血管生成模拟与肿瘤血管生成

摘要

肿瘤需要血液供应来维持生长。肿瘤微循环在肿瘤的血行播散中起着重要作用。肿瘤获得血液供应的机制受到了广泛关注。肿瘤从现有循环中吸收新血管是一个公认的范例1-血管生成是由肿瘤细胞分泌的因子，如福克曼2,3或来自周围基质细胞。4肿瘤血管生成的主题有两种变化：前体内皮细胞增强血管生成反应和血管吸收。麻原彰晃及其同伙5描述了从循环外周血中提取的内皮细胞祖细胞（或成血管细胞）并入缺血驱动的血管生成部位。Holash和同事6描述了一个“血管协同”的过程，在这个过程中，肿瘤与现有的血管系统相互作用，退化导致大量坏死，然后通过上述肿瘤血管生成使肿瘤周围血管化。

我们7最近描述了肿瘤形成高度模式化微循环的一个新过程，该微循环独立于血管生成：在侵袭性原发性和转移性黑色素瘤中，肿瘤细胞生成由细胞外基质组成的无细胞微循环通道，并由肿瘤细胞外排。这个从头开始侵袭性和转移性肿瘤细胞生成血管通道严格来说并不是血管生成事件，因为真正的血管生成导致从头开始内皮细胞血管的形成。因此，我们将“血管生成拟态”命名为侵袭性肿瘤细胞产生由细胞外基质界定的非内皮细胞排列通道的过程。

侵袭性肿瘤生成自身血管通道网络的机制的发现，挑战了普遍认为血管生成和相关机制是肿瘤获得血液供应的唯一途径的假设。7比塞尔8进一步指出，血管生成拟态对外科病理学实践提出了挑战，并为发展新的成像技术和癌症治疗策略提供了机会。

背景

血管生成拟态的微循环模式特征首次在葡萄膜（眼内）黑色素瘤中被描述。9,10虽然皮肤黑色素瘤更普遍，但人们可以利用葡萄膜黑色素瘤的一些独特生物学特性来研究人类癌症模型中肿瘤进展和转移的关键问题。11

皮肤黑色素瘤通常起源于表皮隔室，需要突破表皮基底膜，肿瘤细胞才能与真皮间质直接相互作用。虽然皮肤黑色素瘤可能通过血液传播，但转移的第一条途径通常是区域淋巴结。相反，葡萄膜黑色素瘤发生在脉络膜、睫状体或虹膜的间质内，没有上皮内生长期。眼睛内没有淋巴管。因此，葡萄膜黑色素瘤是研究肿瘤血行播散生物学的理想人体肿瘤系统。此外，葡萄膜黑色素瘤首先优先扩散到肝脏，12使其成为研究器官靶向转移的理想人体模型。

皮肤和葡萄膜黑色素瘤的治疗有一些重要的区别。皮肤色素性病变可通过切口和切除活组织检查而无明显并发症。患者普遍害怕失去视力，只有癌症对生命构成的威胁才能超越这种恐惧，11而且不可能在不影响视力的情况下对眼内肿瘤进行切割活检。一些眼科肿瘤学家对眼内肿瘤进行细针抽吸活检（FNAB），以区分黑色素瘤和临床上模拟黑色素瘤的病变，如转移到眼睛。13-15在这样做时，他们只进入肿瘤一次，以避免干扰视力。因此，单程眼科FNAB不能提供肿瘤的广泛取样（在其他组织部位，从不同角度多次进入病灶增加了代表性取样的可能性16)。眼内肿瘤的眼科单程FNAB取样不能获得令人满意的材料，用于细胞学异质性肿瘤的预测。17-19

患者可能会有大量的肝转移疾病，并维持正常的肝酶。20因此，任何可能有效治疗转移性黑色素瘤的新疗法的应用，如果在转移性肿瘤负担巨大之前应用，将是最有效的。在诊断时确定转移风险高的患者将促进辅助治疗的实施。21随着越来越流行的趋势是通过使用放射、热疗和激光治疗等保留视力的初级肿瘤消融方法来避免切除含有眼睛的葡萄膜黑色素瘤，病理学家很可能不会遇到任何组织来为医学肿瘤学家提供预后建议。因此，这将有助于那些管理葡萄膜黑色素瘤患者的医生通过非侵入性活检替代物来评估原发性葡萄膜黑素瘤患者的临床病程。

1984年，我们开始了一系列研究，以确定葡萄膜黑色素瘤的属性，这些属性是肿瘤进展的有力标志，并且可以通过无创成像技术检测到。因为血管造影可以直接显示眼睛内部及其循环，所以我们首先关注的是黑色素瘤微循环。

葡萄膜痣的微循环

目前还没有准确反映原发性人类葡萄膜黑色素瘤组织学和行为的动物模型。22很少有动物会自发发展出这些肿瘤，而色素性眼内肿瘤的转基因模型23-26视网膜色素上皮分化的组织学特征使其复杂化（葡萄膜黑色素瘤是由虹膜、睫状体或脉络膜的黑色素细胞发展而来，而不是由视网膜色素上皮发展而来；视网膜色素上皮肿瘤在人类中很少见27).

继应用7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）研究动物原发性皮肤黑色素瘤组织发生的先例之后，28-30Folberg等人22,31试图通过在兔巩膜上反复应用这种致癌物来诱导原发性葡萄膜黑色素细胞损伤。兔子虽然不常用于致癌研究，但它的眼睛内部适合反复拍照，从而有机会观察正常组织中出现的色素性病变。有可能在色素兔的脉络膜中诱发痣，但将这些病变促进为黑色素瘤的尝试被放弃，因为进行性角膜混浊排除了对新出现病变的临床（眼底镜）观察。

在这些色素兔中诱导的痣提供了一个研究最早临床可检测病变组织学的机会。这些动物的脉络膜变得厚厚，有色素沉着、细胞学上无色素的黑色素细胞，这些黑色素细胞似乎聚集在原有的脉络膜血管周围。这些血管通过组织学检查很容易识别，因为它们在脉络膜组织中分布均匀。Naumann等人32早先描述了人类葡萄膜痣的组织学外观，他在其中指出，人类葡萄膜色素痣也包含先前存在的脉络膜血管。汤普森等人33描述了肿瘤合并原有血管而不破坏原有血管的情况。

葡萄膜黑色素瘤的微循环

大多数葡萄膜黑色素瘤（97%）含有实验诱导的脉络膜痣和人类葡萄膜痣中存在的内皮细胞样血管（图1）▶.10然而，在许多葡萄膜黑色素瘤中很难检测到较小的微血管，特别是在色素沉着的肿瘤中，从组织化学反应中检测色素是相当困难的。

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图1。

正常脉络膜血管并入葡萄膜痣和黑色素瘤。答：脉络膜痣。痣细胞围绕着四个预先存在的脉络膜血管。B类：脉络膜黑色素瘤。在扫描放大镜下，肿瘤内几乎没有血管被检测到，尽管在肿瘤边缘附近（盒子内）发现了一些血管。抄送：脉络膜黑色素瘤。装箱区放大倍数更高B。肿瘤边缘的血管完全由内皮细胞排列，这些血管有一个突出的纤维鞘，这与新生血管的特征不同，但具有正常脉络膜血管的特征。尽管这个肿瘤很大，但没有坏死的迹象。医生：内皮细胞内衬的正常脉络膜血管(箭头)包被独特的纤维结缔组织鞘，被上皮样和梭形黑色素瘤细胞包围。血管未受损，已并入肿瘤。原始放大倍数：A类，标尺，250μm；B类，比例尺，2 mm；C中，标尺，100μm；天，比例尺，25μm。A类–天苏木精-伊红。

