《美国病理学杂志》。2002年5月;160(5): 1705–1715.
肝星状细胞和转化生长因子-β的作用1囊性纤维化肝病
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彼得·莱温顿
来自肠胃科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
塔马拉·佩雷拉
来自肠胃科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†昆士兰医学研究所,澳大利亚赫斯顿;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
安妮塔·霍斯金斯
来自肠胃科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
金·布里德尔
来自消化内科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
理查德·威廉姆森
来自肠胃科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
罗斯·W·谢泼德
来自肠胃科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
格兰特·拉姆
来自肠胃科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
来自消化内科,*澳大利亚布里斯班皇家儿童医院;肝纤维化组,†澳大利亚赫斯顿昆士兰医学研究所;组织病理学系,†=====================================================================================================================================================================================================澳大利亚布里斯班皇家布里斯班医院;和儿科,§密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院
摘要
囊性纤维化患者的多小叶肝硬化会导致肝脏疾病的显著发病率和死亡率。胆汁转运异常和胆道纤维化暗示胆道生理异常在囊性纤维化相关肝病(CFLD)的发病机制中,但将胆道事件与纤维化联系起来的介质尚不清楚。活化的肝星状细胞(HSC)是一系列肝脏疾病中最显著的纤维化介质。HSC产生基质的主要刺激因素是细胞因子转化生长因子(TGF)-β1在CFLD中,HSC的作用和TGF-β的来源1尚未评估。对38例慢性肝病患儿的肝活检组织进行分析。活化的HSC,通过前胶原α的共同定位鉴定1(一) mRNA和α-平滑肌肌动蛋白被证明是胆管周围纤维化和瘢痕组织前缘过度胶原生成的细胞来源。TGF-β蛋白和TGF-1mRNA表达主要由胆管上皮细胞表达。转化生长因子-β1表达与肝纤维化和显示与CFLD相关的组织学异常的门管区百分比显著相关。本研究证实了HSC在与CFLD相关的纤维化形成中的决定性作用,并建立了通过TGF-β的产生诱导HSC胶原基因表达的潜在机制1胆管上皮细胞。
肝胆纤维化是囊性纤维化(CF)最具临床相关性的肝脏并发症,在肝移植出现之前,占CF人群死亡人数的5%。约20%的CF患者发生肝脏疾病的显著发病率1通常在青春期前或青春期前后发育。2尽管CF领域的医学和科学取得了重大进展,但我们对这些患者肝脏疾病的临床意义、发病机制和管理的认识才刚刚开始。科恩及其同事的本地化,三CF跨膜调节器(CFTR)对胆管上皮细胞(BDECs)顶端结构域的作用支持了胆道生理异常导致炎症和局灶性胆道纤维化的普遍假设。导管周围胶原沉积的常见超微结构发现进一步支持了这一假设4但没有提供可能发生这种情况的机制的线索。胆道CFTR缺陷、胆汁淤积和纤维化的发展和进展之间的联系仍然缺失。
肝星状细胞(HSC)被广泛认为是协调肝细胞外基质形成的关键成纤维细胞。HSC激活,并维持在活动状态是肝纤维化的基本前提。5事实上,HSC在肝纤维化中的作用已被我们小组和其他人在一系列肝纤维化条件下充分记录。6-9然而,HSC在CF相关肝病(CFLD)中的作用尚未明确。活化的HSC表达一种细胞内微丝蛋白,α-平滑肌肌动蛋白(SMA),广泛用作活化表型的标志蛋白。活化的HSC还表达多种不同的细胞因子受体,包括转化生长因子-β1(转化生长因子-β1)受体。TGF-β是一种多向性细胞因子,参与组织生长、分化和免疫反应。10转化生长因子-β1被认为是HSC产生细胞外基质的主要刺激因素。5HSC对胶原蛋白生成的这种重要刺激的细胞来源在不同的疾病状态下可能不同。10我们之前已经证明,在胆道闭锁(儿童胆道纤维化加速的一个例子)中,TGF-β1由肝细胞、HSC和BDEC产生。6本研究旨在证明活化的HSC是否确实是CFLD儿童胶原蛋白生成增加的细胞来源,并通过建立促纤维化细胞因子TGF-β的主要来源来建立纤维化形成的潜在机制1.
