呼吸链的一个组成部分肿瘤抑制因子cybL介导细胞凋亡诱导

构造的生成

用重组聚合酶链反应对分离的cybL进行修饰（PCR）与具有校对活性的Pwo聚合酶。三十五PCR周期用于扩增线粒体靶向序列亲环素D（残基1-40），并额外应用34个周期将其连接到cybL的N末端。cybL较长的亚型为使用合适的引物通过逆转录PCR从L929 RNA中分离。线粒体靶向序列（残基1-40）扩增自PCR构建的亲环素D。所有构造的正确顺序是通过测序验证。通过融合检测其亚细胞定位具有亲环蛋白D和黄色荧光蛋白的蛋白质，并且被发现是专门定位于线粒体。人类复合体II的基因含黄素蛋白和铁硫蛋白的亚基为用逆转录-PCR分离并对对照进行测序。

标准化文库的建立及cDNA筛选

对肾脏cDNA文库进行了规范化和构建如前所述(格林和莱德，1997). 将等分样品放在琼脂上，发现该文库由～2.5×10组成⁵克隆。百分之七十七克隆包含包含中等长度2kb的插入物。等分将包含单个克隆的菌株接种在96个区块（QIAGEN，德国希尔顿）在900μl LB培养基中培养30小时，转速为300 rpm煽动。如前所述分离质粒(Neudecker和Grimm，2000年)并转染293T细胞。随后，我们进行了目视检查将凋亡细胞的表型作为细胞读数。当一个积极的转染293T细胞后发现克隆，再次转染DNA以验证结果。剩下的DNA被用来转化细菌大规模质粒分离。

细胞凋亡定量

用荧光激活细胞分选（FACS）定量细胞凋亡如前所述的分析(鲍尔等., 1999). 共转染GFP表达质粒用于评估转染效率。凋亡细胞群亚倍体DNA含量归一化为GFP阳性细胞的百分比。每种情况都在至少三个独立的实验中进行了测试。对于不同凋亡诱导剂的细胞凋亡测定(表1)，2.0μg表达质粒（ANT-1和珠蛋白-α结合时为1μg1μg荧光素酶质粒）和0.8μg GFP质粒转染293T细胞，在指定时间收获点。细胞抑制剂用于cybL阴性或重组细胞浓度如下：阿霉素（4μM）、紫杉醇（4μM）、，甲萘醌（40μM）、足叶乙甙（4μM），顺铂（400 nM）和砷三氧化二钠（30μM）。在添加药物。用以下药物处理HeLa和HeLaρ0细胞浓度：阿霉素（20μM）、紫杉醇（40μM）、甲萘二酮（40μM）、足叶乙甙（400μM），顺铂（500μM）和三氧化二砷（10μM）。对于生物凋亡诱导剂的诱导抗Fas受体抗体（100 ng/ml；神谷生物医学，加利福尼亚州千橡园）或TNF（50 ng/ml；普利茅斯BIOMOL研究实验室会议，PA）与干扰素-γ（100 U/ml，BIOMOL研究实验室）。对于复合物I和复合物II活动测量，用三氧化二砷（2μM）处理HeLa细胞，阿霉素（7.5μM）、紫杉醇（4μM）和足叶乙甙（200μM），甲萘醌（12.5μM）、顺铂（200μM）和肿瘤坏死因子（2.5 ng/ml）环己酰亚胺（1.0μg/ml）或抗Fas受体抗体（150ng/ml）和干扰素-γ（150 U/ml）。当细胞凋亡基于在表型改变方面，转染（GFP阳性）和形态凋亡细胞与所有GFP阳性细胞相关因此转染细胞(Li和霍维茨，1997年). 每个细胞中至少有250个细胞独立实验。特异性细胞凋亡计算为凋亡细胞减去对照转染的凋亡细胞百分比单元格(杨等.,1997).