在描述组织化学染色后通过过氧化氢漂白去除黑色素沉着的组织化学技术之前，34Folberg等人9荧光标记法探讨葡萄膜黑色素瘤的微循环欧洲榆凝集素I（UEA-I）和激光扫描共聚焦显微镜观察Ulex公司通过黑色素沉着发出信号。我们发现了多种染色模式，包括长而直的血管结构，这些结构经常以平行的管束排列，偶尔也会发生交联。乌莱克斯-肿瘤细胞圆形包周围的阳性环也被记录在案。这些乌莱克斯-阳性通道推测为内皮细胞系血管。9

这些相互关联模式的预后意义的统计分析乌莱克斯-阳性结构需要对大量肿瘤进行研究。使用激光扫描共聚焦显微镜来研究一系列肿瘤是不切实际的，在没有连续染色的情况下乌莱克斯，Folberg等人9通过染色与这些结构相关的基底层基质来显示这些血管通道。眼科病理学家通常使用周期性酸性-Schiff染色来突出感兴趣的眼内基底膜（如Bruch膜和Descemet膜）。PAS染色突显了乌莱克斯在相应的组织切片中。通过省略苏木精复染，减少了肿瘤细胞核引起的视觉混乱，PAS阳性模式变得更加明显。此外，通过在显微镜的光路中引入绿色滤光片（或稍后通过在数字图像上选择绿色通道），PAS阳性图案的洋红颜色呈现出鲜明的黑色，并且易于识别。

在一项初步研究中，Folberg等人9检查了20对符合生存状态的肿瘤（20名患者死于转移性黑色素瘤，20名患者存活15年或更长时间无瘤生存）。每对肿瘤在眼睛内的大小和位置也相匹配（局限于脉络膜或睫状体）。记录每个肿瘤内是否存在PAS阳性环。封闭PAS阳性环的组织学检测与预测转移的其他组织学特征的存在相关：改良Callender分类中存在上皮样黑色素瘤细胞，35和有丝分裂像。

通过对葡萄膜黑色素瘤内闭合环的组织学鉴定，将其作为肿瘤进展的强预测标记，注意在葡萄膜黑色素瘤中检测其他PAS阳性微循环相关模式的可能性，这些模式可以通过非侵入性临床试验检测出来，作为病理学家检查组织侵入性采集的替代物。Folberg等人10后来在葡萄膜黑色素瘤的组织切片中发现了七种PAS阳性通道的形态模式（图2）▶：直通道、平行直通道的排列、交叉连接的直通道、弧（不完全闭合环）、带分支的弧、闭合环和网络（网络被任意定义为至少三个背对背的闭合PAS正环）。这些模式后来被发现被组织成两个层次分组。36含有交叉连接的平行血管的肿瘤也含有平行通道和孤立的直通道，而含有网状结构的肿瘤也包含环、有分支的弧和无分支的弧。

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图2。

与常规苏木精-伊红染色切片相比，经改良PAS染色（无苏木精复染）的原发性葡萄膜黑色素瘤的模式。答：直通道。通道张开，包含循环的红细胞(箭头).B类：平行直通道交联(箭头).抄送：在显微照片的中心可以识别出弧（不完整的环），在最右边可以识别出一组背对背的完整环。医生：网络，定义为至少三个背靠背环路。正常脉络膜血管上方的显微照片中央可见三个背对背的大环(箭头)，但整个显微照片的上半部分都有较小的完整环。电子邮箱：三个苍白的上皮样黑色素瘤细胞簇与肿瘤区域相对应，肿瘤区域由相邻截面中的大直径PAS阳性环所分隔天（该箭头表示正常脉络膜血管供参考）。循环的方框区域以更高的放大倍数显示如果.传真：红血球在封闭的环边缘的一个空间内被识别天箭头指向苏木精-伊红突出显示的循环轮廓。原始放大倍数：A类和F、，标尺，50μm。；B类–E类，比例尺，100μm。A类–天，改良PAS，无苏木精复染；9 E类和如果苏木精-伊红。

为了对微循环相关PAS阳性组织学模式的可能影响进行更稳健的统计分析，Folberg等人10研究了234只因脉络膜或睫状体黑色素瘤而摘除的眼睛。对每种PAS阳性模式的预后意义进行了测试。转移性黑色素瘤继发死亡产生的Kaplan-Meier生存曲线表明，在10年随访中，肿瘤缺乏交联平行血管通道、环和网络的患者的生存率显著提高（91.7%、91.1%和88.3%）与肿瘤中含有这些模式的患者相比（56.9%、55.4%和50.7%）；P（P）=0.0001，用于所有比较；n个= 234). 生成了多变量Cox比例风险模型，该模型允许包括传统的预后组织学标记，如肿瘤大小、眼睛内的位置、根据改良Callender分类的细胞类型、有丝分裂图和肿瘤浸润淋巴细胞，PAS阳性血管通道模式的存在与否，以及患者相关的特征，如年龄和性别。PAS阳性网络首先进入模型（χ2= 40.84;P（P）= 0.0001). 其他重要变量包括（按重要性降序排列）肿瘤大小、有丝分裂、交联平行血管通道、肿瘤浸润淋巴细胞的存在和男性。回路没有作为独立变量进入模型，因为网络是模型中最重要的变量，由回路组成。在单变量模型中，弧和带分支弧的存在都与转移性黑色素瘤的显著死亡率相关。

随后，一些独立实验室证实了这些PAS阳性模式（主要是环路和网络）的预后意义。37至41这些模式的组织学检测具有高度的观察者间可靠性。10,37,41

任何PAS阳性模式之间的预后关联取决于仅检测组织切片中任何位置的模式：模式要么存在要么不存在。因为这些模式往往是连续的（例如，弧连接到形成网络的回路），所以很难通过计算离散结构来量化模式。然而，可以通过计算感兴趣的模式所占肿瘤组织学准备中横截面积的百分比，通过模式来测量肿瘤重塑的数量。葡萄膜黑色素瘤适合于这项技术，因为肿瘤的整个横截面积几乎总是可以包含在标准的玻璃微片中。使用这种方法，Mehaffey等人42转移性黑色素瘤的死亡与占肿瘤横截面积2%或更多的网状或交叉平行血管的存在有关。

在肝转移瘤和所有继发转移部位均检测到PAS阳性环路和网络。43因此，侵袭性黑色素瘤形成这些模式的能力似乎并不依赖于眼睛的微环境，而是代表了这种侵袭性肿瘤细胞表型的固有特性。