材料和方法
患者详细信息和活检收集
经汗液测试证实患有慢性疲劳性痴呆的38名儿童(14名男性,24名女性;中位年龄10.9岁;范围1.0-18.7岁)被怀疑患有慢性疲劳型痴呆。所有儿童都有慢性肝病的证据,至少有以下两种情况:1)临床肝肿大和/或脾肿大;2) 血清丙氨酸氨基转移酶持续升高(ALT>1×正常上限)超过6个月;3) 超声扫描异常,回声异常或结节边缘提示肝硬化。没有儿童患有终末期疾病,所有儿童的合成功能都正常。只有一个孩子的胰腺足够了,其他的孩子在服用推荐剂量的替代酶。没有人接受过肝胆外科手术。24名(63%)儿童有肝肿大和/或脾肿大的临床证据;明确门脉高压13例(34%);新生儿胎粪性肠梗阻12例(32%);胰岛素依赖型6例。33名受试者中有15人(45%)的血清维生素A水平低于正常值。22名患者进行了基因分型,发现14(63%)个df508纯合子,7(32%)个df508杂合子和1个不分型。所有孩子都来自北欧体面家庭。表1总结了临床病理细节.
表1。
患者编号。 | 性别 | 使用年限 | 胎粪伊利斯? | 胰岛素依赖? | 临床肝脏定量? | 门脉高压? | Scheuer纤维化评分 | LPD(0-3) | %PTI公司 |
---|
1 | (f) | 7.9 | | | | | 0 | 0 | 0 |
2 | (f) | 6.5 | | | | | 0 | 0 | 0 |
三 | (f) | 6.7 | | | | | 0 | 0 | 0 |
4 | 米 | 18.7 | | | | | 0 | 0 | 0 |
5 | (f) | 8.9 | | | | | *0 | 0 | 0 |
6 | 米 | 10.8 | 是的 | | 是的 | | *0 | 0 | 0 |
7 | (f) | 11.3 | 是的 | | 是的 | | *0 | 0 | 0 |
8 | (f) | 15.6 | | | 是的 | | *0 | 0 | 0 |
9 | (f) | 17 | | 是的 | 是的 | | *0 | 0 | 0 |
10 | (f) | 2.4 | | | 是的 | | 1 | 0 | 0 |
11 | (f) | 10.5 | | | 是的 | | 1 | 0 | 0 |
12 | 米 | 10 | 是的 | | | | 1 | 1 | 100 |
13 | 米 | 2.7 | | | 是的 | | 1 | 1 | 10 |
14 | 米 | 9.1 | | | 是的 | | 1 | 0 | 0 |
15 | (f) | 8.7 | | | | | 1 | 2 | 50 |
16 | (f) | 15 | 是的 | 是的 | | | 1 | 0 | 0 |
17 | (f) | 14 | | | | | 2 | 2 | 100 |
18 | (f) | 9 | | | | | 2 | 2 | 60 |
19 | (f) | 1 | | | | | 2 | 三 | 100 |
20 | (f) | 11.4 | | 是的 | 是的 | | 2 | 0 | 0 |
21 | 米 | 1.3 | | | | | 2 | 1 | 100 |
22 | 米 | 13.4 | 是的 | | 是的 | 是的 | 2 | 1 | 100 |
23 | 米 | 12.1 | | | 是的 | 是的 | 2 | 1 | 30 |
24 | (f) | 10.9 | | | | | 2 | 1 | 25 |
25 | 米 | 15.9 | | | | | 2 | 2 | 30 |
26 | 米 | 9.9 | | | 是的 | 是的 | 2 | 1 | 60 |
27 | 米 | 15.4 | | | 是的 | 是的 | 2 | 2 | 40 |
28 | (f) | 8.9 | 是的 | | 是的 | 是的 | 2 | 2 | 100 |
29 | 米 | 12 | 是的 | | 是的 | 是的 | 三 | 1 | 100 |