呼吸链复合物的测量

络合物II的活性通过分光光度试验测定(韦奇等.,1992). 为此，将琥珀酸（20 mM）添加到线粒体，被复合物II氧化为富马酸。电子来自该反应用于泛醌依赖性还原二氯苯基靛酚在610nm波长下等时间检测到消光间隔。在该反应中，抗霉素被用作复合物III的抑制剂。琥珀酸脱氢酶（SDH）活性根据既定协议(哈特菲，1978)它使用2,6-二氯吲哚苯酚的还原偶联到以甲基硫酸吩嗪为介质进行琥珀酸氧化。什么时候？细胞色素c（c）被用作电子受体来测量络合物II使用检测琥珀酸依赖性的方案，细胞色素丙二酸敏感性还原c（c）(施密特等.,1992). 通过分光光度法评估络合物I的活性如前所述进行分析(韦奇等., 1992).

活性氧中间体（ROI）的检测

ROI的产生基本上按照李的描述确定et（等）阿尔。(1999)通过使用二氢乙炔（HE）（分子探针，尤金，俄勒冈州）。超氧阴离子是能够将HE氧化为嵌入DNA中的乙锭。简单地说，单元格收获后，用磷酸盐缓冲盐水清洗，并用3.5μM HE 30分钟（5%CO₂)流式细胞仪分析（FACS Calibur；BD生物科学公司，加利福尼亚州圣何塞）。Lucigenin，一种针对超氧阴离子，如前所述使用(Pervaiz和Clement，2002年)将三个转染了所示质粒的10-cm平板合并后。它发光是用光度计检测到的（德国威尔德巴德伯特霍尔德）。在这些条件下，我们没有发现不同的耗氧量作为氧化还原循环人工产生超氧化物的指标荧光素。

免疫印迹法定量检测cybL和细胞凋亡监管机构

将cybL转染到293T细胞后，分离细胞提取物，在SDS-PAGE中分离，并在聚亚乙烯膜（Amersham生物科学，新泽西州皮斯卡塔韦）。用抗血清分析膜对抗cybL（加州大学圣保罗分校Brian Ackrell的礼物旧金山，加利福尼亚州旧金山）。信号用鹰眼扫描（Stratagene，La Jolla，CA），根据转染效率和相比。进行了两次平行试验。HeLa和HeLa中的凋亡调节因子ρ0细胞用抗体免疫印迹法测定细胞色素c（c）（BD PharMinen，加利福尼亚州圣地亚哥）、Smac（BIOMOL Research实验室）、Apaf-1（BIOMOL研究实验室）和caspases-3和caspase-9（均来自加州圣地亚哥CN Bioscience）。

筛选出的几种诱导细胞凋亡的基因产物定位于线粒体

我们观察到，除了凋亡的典型表型外，一些基因产生了不同于所有其他促凋亡因子引起的表型半胱氨酸蛋白酶caspase-2等基因。这些基因导致了细胞质明显收缩，导致小而圆的293T细胞。转染caspase-2的细胞膜起泡明显，它被用作分离促凋亡细胞的第二个标准基因，很少被观察到(图1). 然而，这些基因产生了典型的核间体DNA的切割（我们未发表的数据）。所有基因也都成功了检测其在HeLa细胞中的促凋亡活性。在这种情况下获得了部分cDNA，基因的完整开放阅读框分离并验证其诱导凋亡作用。测序显示这些基因中的大多数编码位于线粒体中的蛋白质细胞器最近被确定为凋亡信号(格林和里德，1998).表1列出了分离的基因及其亚细胞定位、复合物关联和已知功能。它们对293T细胞的促凋亡作用是提供了两个时间点。

在单独的窗口中打开

图1。

caspase-2和caspase-1诱导细胞凋亡的形态学差异以cybL为例，通过筛选分离出几个基因。转染cybL和caspase-2的表达载体（各2μg）变成293T细胞。16小时后拍摄320倍的相位对比照片放大倍数。