葡萄膜黑色素瘤PAS阳性模式的血管性质

Foss等人44,45质疑葡萄膜黑色素瘤中PAS阳性模式是微循环组成部分的说法。由于无法通过对组织切片进行因子-VIII相关抗原染色来证明PAS阳性模式，这些研究人员证明了因子-VIII有关抗原的肿瘤染色点数与生存率之间的关联。按照Weidner等人描述的方案，46他们假设每个被假定内皮细胞标签染色的离散点代表一条离散的血管。Foss等人44,45发现PAS阳性模式与单变量模型的结果相关，但当允许“血管计数”进入模型时，就退出了多变量模型。

在回顾Foss等人的工作时，44,45福尔伯格47Rummelt等人48指出，通过连接Foss等人发表的显微照片中由因子VIII相关抗原标记的离散点，45可以在葡萄膜黑色素瘤的组织切片中显示环状模式。附带说明，甚至Folberg等人的初步研究9使用荧光标记乌莱克斯激光扫描共聚焦显微镜显示循环、网络和交联平行血管通道的标记不连续。

Folberg等人36表明葡萄膜黑色素瘤中PAS阳性模式确实是肿瘤微循环的一种形式，原因如下。首先，他们36和其他41,44,49用假定的标记物标记这些PAS阳性模式（尽管是以不连续的方式）乌莱克斯，CD31和CD34。其次，他们将这些模式直接追溯到涡脉（图3）▶ 36（脉络膜的主要静脉引流）和脉络膜内已有的血管（图3）▶.50第三，他们36,51进行三维重建乌莱克斯-葡萄膜黑色素瘤中标记的PAS阳性模式，显示出相对平坦的通道分支并形成环状模式。

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图3。

PAS阳性循环模式连接到先前存在的正常血管，而不干预血管生成。答：网络追踪到涡旋脉(箭头)。没有证据表明血管生成干预了网络和涡旋静脉之间的关系。B类：图2、D和E中所示正常血管的放大倍数较高▶.包含红细胞的环（图2F）▶直接连接到这个预先存在的正常血管，而不干预血管生成。原始放大倍数：A类和B类，比例尺，50μm。；A类和B类，无苏木精复染的改良PAS（图3A▶修改自Folberg等人36).

至少还有三个其他观察结果支持这些代表功能性微循环的模式：1）直径大于等于1厘米的葡萄膜黑色素瘤没有坏死（图1）▶提示这些肿瘤灌注良好：这些肿瘤可能缺乏内部血管生成的组织学证据，但包含大量相互连接的PAS阳性模式通道7; 2） 红细胞通常呈单列（rouleaux）排列，在这些模式中经常被检测到（图4）▶ 7; 眼科医生在肘管前静脉注射吲哚青绿后几秒钟内，利用共焦成像系统检测到葡萄膜黑色素瘤患者的环状结构。52-54此外，在摘除眼球之前对循环模式的血管造影检测与相应肿瘤组织切片中PAS阳性循环模式的检测相关。7,53个

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图4。

血管生成模拟模式中的灌注。答：红细胞柱呈弧形，无分支。内皮细胞核未在该通道中被识别。一薄层细胞外基质(箭头)从该通道延伸。B类：没有血液灌注的细平行通道(箭头)局部张开显示管腔中的红细胞。这些通道都没有内皮层。原始放大倍数：A类，标尺，10μm；B类，标尺，50μm；A类和B类苏木精-伊红。

葡萄膜黑色素瘤的模式化微循环：是血管生成吗？

Foss等人44,45,55还认为Folberg等人10由于这些模式的拓扑排列，不可能是血管性的：在二维组织切片中，血管结构不会形成环状模式。

眼内肿瘤血管生成的组织学表现是什么？视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma）是儿童最常见的眼内肿瘤，具有高度的血管生成性，其特征是肿瘤内有大量血管，血管内皮细胞清晰排列。在视网膜母细胞瘤中，坏死区位于瘤内血管周围的活肿瘤细胞袖带远端（图5）▶.56血管内皮生长因子在这些高血管生成性肿瘤中表达上调。57,58奇怪的是，尽管有证据表明视网膜母细胞瘤的瘤内血管生成活跃，但只要肿瘤局限于眼睛，转移性视网膜母细胞癌的死亡就非常罕见；只有当肿瘤侵入视神经、葡萄膜束或延伸至眼外时，死亡风险才会增加。59

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图5。

视网膜母细胞瘤的血管生成。答：识别出许多离散的血管。注意坏死区(左边和右上角).B类：放大倍率更高。袖带中的血管周围有活的肿瘤。在离血管生成血管较远的地方发现坏死。抄送：在进一步放大的情况下，视网膜母细胞瘤内的内皮细胞萌芽在组织学上被识别。内皮细胞(箭头)通过光学显微镜在每个血管中进行鉴定。原始放大倍数：A类，标尺，500μm；B类，标尺，100μm；C类，比例尺，50μm。A类–C类苏木精-伊红。

相比之下，人们很少看到视网膜母细胞瘤特有的血管生成模式（血管周围肿瘤细胞围绕血管翻腾，血管明显由内皮细胞排列，其间点缀着坏死区，图5▶)在原发性人类葡萄膜黑色素瘤的组织样本中。葡萄膜黑色素瘤内很少出现明显的大面积坏死区。41此外，尽管Kvanta等人57检测VEGF mRNA就地在视网膜母细胞瘤内进行杂交，在后葡萄膜黑色素瘤中无法进行杂交。Peer等人60,61在研究眼内血管生成的经典示例（如缺血性视网膜中央静脉阻塞）时，使用葡萄膜黑色素瘤作为mRNA VEGF表达的阴性对照。

PAS阳性血管通道的互连通道特征与预期的肿瘤血管生成的组织学特征明显不同。此外，葡萄膜痣和黑色素瘤中原有的正常脉络膜血管的合并33（图1）▶与Holash等人6其中，肿瘤中原有的正常血管被包含，导致血管破坏、显著坏死和肿瘤周边血管生成。

根据这些观察结果，重新检查了葡萄膜黑色素瘤中PAS阳性通道的组织学和超微结构。发现PAS阳性模式的通道由黑色素瘤细胞排列在外部（图4）▶但在光镜和透射电镜下缺乏内皮细胞的内层。7内皮细胞排列在预先存在的葡萄膜血管内腔中，这些内腔与痣中发现的相同类型的肿瘤结合在一起50存在于含有PAS阳性模式通道的同一节段中。

需要强调的是，一层细胞外基质（对应于PAS阳性通道衬里）将血柱与肿瘤细胞分离。因此，红细胞似乎包含在细胞外基质管内。肿瘤细胞紧贴在管的外表面。因此，葡萄膜黑色素瘤中PAS阳性的血管通道与Lugassy等人所描述的“血管肿瘤复合物”不同62血管内部的内皮细胞被层粘连蛋白从黑色素瘤细胞中分离出来（Lugassy等人63进一步提出黑色素瘤细胞沿着内皮细胞系血管的基底表面迁移，他们称之为“血管外迁移转移”。

用传统的内皮细胞标记物（包括因子VIII相关抗原、，乌莱克斯、CD31、CD34和KDR（血管内皮生长因子的flk受体）。7虽然肿瘤附近富含血管的脉络膜中的内皮细胞用这些标记物染色很好，但在含有相互连接的PAS阳性模式的肿瘤中，染色很有限，例如环、网络和交叉连接的平行血管通道（图6）▶在高倍镜下，用假定的内皮细胞标记物对这些模式进行离散标记，但仔细检查这些标记点表明，内腔内容物（而非血管壁）被染色，通常是不连续的。7在某些区域，标记因通道管腔内存在红细胞而中断（图6）▶.