30 | (f) | 11 | 是的 | | 是的 | 是的 | 三 | 1 | 75 |
31 | (f) | 16 | | | 是的 | 是的 | 三 | 三 | 20 |
32 | (f) | 14.8 | | | 是的 | 是的 | 三 | 2 | 100 |
33 | 米 | 15.6 | 是的 | | 是的 | | 三 | 1 | 66 |
34 | (f) | 9.2 | | | 是的 | 是的 | 三 | 三 | 100 |
35 | (f) | 9.9 | 是的 | | 是的 | | 三 | 2 | 30 |
36 | 米 | 8.4 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 | 三 | 2 | 50 |
37 | (f) | 16.4 | | 是的 | 是的 | 是的 | 4 | 1 | 66 |
38 | (f) | 15.6 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 | 4 | 1 | 100 |
没有CF和无肝病儿童的对照组织。正常对照组织来自两个移植供体肝脏(一个男性,13岁;一个女性,10岁)和一个10岁男性上皮样囊肿肝切除术的健康边缘。该研究方案由澳大利亚布里斯班皇家儿童医院伦理委员会批准。
所有儿童均在全身麻醉下接受经皮肝活检。最近的做法是在活检前进行超声扫描以确认安全部位,这在38名患者中的31名患者中进行。所有活检中有纤维化迹象的儿童随后均服用熊去氧胆酸(20 mg/kg/天)。
组织学评估
所有38例肝活检均进行组织病理学检查。将肝组织固定在10%的福尔马林缓冲液中,并包埋在石蜡中。在用苏木精和伊红、苏木精/范吉森、Perls’、周期性酸性-Schiff-diastase、orcin和网织蛋白纤维银增强法染色后,对每个活检组织至少10个水平进行检查。所有标本至少有六个(范围从6到13)门静脉束可供评估。使用Scheuer分级系统评估纤维化的严重程度。11通过评估胆道增生和相关炎症导致的板破裂程度,对正在进行的肝损伤进行半定性评估。11通过对受影响最严重的门静脉道进行评分,认识到同一组织核心内严重程度的差异,对限制板破裂进行了修改,以用于CFLD。根据限制板受损程度是否小于门脉/隔膜周长的三分之一(得分1),是否在周长的一到三分之二之间(得分2),或是否超过周长的二分之二(得分3),给予1到3分。对肝活检中的所有门静脉束进行评估,并计算与CFLD相关的组织学异常(包括胆管增生、炎症、限制性板破裂和纤维化)中涉及门静脉束的百分比(%PTI)。
免疫组织化学
座椅模块组件
为了评估CFLD中是否存在活化的HSC,对肝脏切片进行SMA免疫组织化学检查。所有38个肝脏切片在二甲苯中脱蜡,并在暴露于水中3%过氧化氢以淬灭内源性过氧化物酶之前,用梯度酒精进行复水。然后用小鼠单克隆抗α-SMA一级抗体(1:400,克隆1A4;Sigma Chemical Co.,St Louis,MO)培养它们。如前所述,二级抗体为生物素化兔抗鼠免疫球蛋白(1:400;DAKO,Glostrup,Denmark)。6所用检测系统为链霉亲和素-生物素复合物/辣根过氧化物酶试剂盒(DAKO),显色底物为3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物(Sigma Fast DAB;Sigma Chemical Co.)。使用的阴性对照为非免疫小鼠IgG(1:50;加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物科技公司)。切片用曙红复染。
转化生长因子-β
