRA公司)胶质母细胞瘤（GBM）染色体4q12上的扩增子分别显示。在未扩增和扩增的实验中，所有基因的一致性都很明显。属于一个扩增子的克隆紧密聚集在一起。日期：CaryoScope图描述了肿瘤细胞系和新鲜冷冻和FFPE肿瘤中扩增DNA中的基因扩增和缺失等主要基因改变的高度保存。BT474第17、9p和20q号染色体和新鲜冷冻和FFPE肿瘤第4号染色体特征性变化的两个数据集之间的一致性为R（右）²=0.96，R（右）²= 0.91,R（右）²= 0.92,R（右）²=0.94，以及R（右）²分别为0.90。

基因组改变对肿瘤基因表达畸变的补偿

然后，我们评估了补偿基因畸变的基因组肿瘤区域错误表达的效率。除了分析新鲜冷冻和FFPE胶质母细胞瘤样本外，还研究了特征明确的BT474和MCF-7乳腺癌细胞系，这些细胞系表现出许多基因拷贝数变化。在研究和参考DNA均扩增或均未扩增的实验中，杂交比率相互作图。图6显示了BT474细胞系（包括ERBB2/TOP2A扩增子17q11-q22）和一对匹配的新鲜冷冻和FFPE胶质母细胞瘤（包括PDGFRA公司4q12上的放大器）。整个未扩增数据集和扩增数据集之间存在高度一致性。属于散点图中紧密聚集在一起的一个扩增子的克隆（图6；a至c）相应的CaryoScope图显示，在肿瘤细胞系和新鲜冷冻和FFPE肿瘤中的扩增肿瘤DNA-扩增正常DNA杂交实验中，遗传特征得到了可靠保存。BT474中17、9p和20q染色体上代表性扩增和缺失的一致性为R（右）²= 0.96,R（右）²=0.91，以及R（右）²分别=0.92（图6d）.特征显示出相似程度的一致性PDGFRA公司新鲜冷冻和FFPE胶质母细胞瘤4号染色体上的扩增子(R（右）²=0.94和R（右）²分别为0.90）。

我们感谢Tina Hernandez-Boussard（斯坦福微阵列数据库）在序列比对方面的帮助，感谢Jan Pa[caron]ces（捷克共和国科学院分子遗传学研究所）在GC含量分析方面的帮助。