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图6。

用推测的内皮细胞标记物对原发性葡萄膜黑色素瘤进行免疫组织化学染色。答：因子VIII相关抗原染色正常脉络膜血管（肿瘤块左侧），但不染色肿瘤内部。B类：相同的肿瘤A类改良PAS染色，无苏木精复染。肿瘤内发现了血管生成拟态模式。抄送：原发性葡萄膜黑色素瘤乌莱克斯 欧洲的凝集素I。注意含有红细胞的血管通道的间歇性染色。红细胞（血浆）之间的物质被乌莱克斯凝集素。用苏木精对切片进行复染，尽管显示了通道的长段，但未发现内皮细胞核。鉴别原发性葡萄膜黑色素瘤中正常血管内皮细胞核并不困难（图1）▶.医生：血管生成拟态模式附近的肿瘤细胞CD31染色（未图示）。原始放大倍数：A类和B类，比例尺，200μm；C类和天，比例尺，10μm。答：因子VIII相关抗原血红素；B类：无苏木精复染的PAS；抄送： 乌莱克斯 欧洲的凝集素I与苏木精复染；医生：CD31用苏木精复染。

内皮细胞明显存在于肿瘤内的正常血管中，但不存在于PAS勾画的吻合血管通道中，这一观察结果是如何解释的？有人可能会争辩说，相互连接的PAS阳性模式代表了血管新生的退化：内皮细胞受到攻击，被破坏，并留下基底层。如果这是正确的，那么PAS阳性模式的基底层应该类似于血管生成性血管的基底层轮廓，如视网膜母细胞瘤中所示。然而，从拓扑结构的有利角度来看，PAS阳性模式似乎并不具有血管性。事实上，有人可能会问以下问题：如果高度侵袭性肿瘤通常会破坏宿主组织，那么是什么机制允许脆弱内皮细胞芽的热带生长在这些肿瘤中渗透并存活？33

这些问题促使我们探索一种假说，即葡萄膜黑色素瘤中PAS阳性的血管改变模式是通过血管生成以外的机制形成的。

体外试验观察：在内皮细胞缺失的情况下，侵袭性葡萄膜黑色素瘤细胞能够通过血管生成模拟生成有图案的血管通道

丹尼尔斯等人64和Hendrix等人65,66建立了葡萄膜原发性和转移性黑色素瘤细胞系，以探讨侵袭性肿瘤细胞表型与葡萄膜黑色素瘤中具有预测意义的模式生成之间的关系。研究发现，侵袭性葡萄膜黑色素瘤细胞（但非侵袭性细胞）产生VI型胶原，该胶原被认为有助于这些模式的组织发生。64亨德里克斯等人65描述了间充质（波形蛋白）和上皮（角蛋白8,18）中间丝的共同表达与葡萄膜黑色素瘤细胞侵袭行为之间的关系，发现这种相互转化的表型特异性地表达了c-遇见原癌基因允许侵袭性黑色素瘤细胞对其配体肝细胞生长因子/分散因子（HGF/SF）作出反应。66共表达波形蛋白和角蛋白8，18中间丝的侵袭性黑色素瘤细胞之间的关系特别有趣，因为这些细胞通常沿着传导红细胞的微血管通道的外壁排列，而红细胞似乎没有内皮细胞排列（图7A）▶该观察结果进一步表明，相互转化的侵袭性黑色素瘤细胞表型至少在维持葡萄膜黑色素瘤PAS阳性微循环模式方面发挥了作用。

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图7。

原发性葡萄膜黑色素瘤中细胞角蛋白的表达和血管生成拟态。答：原发性葡萄膜黑色素瘤的组织切片。含有红细胞的通道由纺锤形黑色素瘤细胞排列在外面，这些细胞对泛细胞角蛋白染色呈阳性。注意沿内管壁缺乏内皮细胞。B类–电子邮箱：，转移性葡萄膜黑色素瘤细胞系MUM2B的组织培养。B类：相位对比显示环形物包围着一小群上皮样黑色素瘤细胞。抄送：中所示的相同字段B类用荧光照相。培养物已被角蛋白8、18抗体染色。注意角蛋白阳性肿瘤细胞沿着形成的环状排列在体外.医生：另一种侵袭性黑色素瘤培养物的相位对比显示两个平行的直通道。电子邮箱：中所示的相同字段天用荧光照相。培养物已被角蛋白8、18抗体染色。注意角蛋白阳性肿瘤细胞沿着直通道排列，类似于组织切片中的情况(A类)。原始放大倍数：A、，比例尺，10μm；B类–E类，标尺，5μm；答：苏木精复染全细胞角蛋白；B类和医生：相位对比；C类和电子邮箱：荧光（用角蛋白抗体8、18标记的培养物）。

Maniotis等人7报道了一项意想不到的发现，高度侵袭性和相互转化的原发性和转移性葡萄膜黑色素瘤细胞系产生了脱细胞通道在体外（在Matrigel或I型胶原的三维培养中），不含内皮细胞或成纤维细胞，不添加可溶性生长因子，如bFGF、TGF-β、VEGF、PDGF。因此，高度侵袭性的原发性和转移性肿瘤细胞在体外重组的通道与转移性黑色素瘤死亡高危患者组织样本的组织学模式相互连接。相比之下，在与侵袭性细胞系相同的培养条件下，即使在缺氧诱导后，侵袭性较差且未相互转化的葡萄膜黑色素瘤细胞（表达波形蛋白但不共同表达角蛋白8,18的细胞）也无法生成通道，以及添加来自侵袭性葡萄膜黑色素瘤细胞系的条件培养基和可溶性生长因子。此外，表达角蛋白8、18和波形蛋白的高度侵袭性和转移性黑色素瘤细胞经常在血管通道壁外排列（图7，B–E）▶.

Maniotis等人7也证明侵袭性葡萄膜黑色素瘤细胞产生的模式化通道在体外能够在短距离内传导染料。他们进一步证明了在体外环状通道和全身注射吲哚青绿染料后患者肿瘤中血管造影显示的通道。52,53

高侵袭性和转移性黑色素瘤细胞系生成有图案的血管通道的差异能力（与低侵袭性黑色素癌细胞系相比）为在人类黑色素瘤组织切片中使用这些图案作为肿瘤进展的标志提供了生物学基础（表1）▶此外，在没有内皮细胞的情况下，黑色素瘤细胞产生了这些无细胞模式的通道，这为没有内皮细胞衬里的黑色素瘤中有模式的、基质衬里的血管通道的组织学外观提供了解释。

皮肤黑色素瘤

尽管葡萄膜黑色素瘤提供了一种有趣的人类癌症模型，用于研究癌症的纯血源性传播、器官靶向转移以及宿主对免疫优势部位肿瘤的反应，但葡萄膜黑素瘤被认为是罕见的肿瘤。皮肤黑色素瘤的发病率正在增加，相比之下，皮肤黑色素癌是一个重大的公共卫生问题。