在38名入选研究的患者中,有30名患者的肝脏组织切片可用。通过在微波炉中以高功率在0.01 mol/L柠檬酸三钠缓冲液(pH 6.0)中加热8分钟,然后在室温下用5%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水(pH 7.6)中封闭20分钟,对肝脏切片进行抗原回收。主要抗体是抗TGF-β1,-2,-3用于TGF-β蛋白细胞定位的抗体(150μg/ml;明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems Inc.)。6使用的阴性对照为非免疫小鼠IgG(1:50,Santa Cruz Biotechnology,Inc.)。然后对切片进行与SMA相同的检测方法。
细胞角蛋白-19
为了确认TGF-β的细胞定位,采用免疫组织化学方法评估BDEC的特异性标记物细胞角蛋白-19(CK-19)的表达。肝脏切片中非特异性结合被3%H阻断2O(运行)2持续10分钟。通过在37°C下将切片在50mg/ml的蛋白酶VIII型(Sigma Chemical Co.)中孵育5分钟来进行抗原回收。切片与小鼠抗CK-19单克隆抗体(1:150,克隆b170,IgG1,Novocastra NCL-CK19;Novocastra,Newcastle,UK)在室温下孵育1小时,然后在DAKO Envision+(山羊抗小鼠免疫球蛋白过氧化物酶缀合物,DAKO)中孵育30分钟。应用DAKO AEC+高灵敏度底物色素检测系统15分钟。切片用苏木精复染。
现场杂交
为了确定活化的HSC是否是增加I型胶原生成的细胞来源,对肝脏切片进行就地α前胶原杂交1(一) 如前所述,mRNA随后进行SMA免疫组化。6
用于检测α前胶原1(一) 人α前胶原1500-bp片段mRNA1(一) cDNA亚克隆到pGEM 11Z载体(美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加)。用于检测TGF-β1mRNA,使用嵌套引物通过聚合酶链反应(PCR)生成308-bp片段,将转录起始位点Sp6和T7分别添加到PCR产物的5′端和3′端。
针对α前胶原产生了用于感觉(对照)和反感的地高辛标记的核糖探针1(一) 和TGF-β1通过在体外用SP6和T7聚合酶转录。现场如前所述,在5μm人肝切片上进行杂交。6通过洗涤去除未结合复合物,并对切片进行免疫组织化学SMA,如前所述,以共同定位前胶原α1(一) ,mRNA对活化的HSC。
TGF-β蛋白定量与组织病理学改变的相关性
由于CFLD疾病过程的焦点性质以及随后TGF-β蛋白和mRNA的不均匀表达,很难充分量化TGF-?水平。我们使用半定量评分系统评估了BDEC中TGF-β蛋白的免疫组织化学表达。该评分系统类似于用于评估与CFLD相关的组织学异常中涉及的门脉束百分比的评分系统(见组织学评估)。计算每次活检中显示TGF-β蛋白在已建立的胆管和/或增生的胆管中呈阳性染色的门静脉束百分比(TGF-?%PTI)。然后将该参数与%PTI相关,以证明胆道TGF-β表达与CFLD胆道损伤之间的相关性。
TGF-β的定量1实时逆转录酶(RT)-PCR检测mRNA
RNA提取和cDNA合成
评估TGF-β的参与1在CFLD相关的胆汁淤积性损伤中,我们定量了TGF-β的表达1采用实时RT-PCR技术检测CFLD患者的mRNA表达,并与纤维化相关。11例慢性肝病患者的冷冻肝组织可用。这些患者包括三名0级纤维化患者,三名1级纤维化患者、两名2级纤维化患者和一名3级纤维化患者以及两名4级纤维化患者。活检时,从肝芯切下一小块3至4毫米的肝脏,立即用干冰冰冻。根据制造商的说明,使用总RNA分离试剂(英国萨里先进生物技术有限公司)从冷冻切片中提取RNA。对照RNA也从年龄匹配的供体肝组织中提取(n个= 2). 通过溴化乙锭染色和OD评估RNA完整性260纳米/外径280纳米吸收比>1.8。