从凋亡诱导cDNA中选择基因需要额外的将基因整合到生理或病理中的信息上下文。我们专注于细胞色素b条_L（左）（cybL，也称为QPs-1、SDHC和C_二-3)，一种用作膜的蛋白质呼吸链中复合物II其他组件的锚(Schefler，1998年). 综合体II也是克雷布斯循环的一个组成部分。而不是转移质子，就像呼吸链的其他组成部分一样，它为电子提供能量从克雷布斯循环到呼吸链(萨拉斯特，1999年). cybL是选择作进一步研究，因为细胞色素b条_S公司（cybS）是复合物II的另一种膜成分，也是由屏幕。最重要的是，最近发现了cybS和cybL的突变负责遗传性副神经节瘤(贝索尔等., 2000;尼曼和穆勒，2000年).此外，cybS的染色体区域在许多实体瘤(Koreth公司等.,1999). 因为凋亡敏感性和肿瘤发生经常相反，这些发现表明复合物II可能是细胞凋亡诱导传感器。

cybL表达导致复合物II的短暂抑制活性和活性氧中间体的生产

与我们之前的结果一致，需要特定信号凋亡诱导，我们想建立信号的特异性诱导细胞凋亡。为此，我们转染了呼吸链复合体II转化为293T细胞，并通过以下方法评估细胞死亡FACS分析。图2A发现含黄素蛋白（FAD）和铁硫蛋白构成琥珀酸氧化催化中心的（FeS）没有导致细胞死亡。相反，这两种膜锚定蛋白cybL和cybS能诱导细胞凋亡。免疫印迹分析显示cybL在其内源性蛋白水平上的3.8倍诱导已经足够了仅在16h后诱导细胞凋亡（我们未发表的数据）。

在单独的窗口中打开

图2。

cybL表达产生的促凋亡刺激的特征。（A） 呼吸链复合体II的所有组件测试诱导细胞凋亡。cybL、cybS和FAD的表达质粒将FeS转染293T细胞。26小时后对细胞凋亡进行量化随后通过使用FACS分析。（B） 线粒体对细胞死亡的重要性由cybL诱导。分离的cybL亚型在N端融合到亲环素D质粒线粒体输入信号的编码序列该融合蛋白（MitoS-CybL）的编码，仅导入序列（MitoS）、孤立的cybL（cybL）和更长的拼接形式的cybL*与GFP表达构建物一起转染293T细胞。在开始转染后26 h，用FACS检测细胞凋亡。显示了诱导细胞凋亡的平均值和标准偏差每个构造有三个独立的实验。（C） 的角色cybL.野生型诱导线粒体呼吸链细胞凋亡HeLa细胞和HeLaρ0细胞，其窝藏线粒体线粒体DNA，因此呼吸链有缺陷用控制质粒、cybL表达载体或caspase-2和GFP结构。启动后22小时转染GFP阳性细胞的凋亡程度通过计数形态学上的凋亡细胞。三的平均值和标准差每个构造都给出了独立的结果。（D） cybL的影响呼吸链复合物II活性的表达。十cybL、caspase-2或对照表达质粒的微克数将载体转染到含有293T细胞的10-cm培养皿中。13小时后开始转染后，线粒体被分离出来并形成复合物II呼吸链的活性用琥珀酸进行评估，琥珀酸可降低用光度法测定其浓度的二氯苯基靛酚。对于每次转染，每10秒采集一个数据点。显示的是活性总细胞提取物作为三个独立实验的平均值和SD对于每个构造。（E） cybL表达对as复合物II活性的影响用细胞色素测定c（c）作为电子受体。十八cybL转染293T细胞后小时（有和没有caspase抑制剂zVAD），制备线粒体提取物并测试复合物II活动。这些测量值被归一化为转染效率由共转染GFP表达载体确定。（F） 细胞凋亡诱导由HeLa细胞中的复合II抑制剂TTFA引起。增加的浓度将TTFA加入HeLa细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。