Busam等人67原发性皮肤黑色素瘤UEA-1、CD34和CD31的染色组织学切片未能证明微血管计数与预后之间的任何关联。在这项研究的过程中，这些研究人员寻找了葡萄膜黑色素瘤的微循环模式，10但没有使用这些标记来识别它们。回顾过去，Busam等人67用PAS染色与血管通道相关的基质，在组织切片上显示出葡萄膜黑色素瘤的微循环模式。如果皮肤和葡萄膜黑色素瘤中出现血管生成拟态，则内皮细胞的传统标记物可能无法识别血管生成拟状模式。

在原发性皮肤黑色素瘤的垂直生长期可以显示环状和网状结构（图8）▶皮肤黑色素瘤转移瘤7,68使用PAS染色，无苏木精复染。与葡萄膜黑色素瘤一样，在这些没有内皮细胞排列的通道中可以识别出红细胞柱。

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图8。

原发性皮肤黑色素瘤，垂直生长期。网络非常丰富。原始放大倍数：比例尺，200μm。无苏木精复染的PAS（组织切片由T.K.Das Gupta教授提供）。

PAS模式的识别不仅限于组织学观察。Maniotis等人7也证明了转移性皮肤黑色素瘤细胞系在与高侵袭性原发性和转移性葡萄膜黑色素瘤的细胞系相同的条件下产生有图案的血管通道。因此，血管生成拟态现象不仅限于罕见的葡萄膜黑色素瘤，而且两者都出现在体外和体内在皮肤黑色素瘤中。检测皮肤黑色素瘤组织切片中循环血管生成拟态模式的预后意义目前正在研究中。

微血管计数与血管生成模拟

如上所述，一些调查人员67,69-72目前尚无法建立传统定义的肿瘤血管（内皮细胞组织化学标记物显示微血管）与皮肤黑色素瘤预后之间的关系。另一方面，一些调查人员73,74报告皮肤黑色素瘤高“血管”与预后之间的关系，而Ilmonen等人75,76最近有报道称高血管密度与良好的预后相关。

同样，对葡萄膜黑色素瘤中微血管计数的价值也存在着重大分歧。Lane等人77未能证明微血管密度与葡萄膜黑色素瘤预后之间的关系，而Foss等人44、55和Makitie等人78证明了一种关系。后者警告说，微血管密度可能只是相对血管化的“粗略测量”，而不是血管的确切数量，并为此提出了几个理由：1）一些微血管没有内皮细胞标记物染色（因此低估了存在的血管数量）；2）除内皮细胞外的其他细胞类型可能会标记这些标记物。

黑色素瘤中血管生成拟态的发现不仅证实了Makitie等人的担忧78但是，用假定的内皮细胞标记物染色的计数结构作为血管形成的测量手段的有效性也提出了额外的问题。当肿瘤（如黑色素瘤）中存在血管生成拟态时，则先前存在的正常血管10,51其中含有内皮细胞的细胞将被内皮细胞标记物标记，这使得很难将“血管密度”与“血管生成”（即从原有血管中生成新血管）等同起来。此外，肿瘤细胞在血管生成拟态中生成的通道可能不会被各种内皮细胞标记物染色（因为这些通道中不存在内皮细胞），或者通道可能会以不连续的方式染色，因为管腔的内容物被这些标记物染色，被认为是内皮细胞特异性的；7血管生成拟态通道的不连续染色可能导致一个血管结构的过度计数（图6和9）▶ ▶最后，肿瘤细胞自身可能会染色以获得内皮细胞标记物（图6）▶.7如果研究人员使用染色的载玻片来显影假定内皮细胞标记物的色素，而没有进行反染色来识别标记的结构，那么计算每个标记点可能无法准确反映肿瘤中内皮细胞系血管的数量。

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图9。

血管生成模拟模式的灌注可以在组织学上模拟血管生成的外观。答：原发性葡萄膜黑色素瘤：平行血管生成模拟通道灌注。这与图4B中所示的字段相同▶。在这里，通道张开并包含红细胞的区域以高亮显示箭头因为血柱本身被多种假定的内皮细胞标记物染色，如因子VIII相关抗原（图6A）▶和乌莱克斯（图6）▶以及CD31、CD34和KDR，7如果组织切片没有用苏木精复染，并且人们不适应切片中连续的血管生成拟态模式的存在。B类和抄送：CD34与PAS阳性环路和网络的协同放大。原发性葡萄膜黑色素瘤的组织切片含有多个环和网状物，用CD34（德克萨斯红染色剂）染色，随后用PAS进行复染，但不进行苏木精复染。通过捕捉直接照明通道（PAS阳性模式）和罗丹明通道（德克萨斯红），对组织切片进行Bio-Rad MRC-600激光扫描共聚焦显微镜（马萨诸塞州剑桥市Bio-Rad）拍摄。B类：背靠背环路形成网络。抄送：中所示的相同字段B类显示CD34（红色）通过染色管腔内容物而非内皮细胞共同定位于环。病理学家只看CD34染色(C类)可能会错误地得出结论，这是一个血管生成热点。原始放大倍数：A类–C类，标尺，50μm；A类苏木精-伊红；B类CD34和无苏木精复染的周期性酸盐（直接照射）；C类，CD34和周期性酸-Schiff，罗丹明通道。

许多技术因素有助于病理学家将微血管计数应用于预后的准确性，包括采样方法和显示微血管的标志物的选择。79-81,81尽管在许多类型的癌症中，微血管计数被广泛用作肿瘤进展的标志物，81有相当多的报告表明血管计数与预后无关67,69-72,77,82-107甚至一项研究表明，血管数量增加与生存时间延长而非缩短有关。96除黑色素瘤外，其他肿瘤类型中血管生成拟态的存在可能会导致血管计数与预后之间的关系尚未确定的报道。

动物和人类肿瘤中的非内皮细胞血管通道

其他108-110暗示了黑色素瘤和其他肿瘤中可能存在非内皮细胞系通道。延森108描述了由肿瘤细胞而非内皮细胞排列在布鲁赫膜破裂处的黑色素瘤部分的大窦。拉多特和安塔尔109在葡萄膜黑色素瘤中发现了内皮内衬的小血管（Folberg等人，9在早期研究中），但他们也描述了没有内皮内衬的血管通道。Hammersen等人111在黑色素瘤动物模型中发现了排列在血管通道内部的细胞，这表明通过透射电镜或免疫组织化学染色很难准确识别这些细胞。这些作者认为间充质细胞和肿瘤细胞可能会并入肿瘤血管。

Konerding等人110描述了黑色素瘤和肉瘤异种移植物中肿瘤细胞排列的窦状体，它们与正常血管明显不同。Konerding等人110此外，在肿瘤内部观察到的这些异常肿瘤细胞系血管多于正常内皮细胞系血管。Konerding等人提供的扫描电子显微照片110肉瘤中没有内皮层衬里的扁平、钩状血管通道与Rummelt等人对人类葡萄膜黑色素瘤微循环的三维重建惊人地相似51