如制造商所述,用Superscript II(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)使用寡核苷酸引物逆转录两μg总RNA。在PCR扩增之前,将得到的cDNA稀释2.5倍。
引物设计窗口
人TGF-β分析引物1使用Primer Express软件(加州福斯特市Perkin Elmer)设计家政基因β-actin。转化生长因子-β1正向引物为TCACCATAGCACCTCTGAGATG,反向引物为CCTTAACCTCTGGGCTTTTT,扩增子长度为84 bp。β-actin正向引物为CAGGCACCAGGGCGTTG,反向引物为GCCCACATAGGAATCCTTCTGA,扩增子长度为52 bp。
实时RT-PCR
使用Rotorgene热循环器(澳大利亚悉尼Corbett Research)进行实时PCR。用1μmol/l正向引物、1μmol/l反向引物和2μl cDNA在20μl体积内进行反应。核苷酸,MgCl2,塔克聚合酶和SYBR green被纳入SYBR green PCR主混合物(Perkin Elmer)。以1:1000稀释度添加额外的SYBR Green(澳大利亚珀斯Fisher Biotech)。每个样品扩增三份。PCR条件包括在50°C下培养5分钟以激活尿嘧啶-N个-糖基化酶(UNGase)可以去除之前PCR产品中的任何残留污染物,然后在94°C下进行5分钟的变性步骤。扩增进行了40个周期(94°C下变性15秒,60°C下退火15秒,72°C下延伸30秒)。荧光产物的检测在72°C退火步骤结束时进行。循环后进行熔融曲线分析(50至90°C,升温速率为每秒1°C),以确认特定PCR产物(TGF-β1或β-肌动蛋白)和不存在非特异性扩增或引物二聚体。
TGF-β的表达1mRNA标准化为三份CFLD活检和对照肝标本中看家基因β-actin的表达。平均标准化TGF-β1然后,每个CFLD活检的mRNA表达相对于TGF-β1对照组的mRNA。转化生长因子-β1mRNA的表达与每个CFLD患者的纤维化相关。
统计分析
TGF-β%PTI和%PTI之间的相关性采用Pearson秩相关法测定。TGF-β之间的相关性1mRNA表达和组织纤维化分级采用Spearman秩相关不连续变量进行测定。对于所有统计分析,aP(P)值<0.05被认为是显著的。
结果
CFLD的组织病理学评估
表1列出了38名患者的组织病理学检查结果九次活检的纤维化评分为零,其中五次仅显示脂肪变性(用星号表示)。其余显示了胆汁淤积、胆管增生、脂肪变性、门脉炎症和纤维化的常见谱,范围从Scheuer 1级到4级(图1A)19名患者(50%)患有中度纤维化(Scheuer等级1至2),10名患者患有重度纤维化(Schuer等级3至4)。限制性平板破裂的严重程度是可变的,与已确定的纤维化的严重程度无关。主要炎性细胞为中性粒细胞,并伴有胆管增生,提示胆道梗阻。没有发现其他组织病理学诊断可以解释这些患者的肝脏疾病。对照组织组织学正常。
一名患有慢性粒细胞性肝病和胆道纤维化的儿童的肝组织连续切片显示,活化的HSC是胶原蛋白生成的细胞来源。答:苏木精/范吉森染色显示门脉,胆管增生和纤维化(粉红色)延伸至实质。B类:SMA(棕色)和就地用α前胶原反义探针进行杂交1(一) mRNA(蓝色)显示胆管周围和纤维化推进边缘的HSC激活。抄送:SMA(棕色)和就地用α前胶原敏感(对照)探针进行杂交1(一) mRNA,确认就地杂交见于B类激活的HSC(棕色)在胆管周围和进展中的纤维化中更为明显。医生:α前胶原的共缩合1(一) SMA阳性激活HSC的mRNA表达(蓝色)(棕色),显示HSC的星状形态。原始放大倍数:×200(A–C); ×1000(D类)。
激活HSC的识别
α前胶原的细胞来源1(一) mRNA表达