随后，我们想测试cybL是否发挥其促凋亡作用在线粒体中。分离的cybL是一种剪接形式，不含第二个描述了外显子。因此，它缺少部分序列（残基8-26），被提议作为线粒体输入序列(Elbehti-绿色等.,1998). 然而，这种cybL的血凝素标记蛋白发现亚型与线粒体特异性染料Mitotracker（我们未发表的数据）。我们推测过度表达的cybL进入这个细胞器可能是一个限制其促凋亡活性的步骤。因此，我们融合了导入序列亲环素D到cybL的N末端。图2B表明这一点亲环素d日-cybL融合结构和较长的cybL亚型导致凋亡诱导活性与转染293T细胞时cybL亚型变短。我们还看到了类似的HeLa细胞的细胞死亡增加（我们未发表的数据）。

因此，我们将随后的实验重点放在线粒体上，以定义凋亡相关传感器。最突出的功能是线粒体是通过呼吸链产生ATP。我们因此，探讨了利用HeLaρ0诱导细胞凋亡的重要性细胞。这些细胞的线粒体DNA被长时间耗尽与溴化乙锭孵育，因此呼吸系统不活跃链条。图2C说明了这一点cybL不能诱导HeLaρ0细胞凋亡，而caspase-2在亲代细胞和突变细胞系中都很活跃。因为CybL是呼吸链复合体II的一种成分，我们推测这可能会影响该蛋白复合物的催化活性。要测试我们从对照细胞和cybL转染细胞中分离线粒体将琥珀酸用作复合物II活性的特定底物。在本试验中，在转染后13小时，在出现以下任何迹象之前，测量复合物II的活性细胞凋亡明显。此外，转染caspase-2的细胞用于确定对复合物II活性的影响是否针对CybL或诱导凋亡的常见事件。图2D显示cybL转染可以将这种酶活性抑制41%，而转染caspase-2的细胞没有显示减少的复合物II性能。我们还使用了一种测定复合物II活性的方法细胞色素c（c）作为非人工电子受体。这个实验同样，cybL转染后复合物II减少当zVAD，一种泛酶抑制剂被添加到细胞中时保持不变(图2E).

药物噻吩酰三氟丙酮（TTFA），复合物II抑制剂(Suno和Nagaoka，1984年)，是用于支持复合物II的瞬时抑制之间的相关性诱导细胞凋亡。图2楼表明TTFA和cybL一样，几乎可以诱导细胞凋亡40%的HeLa细胞通过DNA降解进行评估。

因为我们关于屏幕的初始假设假设特定促凋亡信号，我们想测试cybL的特异性过度表达抑制呼吸链的复合物II。因此我们转染了cybL并测量复合物I和复合物II的活性。图3，A和B，显示出来cybL表达仅影响复合物II，而复合物I不受影响其功能受到损害。复合物II的酶活性包括氧化琥珀酸盐的SDH反应以及由此产生的电子转化为泛醌（辅酶Q还原酶活性）。我们检测到cybL的表达只降低了复合物II的活性，而琥珀酸脱氢酶反应没有改变(图3、B和C). 它可以因此可以得出结论，铁硫蛋白和含黄素构成SDH活性的蛋白质在结构上保持完整过度表达的cybL解偶联电子向泛醌的转移。A类类似的情况也被描述为cybL突变秀丽隐杆线虫(石井等., 1998;塞努·马苏达等.,2001). 然而，尽管SDH活动在在完整细胞中使用人工电子受体的酶测试电子不能转移到下游元件，SDH也一样未激活。cybL组成性缺陷细胞(奥斯特维恩等.,1995)，我们发现SDH活性和复合物II与用cybL重组的细胞相比，活性降低cybL-GFP融合结构(图3，D和E).

在单独的窗口中打开

图3。

cybL表达对不同配合物活性的影响呼吸链。（A–C）未经处理的293T细胞的相同提取物（Co）或转染有β-gal表达质粒的细胞或对cybL的复合物I活性（A）、复合物II功能进行了研究（B） 和SDH（C）。所示为转染正常化的活动效率和相对于未处理对照的平均值和三个标准偏差独立实验。（D和E）复合物II活性和琥珀酸cybL阴性和阳性细胞中的脱氢酶。（D） 复合物II活性被评估为cybL阴性（cybL–/–）和-重组（cybL-GFP）细胞。（E） 琥珀酸脱氢酶活性在cybL阴性和阳性细胞。显示了与cybL重组细胞作为三个独立实验的手段和SD。