沃伦和舒比克112从他们那里建议体内通过对动物体内肿瘤植入物血管化的观察发现，肿瘤附近出现了内皮向性，血液在肿瘤细胞的松散索之间流动，这一点通过透射电镜进行了确认。沃伦和舒比克描述的现象112与血管生成拟态的不同之处在于三个关键方面：1）观察到毛细血管萌芽进入肿瘤（血管生成），肿瘤细胞之间有红细胞渗漏（很少有红细胞从具有血管形成拟态特征的基质内衬管中渗漏）；2） 微循环中观察到微血栓（奇怪的是，在血管生成拟态的模式化通道中很少观察到微栓，导致推测肿瘤细胞或血管通道的基质干扰止血）；3）中央坏死是已建立的动物肿瘤的特征：中央坏死不是包含血管生成拟态模式的肿瘤的典型特征。7

Nasu等人113植入0.1毫米三雌性Fisher大鼠体内大鼠乳腺癌13762块进入透明石英室。移植后26天，当肿瘤平均直径为6毫米时，他们记录了肿瘤内的血流。通过视频显微镜，他们观察到这些植入物中形成网络的背对背环。这些植入物的组织学检查显示，与肿瘤周围组织中相关的纤维结缔组织相比，几乎没有证据表明肿瘤内血管结构附近存在纤维组织。此外，这些研究人员证实肿瘤周围间质中内皮细胞中的因子VIII相关抗原染色均匀，但在肿瘤内分布不均匀。他们进一步观察到肿瘤内的血管含有“极其罕见的内皮细胞”。有趣的是，他们没有观察到新血管的萌芽，而是描述了肿瘤细胞之间形成环路的“原始”血液流动。这一有趣的观察结果与血管生成拟态在两个关键方面不同：1）在血管生成拟态中，一层厚度可变的PAS阳性物质将血柱与肿瘤细胞分离（红细胞在PAS阳性物质形成的通道内流动，如在体外肿瘤细胞重建这些去细胞通道），而不是血液直接接触肿瘤细胞；和2）血管生成拟态需要放松管制的高度侵袭性肿瘤细胞积极参与形成模式化的非内皮细胞系血管通道，而Nasu等人113将非内皮细胞系血管通道的形成归因于血流动力学对肿瘤的被动雕刻。因此，血管生成拟态与侵袭性肿瘤细胞表型有关；在Nasu等人描述的系统中，113目前尚不清楚肿瘤在建立循环方面是否发挥任何积极作用。

血管生成模拟与血管生成：细胞间隔化问题

在Maniotis等人发现之前7一些病理学家认为PAS阳性的无细胞血管通道是由肿瘤细胞形成的，Folberg等人10如一些人用来描述这些模式的术语所暗示的，是对肿瘤存在的基质反应：“纤维血管环。”38,44,45Foss等人45结论是Folberg等人10主要由结缔组织形成，包括血管周围结缔组织在体外Maniotis等人的研究7不支持这些结论：葡萄膜黑色素瘤的模式化肿瘤微循环不仅是由侵袭性肿瘤细胞自身生成的，这些模式是在缺乏成纤维细胞、其他基质细胞和内皮细胞的情况下形成的。7

葡萄膜黑色素瘤是独特的，因为在肿瘤和周围宿主基质之间的界面上通常不会诱导基质宿主反应（图6）▶此外，基质内长（纤维血管结缔组织间质）在大多数葡萄膜黑色素瘤扩张的细胞室中很少见到，除非肿瘤之前已经接受过放射治疗或坏死。然而，葡萄膜黑色素瘤可能不是唯一的：Birck等人114在大多数原发性皮肤黑色素瘤患者中，未能在扩张的肿瘤块内显示CD31阳性血管。

在研究可移植小鼠乳腺癌时，Thompson等人33注意到邻近结缔组织中的血管数量多于肿瘤本身。在研究人类乳腺癌时，de Jong等人115注意到肿瘤内的血管密度低于基质内的血管密度。这些作者利用这一观察结果提醒与微血管密度相关的病理学家注意，他们的观察结果是来自肿瘤的细胞部分还是基质。在前列腺癌中，Bigler等人116也显示肿瘤内的血管增加，但增加的血管仅限于基质。

这些观察结果表明，肿瘤的血管生成反应可能是肿瘤间质室的组成部分，而不是肿瘤细胞室。事实上，在最初描述肿瘤血管计数是乳腺癌预后的标志时，Weidner等人46图示肿瘤间质室中与肿瘤细胞团相邻的血管。Brown等人，117最近观察到，世卫组织将肿瘤基质比作愈合的伤口118乳腺癌中富含血管基质的形成先于浸润，这表明乳腺癌浸润到由肿瘤诱导的富含血管基质中。有趣的是，可以推测，侵袭性更强的肿瘤会诱导更强的基质反应，基质反应的强度是组织切片中微血管计数与预后相关的基础。沿着类似的思路，有人可能会认为针对血管生成的治疗预期会干扰或减少对肿瘤细胞成分的基质反应，而不是直接影响肿瘤的细胞隔室。

将黑色素瘤中的血管生成拟态作为独立于血管生成的事件进行鉴定表明，不同的肿瘤类型可能通过不同的机制获得其血液供应。葡萄膜黑色素瘤可能位于光谱的一端。在肿瘤生长的最早阶段，葡萄膜黑素细胞肿瘤合并了预先存在的血管，而不会破坏它们，不会引起中心坏死，也不会在肿瘤周围诱导血管生成（不像Holash等人6)。相对惰性的葡萄膜黑色素瘤没有显示出血管生成拟态的证据，但侵袭性肿瘤会形成由肿瘤细胞自身生成的脱细胞血管通道组成的灌注微循环，这通常会阻止坏死，即使在相对较大的肿瘤中也是如此。侵袭性肿瘤细胞产生的血管通道连接到肿瘤中已有的血管50或涡流静脉的眼静脉引流（图10）▶.36血管生成可能伴随着局部坏死区，在放射治疗后可能会出现，但在为肿瘤提供微循环方面并没有发挥重要作用。

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图10。

血管生成拟态的示意图。葡萄膜黑色素瘤生长在缺乏淋巴管的环境中。侵袭性肿瘤（但非非侵袭性肿瘤）形成由PAS阳性物质分隔的环状非内皮细胞系通道。这些血管生成拟态通道直接与脉络膜毛细血管中的正常血管、涡旋静脉或纳入肿瘤的正常血管相连，而没有血管生成的证据。肿瘤细胞生成的通道（血管生成拟态）由肿瘤细胞排列在外部，而血管由内皮细胞排列在内部。图由Dawn Kirschmann博士提供。

皮肤黑色素瘤中也存在血管生成拟态，除了溃疡或坏死区附近外，在这些肿瘤扩张的细胞室中很少见到血管生成。然而，真皮中的血管化是皮肤黑色素瘤退化反应的一个已知组成部分。119血管生成拟态对细胞室的分区和血管生成（通常对基质反应）可能是皮肤黑色素瘤血管计数与预后相关的变异性的原因。

Maniotis等人7表明血管生成拟态模式形成在体外在没有血液动力学力的情况下，表明形成模式化的非内皮细胞微循环可能是肿瘤细胞的一种属性。Warren和Shubik在实验中使用的肿瘤植入物的表型特性112和Nasu等人113没有描述。如果这些实验中使用的动物肿瘤碎片包含血管生成拟态模式，则可能是来自穿透肿瘤的毛细血管芽的血液流动围绕肿瘤细胞重塑产生的组织平面进行切割，或是流入肿瘤的血液与血管生成拟模通道相连。