SMA的表达表明活化的星状细胞,并且在所有CFLD活检中检测到SMA的增加表达。SMA的表达范围从轻度门静脉周围到全口静脉。活化的HSC尤其见于门管区和增生胆管周围的细胞外基质,以及门管区之间的纤维间隔桥接(图1;A至C). 此外,α前胶原1(一) mRNA表达与SMA阳性HSC共定位(图1、B和D和图2A)证明活化的HSC是导致CFLD肝纤维化的胶原增加的细胞来源。值得关注的是,HSC前胶原α的主要区域1(一) mRNA表达位于瘢痕组织形成的生长边缘,可见HSC的星状形态(图1D).α前胶原1(一) mRNA在肝细胞、BDEC、平滑肌细胞或门脉血管中未表达。前胶原α1(一) 使用感测探针(图1C),SMA阳性HSC中无信号可证明mRNA信号特异性窦周或门周SMA或前胶原α均无显著表达1(I) 正常对照肝活检中的mRNA(结果未显示)。
导管周纤维化时激活的HSC(A类和B类)在没有组织纤维化的情况下(C和D类). 一名患有慢性粒细胞性肝病的儿童的肝组织连续切片显示出纤维生成活性和胆管周围纤维化。答:免疫组织化学显示扩张胆管周围SMA(棕色)激活的HSC。通过SMA(棕色)和前胶原α的共同定位,在活化的HSC中可以看到当前的成纤维活性1(一) mRNA(蓝色)(星号)。B类:连续切片的苏木精/范吉森染色显示胶原沉积(粉红色)共同定位于扩张胆管周围活化的HSC区域。表达α前胶原的HSC1(一) mRNA输入A类已识别(星号)。抄送:在没有纤维化组织学证据的CFLD肝脏中也观察到SMA表达增加。SMA免疫组化显示窦周活化HSC(棕色)。医生:用苏木精/范吉森染色的连续切片纤维化分级为零。原始放大倍数:×1000(A类,B类); ×100 (C,D类)。
活化HSC的共定位和胶原蛋白沉积增加
采用苏木精/范吉森染色对肝活检组织进行胶原蛋白沉积的组织学检查。图2B显示胆管扩张,周围胶原蛋白沉积过多。图2A显示同样扩大的胆管周围活化的HSC数量增加,显示SMA和α前胶原共同定位1(一) mRNA在胶原蛋白沉积增加的同一区域。
CFLD中存在活化的HSC而无组织纤维化
在9例CFLD活检中也观察到SMA表达增加,没有组织学纤维化的证据(图2,C 与D) 。这表明活化的HSC的存在可能是这些患者肝纤维化发展的早期标志。
转化生长因子β的细胞来源1在CFLD中
转化生长因子-β的免疫组织化学
TGF-β蛋白的免疫组织化学显示,30例肝活检中有19例(63%)的表达增加。BDEC的表达主要见于已建立的胆管(无论周围是否有纤维化)和增生的胆管内,偶尔也见于腺泡门脉周围的HSC(图3A)TGF-β在再生结节内和瘢痕界面的肝细胞中也有表达(图3、C和D)在纤维化分级为零的5例活检中,有2例(40%)、16例活检中的9例(56%)和9例活检中有8例(89%)显示出显著的TGF-β表达。在使用非免疫IgG作为第一抗体的阴性对照中(结果未显示)或在正常对照肝活检中未检测到TGF-β表达(图3B).
一例CFLD患儿肝组织切片显示TGF-β1在BDEC中表达最显著,在瘢痕界面的肝细胞中表达较少。BDEC中TGF-β蛋白表达(棕色)的免疫组织化学(A类)沿着肝细胞再生结节的纤维边缘(C)和BDEC(D类)。B类:对照组肝组织中TGF-β蛋白无明显表达。电子邮箱: 现场TGF-β杂交1使用反义探针在BDEC中显示mRNA表达(蓝色)。传真: 现场使用TGF-β进行杂交控制1mRNA传感探针,确认在C.原始放大倍数:×400(A类,D类); ×200 (B、 C类,E类,F类)。
转化生长因子-β的原位杂交1
现场杂交显示TGF-β1mRNA主要表达于增生导管内的BDEC,也偶尔表达于瘢痕内的HSC(图3E).转化生长因子-β1使用感应(对照)探针证明了信使核糖核酸信号的特异性(图3F).没有显著的TGF-β1正常对照肝活检中的mRNA表达(结果未显示)。
CK-19染色
通过免疫组织化学,我们证明TGF-β在BDEC中表达(图4,A和C)通过CK-19在肝脏连续切片中的表达进行鉴定(图4、B和D)当检测到TGF-β表达时,在两个已建立的胆管中都存在(图4A)无论周围是否有纤维化,也包括增生性胆管(图4C).