综合设施II的一个区块预计将停止克雷布斯循环，因为以琥珀酸的形式提供复合物II的底物。因此，我们测试cybL表达是否对Krebs浓度有影响循环代谢产物。图4显示了克雷布斯循环的两个组成部分，琥珀酸(图4A)和柠檬酸盐(图4B)，被发现增加。谷氨酸，一种仅间接从克雷布斯循环代谢物α-酮戊二酸不显著上调(图4C). 这个转染细胞上清液中这些代谢产物的浓度没有更改（我们未发布的数据）。

在单独的窗口中打开

图4。

cybL表达对代谢物的影响。The concentrations of293T相同提取物中的琥珀酸（A）、柠檬酸（B）和谷氨酸（C）转染表达质粒后测定细胞β-gal、caspase-2或cybL。所示为归一化为转染效率作为三种独立的方法和标准差实验。

呼吸链的各种复合物暂时受到抑制与ROI的生成有关。在综合体II的情况下半胱氨酸Q_秒^·–被建议成为ROI生产的主要贡献者(McLennan和Degli Esposti，2000). 因此，我们测试了ROI的生成。图5A证明了这一点在产生明显的凋亡之前，cybL导致HE测定的氧自由基。ROI检测也成功地使用超氧阴离子特异性试剂lucigenin（我们未发表的数据）。因为TTFA同样诱导细胞凋亡(图2楼)，调查其是否也会产生ROI。图5B揭示了这一点试剂导致ROI增加，即使在没有迹象6h后可检测到细胞凋亡。确定ROI是否必要对于cybL诱导的细胞死亡，我们共同转染cybL和两种不同的ROI清除酶、铜/锌超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。两种酶可以减少细胞凋亡，过氧化氢酶更有效构造(图5C).

在单独的窗口中打开

图5。

活性氧在cybL诱导细胞凋亡中的作用（A）cybL的表达式生成ROI。用对照转染293T细胞矢量（Luc）或编码CybL的矢量。14小时后测量ROI生成用氢乙硫胺染色，氢乙硫醇被细胞内的超氧自由基。结果以细胞百分比表示与对照转染细胞相比，荧光强度高。三个独立实验的平均值和标准偏差为鉴于。（B） 复合II抑制剂TTFA产生ROI。TTFA是应用于HeLa细胞，并在指定时间检测到ROI形成使用lucigenin进行积分。（C） 过氧化氢酶和超氧化物歧化酶可减少cybL诱导细胞凋亡。共转染cybL表达载体用编码荧光素酶的控制载体或用表达载体超氧化物歧化酶（SOD）或过氧化氢酶（Cat.）的比例为1:1。手段三个独立实验的标准偏差如下通过FACS分析进行量化。

因为TTFA或cybL短暂降低了复合物II的活性转染与细胞凋亡诱导(图2)，我们很感兴趣细胞凋亡诱导试剂是否也会导致这种减少。因此，我们对HeLa细胞施加不同的凋亡刺激在出现任何凋亡诱导迹象之前测量复合物II活性显而易见。图6说明了这一点所有诱导剂都导致复合物II活性降低，而酶促复合物I的活性没有显著变化。

在单独的窗口中打开

图6。

HeLa细胞凋亡后复合物II活性的特异性降低归纳。用指示的凋亡刺激物处理HeLa细胞。在检测到明显的细胞凋亡迹象之前评估复合物I和复合物II（泛醌依赖性DCIP减少）通过分光光度测试分析。显示的是同一单元格中的活动与未处理对照组相关的提取物作为平均值和三种提取物的标准偏差每个试剂的独立实验。

F.Neudecker Voβ高超的技术援助已确认。这项工作得到了巴伐利亚州政府罗氏公司的支持Diagnostics（德国曼海姆）和Xantos Biomedicine（德国慕尼黑）。总经理。由Sonderforschungsbereich 190支持。