在光谱的另一端，可能有肿瘤产生显著的基质血管（血管生成）反应，但不包括血管生成拟态。在不同类型肿瘤的血管生成基质反应和非血管生成机制的各种贡献被确定之前，病理学家可能希望在建立和依赖肿瘤“血管性”的传统标志物作为预后标志物时谨慎行事，那些正在开发以血管生成为靶点的抗癌疗法的人可能希望在解释其结果时谨慎行事。111

动物模型的其他观察结果

异种移植物的微循环可能因宿主和肿瘤本身而异。Lauk等人120注意到在人类肿瘤的异种移植中，细胞分布和分化特征得以保留，但移植的血管密度具有宿主特异性。Wilson等人121告诫说，前列腺癌不同细胞系之间的微循环组织不同，这意味着每个肿瘤可能对微血管发育模式产生“独特的影响”。

血管生成拟态作为独立于血管生成的肿瘤血供机制的鉴定7同时也提出了各种癌症动物模型与人类模型的相关性问题。例如，在皮肤黑色素瘤的动物模型中可能可以识别血管生成拟态。Potgens等人122比较了血管通透性因子（VPF或VEGF）表达水平低和高的人类黑色素瘤细胞系异种移植的形成。由低VPF表达的细胞系形成的肿瘤的特征是不同大小的血管形成血管，这些血管具有交替的活性区和坏死区。相比之下，从VPF转染的黑色素瘤细胞系发展而来的肿瘤的特征是肿瘤细胞结节周围的血管化。奇怪的是，VPF高表达和低表达的两种细胞系都通过吻合基质的背对背环，将肿瘤区域组织成小叶，这些基质在活肿瘤周围区域的层粘连蛋白染色呈阳性。这些层粘连蛋白阳性网络在外观上与葡萄膜和皮肤黑色素瘤的PAS阳性模式相同，但没有用小鼠内皮细胞标记物进行鉴定。

Potgens等人123进一步研究了该系统。他们不仅在功能性血管管腔内，而且在黑色素瘤异种移植物内的模式化（环状）“基质间隔”内发现了示踪物质，“似乎包含连接血管的通道”他们进一步观察到，这些含有示踪剂的环状通道仅部分与内皮细胞的假定标记物共存。从这些研究中还不知道Potgens等人122,123假设内皮细胞的存在是因为内皮细胞标记物的染色，或者如果他们通过其他方法证实内皮细胞的出现（正如我们所证明的，许多内皮细胞标记标记血管生成拟态通道的管腔内容物).Erhard等人的一份报告中发现了血管生成拟态的其他提示性证据124描述皮肤黑色素瘤的小叶被IV型胶原和硫酸肝素蛋白多糖阳性的隔膜分隔：内皮细胞标记物PAL-E的染色显示病变基底部血管新生血管明显染色，但隔膜内只有零星染色。

大多数葡萄膜黑色素瘤动物模型是用细胞系的异种移植物移植到免疫抑制动物身上建立的，结果不一致。格罗斯尼克劳斯125报道了通过将小鼠皮肤黑色素瘤细胞系植入小鼠眼睛而产生的黑色素瘤动物模型中PAS阳性环状模式的发展。最近的证据表明，将人类葡萄膜黑色素瘤细胞异位注射到免疫抑制小鼠的皮下区域会导致肿胀，并伴有明显的中央坏死，有明显的血管生成证据（尤其是在坏死区附近和邻近真皮中），且无环纹（图11）▶与血管生成拟态相关（M.J.C.Hendrix、A.J.Maniotis和R.Folberg，未发表数据）。如上所述，在与血管生成相关的原发性人类葡萄膜黑色素瘤中，很少发现大面积坏死区（图1）▶然而，必须谨慎解释这些数据，因为它们来自动物模型中的异位部位。显然，Killion等人126强调需要使用原位动物移植模型来研究治疗药物的效果。

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图11。

葡萄膜黑色素瘤细胞系皮下植入免疫抑制小鼠的动物模型。答：扫描放大倍数。皮下注射侵袭性葡萄膜黑色素瘤细胞后，在底部形成了一个9毫米的肿瘤。注意中央坏死的存在，这不是原发性葡萄膜黑色素瘤的典型特征（与图1B所示的原发性葡萄膜黑色素癌相比▶直径也为9 mm）。B类：活肿瘤和坏死之间的界面放大倍率更高。坏死区域（显微照片的下部）附近出现扩张的内皮细胞样血管。抄送：血管放大倍率较高，如图所示B类这些血管由内皮细胞排列。原始放大倍数：A类，比例尺，1 mm；B类，标尺，50μm；C类，比例尺，50μm。A类–C类苏木精-伊红。

不同动物模型微循环的差异可能有助于解释动物模型对抗血管生成治疗的不同反应。例如，抗血管生成化合物能够在Lewis肺癌的异种移植模型中诱导长期休眠。127相比之下，在小鼠模型中，四种抗血管生成化合物都没有完全阻止转基因诱导的（原发性）胰腺癌的生长。128自相矛盾的是，在这个转基因模型中，用细胞抑制性抗血管生成化合物处理的内皮细胞诱导凋亡并不奇怪，但有趣的是，与毛细血管紧密相连的肿瘤细胞也经常发生凋亡。有人可能会预料到相反的情况：血管系统受损导致的缺氧和营养剥夺将优先影响毛细血管最远端的缺氧肿瘤细胞。目前尚不清楚血管抑制素等抗血管生成化合物是否129和内皮抑素130抑制血管生成拟态-由侵袭性肿瘤细胞产生的无细胞血管通道，不受内皮细胞的参与。

事实上，有许多变量会影响动物模型中肿瘤微循环的特征：原位与异位注射、动物宿主的性质、肿瘤类型以及是否存在血管生成拟态与血管生成。因此，在得出关于抗血管生成化合物的功效或缺乏功效的结论之前，必须确保动物模型准确地代表人体对应物的微循环。

诊断成像

血管生成拟态产生一种肿瘤微循环，这种微循环在成年人中具有独特的模式。此外，假设的生物力学和蛋白水解酶特性负责血管生成模拟物的生成，以不同于正常组织的方式重塑肿瘤细胞隔室。因为血管生成拟态是侵袭性细胞表型的标志在体外通过对人类肿瘤组织样本的回顾性研究，已将其作为肿瘤进展的有力标志，人们关注的焦点是通过血管造影直接成像血管生成模拟模式，或通过专业超声成像肿瘤重塑，以开发无创性活检替代物。由于葡萄膜黑色素瘤和皮肤黑色素瘤的转移沉积物中都存在血管生成拟态，因此检测这种独特模式的微循环提供了检测转移的机会。