一名患有慢性粒细胞性肝病的儿童的连续肝脏切片表明,CK-19阳性的BDECs与扩张的门脉中TGF-β蛋白的表达增加有关。肝纤维化区域周围已建立胆管内BDEC TGF-β蛋白表达(棕色)的免疫组织化学研究(A类)扩张的门脉和瘢痕组织形成的生长边缘的增生性胆管(C). 肝连续切片CK-19表达(红色)的免疫组织化学研究A类和C分别在已建立的胆管内被纤维化区域包围的BDEC中(B类)扩张的门脉和瘢痕组织形成的生长边缘的增生性胆管(D类). 原始放大倍数,×200。
转化生长因子-β的作用1胆道纤维化
TGF-β蛋白表达与损伤组织病理学参数的相关性
由于CFLD疾病过程的局部性质以及由此导致的TGF-β蛋白和mRNA的不均匀表达,很难对肝脏中TGF-?水平进行充分定量。在19例显示TGF-β表达的活检中,12例显示BDEC内的TGF-?免疫组化。我们使用了一种半定量评分系统(参见TGF-β免疫组织化学的材料和方法部分)来评估每次活检中,在已建立的胆管和/或增生的胆管内TGF-?蛋白(TGF-。TGF-β%PTI与%PTI显著相关,门静脉束显示组织学异常的百分比与CFLD相关(第页= 0.65,P(P)< 0.03; 图5). 这表明TGF-β蛋白最有可能在显示组织学异常的门管区BDEC中表达,因此与疾病活动性标记物相关。
BDEC内TGF-β蛋白阳性染色的门静脉束百分比(TGF-。TGF-β%PTI与%PTI显著相关(第页= 0.65,P(P)< 0.03;n个= 12).
TGF-β之间的相关性1mRNA表达与纤维化
转化生长因子-β1对11例CFLD患者和2例对照组的snap冷冻肝组织中的mRNA表达进行定量。转化生长因子-β1与对照组相比,CFLD患者的mRNA表达显著增加8.2±3.4倍(P(P)= 0.05). 此外,转化生长因子-β1mRNA表达与纤维化组织学分级(第页= 0.78,P(P)<0.005),证明TGF-β的决定性作用1与CFLD相关的发病机制(图6).
TGF-β的定量1CFLD mRNA表达与肝纤维化组织学分级的相关性。转化生长因子-β1mRNA表达标准化为每个CFLD活检和对照组中看家基因β-actin的表达。TGF-β的表达1然后,每个CFLD活检中的mRNA表达为-倍的增加与控制。转化生长因子-β1mRNA表达与纤维化组织学分级显著相关(第页= 0.78,P(P)< 0.005;n个= 11).
讨论
本研究表明,活化的HSC在与CF相关的纤维化肝病中产生增加的I型胶原。本研究还表明促纤维化细胞因子TGF-β的主要来源1在CFLD中是胆管上皮,并且肝细胞在再生结节内和瘢痕界面处也产生增加水平的TGF-β。
CFLD的进展通常是缓慢的、不规则的、不均匀的。因此,在我们的研究中,TGF-β在CFLD中的表达在分布和表达水平上都是可变的。这与我们在加速纤维化模型(如胆道闭锁)中的发现形成对比6其中胆道炎症和随后的纤维化可以迅速进展,TGF-β染色更加强烈和均匀,反映了蛋白质数量。然而,在本研究中,我们已经证明,在显示组织学异常的门静脉束百分比和显示BDEC中TGF-β蛋白表达增加的门静脉道百分比之间存在显著相关性。这证实TGF-β蛋白最有可能在门管区表达,显示了当前疾病活动的组织学证据。在这些结果的基础上,我们证明了TGF-β的表达与1mRNA、实时RT-PCR和纤维化组织学分级。这些观察结果为TGF-β的决定性作用提供了有力证据1与CFLD相关的纤维生成。
在这项研究中,我们证明了一些肝脏活检没有肝纤维化的组织学证据,然而,在所有这些活检中,活化的HSC数量增加。虽然不可能从没有肝病的CF患者身上获得肝脏作为对照,但很容易推测CFLD中活化HSC的存在可能会作为早期纤维化证据的标记物发挥潜在作用。然而,这一发现的重要性需要对这些患者进行长期随访。