血管生成拟态的临床成像研究大多集中于葡萄膜黑色素瘤。注射吲哚青绿染料后几秒钟内，就可以使用激光扫描共焦检眼镜设备检测黑色素瘤内的环路和网络。52,131

Mueller等人53初步数据表明，该技术在临床上的成像模式反映了具有预后意义的组织学血管生成拟态模式。在眼球摘除术前，对两例脉络膜黑色素瘤患者全身注射吲哚青绿后进行共焦激光扫描眼底镜检查。本研究中使用的激光扫描共焦检眼镜，即海德堡视网膜血管造影（德国海德堡海德堡工程公司），能够对小至10-15μm的视网膜血管成像（W.Freeman，个人通讯）。其中一名患者的血管造影显示了背对背的环网，而另一名患者血管造影仅显示了正常脉络膜循环典型的大而直的血管。通过特殊的解剖技术（通过平面部冠状切口切除眼前节）打开双眼，以便病理学家直接看到肿瘤。132血管造影显示的视网膜血管模式在这两种肿瘤中都得到了识别。通过匹配上覆视网膜血管的分叉模式，肿瘤在一个与血管造影上包含网络或正常脉络膜血管的区域精确对应的平面上进行切片。组织切片用苏木精-伊红染色和周期性酸-希夫染色，无苏木精复染。在血管造影上肿瘤内包含网络的眼睛在组织学上也包含PAS阳性网络，但没有证据表明肿瘤切面上的血管生成与血管造影相对应；7,53仅包含正常脉络膜血管的肿瘤在血管造影上仅包含组织学上大的脉络膜血管，没有PAS阳性网络或血管生成的证据。

根据血管造影和组织学之间对应关系的初步描述，Servetopoulou等人133采用不同的血管造影技术对35例脉络膜黑色素瘤患者进行了研究。他们通过激光扫描共聚焦眼底镜和吲哚青绿研究了15只眼中的14只眼，并通过数字荧光素血管造影研究了8只眼中7只眼的血管造影相关性。传统的血管造影提供了一个不太准确的相关性：26例患者中只有11例出现血管造影-统计学相关性。这些发现表明，所使用的血管造影方法可能在建立血管造影-影像学相关性方面很重要。54Mueller等人精心进行的相关研究53和Servetopoulou等人133提示有可能对脉络膜黑色素瘤内的微循环模式进行成像，从而精确地对应具有预后意义的组织学模式。

还可以通过超声参数频谱分析来利用肿瘤内产生环状血管生成拟态模式的生物力学重塑的后果。这项专门技术分析从组织区域返回的数字记录回波，这些区域提供了与声阻抗小空间波动相关的统计测量。1341990年，科尔曼等人135最初尝试使用这种技术来成像葡萄膜黑色素瘤中的细胞类型（含有上皮样细胞的葡萄膜黑素瘤的预后比那些缺乏这些细胞的肿瘤差）。他们后来承认，超声参数谱分析无法对单个细胞进行成像，并预测用这项技术检测到的模式“与肿瘤微区有关，如细胞的血管间巢，而不是与单个细胞的大小直接相关。”135第二年，科尔曼等人136结果表明，参数谱分析检测到的细胞分布模式与葡萄膜黑色素瘤患者的预后相关。

声散射体大小与血管生成模拟模式勾勒出的肿瘤微区大小之间的对应关系表明，超声功率谱分析可能能够识别组织中的这些模式。在眼球摘除前获得超声图像的前瞻性研究表明，超声功率谱分析与血管生成模拟回路和网络的组织学存在之间有很好的对应关系。137,138

其他研究正在进行中，以确定是否有可能对其他原发性肿瘤及其转移瘤的血管生成拟态模式进行成像，以便进行无创性预测。

靶向血管生成模拟物的治疗方法

Maniotis等人7还报道了利用cDNA微阵列杂交技术在同一肿瘤衍生的低侵袭性和高侵袭性葡萄膜黑色素瘤之间的多个基因的有趣差异表达。大约210个已知基因得到了差异表达。The overexpression of the接头-1侵袭性黑色素瘤细胞中的基因很有趣，因为接头-1迄今为止，这种表达与内皮细胞形成和维持血管有关。139Easty等人140之前报告的接头-1皮肤黑色素瘤的表达和转移表型。然而，Maniotis等人7还发现上皮细胞激酶和角蛋白8中间丝的基因也过度表达，表明存在共同的上皮样基因型表达。最后，这些角蛋白和波形蛋白阳性的黑色素瘤细胞也过度表达了VI型胶原蛋白基因（证实了早期的观察，侵袭性葡萄膜黑色素瘤会产生这种细胞外基质成分64)与间充质表型一致。因此，cDNA微阵列分析表明，高度侵袭性黑色素瘤细胞可将基因逆转为多能胚胎样基因型。

很有意思的是，靶向与侵袭性肿瘤细胞表型相关的一个或多个基因可能为治疗干预提供一种途径。例如，Bissell8表明接头-1侵袭性黑色素瘤细胞可能为血管生成和血管生成拟态提供共同靶点。重要的是在细胞系之间进行额外的比较，以确定差异基因表达谱是否始终区分侵袭性差和侵袭性高的细胞系，或者如果由于基因表达的普遍放松，侵袭性肿瘤细胞系显示出基因差异基因表达不一致的证据。此外，有必要确定差异基因表达是否反映在基因产物的相应过度表达中。

基质的收缩和重塑与许多类型细胞产生索状和管状结构的能力有关在体外.2014年Maniotis等人7证明高度侵袭性和转移性葡萄膜黑色素瘤细胞收缩浮动胶原凝胶在体外通过干扰肌动蛋白微丝在整个肿瘤细胞中传递力的能力，有可能用1μmol/L细胞松弛素D可逆地阻断基质的收缩。葡萄球菌黑色素瘤细胞系已被证明分泌胶溶性金属蛋白酶，2014年有证据表明金属蛋白酶-2的表达与葡萄膜黑色素瘤的转移有关。145

目前还没有已知的血管生成拟态的生理类似物。事实上，胎盘组织中细胞滋养层细胞产生的血管通道146-148可能代表人类最后一次正常的血管生成事件。由于血管生成和血管生成拟态在成熟儿童或成人的生理学上并不发生，因此有可能针对负责血管生成拟状的生成和维持的分子机制，并将对正常生理过程的影响降至最低。

证据中添加的注释：最近我们注意到，Schneider等人使用激光扫描共聚焦眼底镜和吲哚青绿对11例葡萄膜炎黑色素瘤患者进行了血管造影检查，并随后摘除了他们的眼睛；所有11名患者的组织学检查均发现PAS阳性网络（Schneider U、Sobottka B、Inhoffen W、Kreissig I：Mikrovaskularisations集合恶性肿瘤Melanome der Aderhaut：Vergleich von indozyaningrün血管造影术与组织病理学Befund）。眼科杂志1998，95（增刊1）：53（摘要）。此外，米勒等人通过激光扫描共聚焦眼底镜和吲哚青绿血管造影对65例脉络膜黑素细胞瘤患者进行了研究。然后观察肿瘤的生长情况。对具有交叉连接的平行血管、具有分支的弧线、环和网络的血管造影检测均显示出与最终肿瘤生长高度显著相关（Mueller AJ、Schaller UC、MUSIC协作：Die Muenchen/San Diego/Iowa City协作（MUSIC）：Design、Charakterisierung des Kollektives und erste Ergebnisse。眼科学1999，96（增刊1）：15（摘要））。这是第一项前瞻性研究，表明血管生成拟态模式的临床成像具有预测作用。

脚注

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