CFLD的发展和进步仍然是一个谜。与CFTR基因型无关12或任何其他当前临床标志物。2最近,工作人员假设CFLD的发展受到不同于CFTR区域的遗传因素的调节。13染色体19q14上发现的CF修饰基因易导致胎粪性肠梗阻并发症,这突出了共病基因对表型表达的贡献。14甘露糖结合凝集素(一种免疫调节蛋白)的等位基因变异体与肝硬化的发展相关联,加强了CFLD中共存基因的作用。15自从CFLD中最早的胆道纤维化病理描述以来,16Cohn及其同事随后将异常CFTR定位于胆管细胞三以及Kinman及其同事进一步证明CFTR在CFLD患者BDEC中异常细胞质免疫定位,17将胆道事件与纤维化的发展联系起来仍然是一个挑战。目前关于慢性肝病发病机制的理论认为,胆汁氯离子转运异常会导致胆汁水化缺陷,胆汁流动受损,由此导致的胆汁淤积会引发纤维化。CFTR氯离子通道是产生电化学梯度以促进钠离子通量的主要转运体。由此产生的渗透梯度有助于管腔内容物的水合作用。正常的CFTR通道还提供氯离子与碳酸氢盐离子交换,以碱化胆汁。人们提出了各种机制,将胆汁的异常水合作用和pH值与慢性疲劳性肝病的发生联系起来。工作人员试图通过胆汁酸池本身的变化将胆汁酸转运缺陷与肝脏损伤联系起来,但没有成功。18其他人推测,在被浓缩胆汁阻塞的胆管中,随着甘氨酸结合物的增加,有毒胆汁酸的积聚可能会介导CFLD。19 体外研究表明胆汁酸可引起肝细胞凋亡20可能与胆管细胞功能障碍有关。21CF患者的肝内和肝外胆道树结构异常22无论有无肝病,它们对慢性肝病的发病机制有多大作用尚不清楚。
本研究建立了胆道事件与α前胶原表达之间的联系1(一) CFLD患者活化HSC的mRNA,即促纤维化细胞因子TGF-β的产生1BDEC及其与组织纤维化的关系。进一步阐明TGF-β的作用1在CFLD中是特别相关的。鉴于最近有证据表明某些转化生长因子-β1基因型与肺纤维化和功能更迅速恶化有关。23TGF-β是一种多功能肽生长因子,对生长、分化、细胞外基质沉积和免疫反应具有广泛的影响。10它是多种纤维化肝疾病中细胞外基质沉积的主要刺激因素,5包括胆汁淤积,通过刺激激活的HSC中转录水平的胶原蛋白基因表达。24它还通过引起肝细胞凋亡在淤胆性肝病中发挥重要作用25和HSC凋亡在大鼠模型中解决胆道纤维化。26TGF-β的关键作用1研究发现,在缺乏TGF上调的情况下,肝脏的炎症反应不会导致纤维化刺激和胶原沉积,这一发现突显了肝纤维化。27在肝硬化人肝组织的研究中,TGF-β的mRNA1结缔组织生长因子是最近发现的TGF-β下游介质,定位于活化的星状细胞、内皮细胞和BDEC,其表达程度与纤维化严重程度相关。28我们小组首次探讨了TGF-β在小儿胆汁淤积性肝病中的作用,证明TGF-1在胆道闭锁中,BDEC的表达尤为局限。6随后,罗森威格及其同事29表明TGF-β在肝脏的表达1经免疫组织化学评估,与正常肝组织相比,CF继发肝纤维化和胆道闭锁的儿童的蛋白质增加。然而,本研究没有检测TGF-β的细胞定位1我们的研究不仅证实了TGF-β表达增加,而且证明了BDEC是TGF-?的主要细胞来源1在CFLD。在这方面,它类似于胆道闭锁,突出了胆汁淤积对发病机制的影响。刺激BDEC产生转化生长因子-β的机制尚待确定1通过疏水性胆汁盐的滞留、在免疫调节受损的情况下感染因子的共同刺激或通过另一种尚未定义的刺激发生。
致谢
我们感谢Sonia Greco和Nancy Blanch在CK-19免疫组织化学和α前胶原生成方面的专业技术援助1(一) mRNA核糖探针。
脚注
向昆士兰皇家布里斯班医院昆士兰医学研究所肝纤维化组组长Grant A.Ramm博士提出转载请求。,4029,澳大利亚。电子邮件:.ua.ude.rmiq@rtnarg文件
由澳大利亚布里斯班皇家儿童医院基金会(Royal Children’S Hospital Foundation)的重大研究项目拨款(编号:913-005 to P.J.L.,R.W.S.,G.a.R.)支持。
工具书类
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