内脏。2003年9月；52(9): 1347–1354.
血管内皮生长因子和受体相互作用是小鼠肝纤维化发生的先决条件
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S Kuriyama村
2日本川川县川川医科大学第三内科
D J希克林
三美国纽约州纽约市ImClone Systems Incorporated免疫学系
吴彦祖
三美国纽约州纽约市ImClone Systems Incorporated免疫学系
T Namisaki先生
1日本奈良奈良医科大学第三内科
H Tsujinoue村
1日本奈良，奈良医科大学第三内科
T Masaki公司
2日本川川县川川医科大学第三内科
1日本奈良奈良医科大学第三内科
2日本川川县川川医科大学第三内科
三美国纽约州纽约市ImClone Systems Incorporated免疫学系
摘要
背景：研究表明，在肝纤维化的发展过程中，有效的血管生成因子、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体flt-1（VEGFR-1）和KDR/Flk-1（VEGFR-2）的表达增加。
目的：阐明VEGF及其受体相互作用在肝纤维化发生中的体内作用。
方法：CCl模型4通过特异性中和单克隆抗体（分别为R-1mAb和R-2mAb）评估VEGFR-1和VEGFR-2在诱导性肝纤维化中的作用。用CCl治疗两周后，给予R-1mAb和R-2mAb48周时评估纤维化指标。
结果：在肝纤维化的发展过程中，肝脏VEGF mRNA表达显著增加。R-1mAb和R-2mAb治疗均显著减轻与抑制肝脏新生血管相关的纤维化发展。肝羟脯氨酸和血清纤维化标记物也被抑制。此外，R-1mAb和R-2mAb处理显著抑制了α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞的数量和α1（I）-前胶原mRNA的表达。R-2mAb的抑制作用强于R-1mAb，与两种单抗联合治疗几乎完全缓解了纤维化的发展。我们的体外研究表明，VEGF治疗显著刺激了活化的肝星状细胞（HSC）和窦状内皮细胞（SEC）的增殖。VEGF也显著增加活化HSC中α1（I）-前胶原mRNA的表达。
结论：这些结果表明，VEGF及其受体的相互作用反映了两者对HSC和SEC的联合作用，是肝纤维化发展的先决条件。
关键词：血管内皮生长因子、肝纤维化、血管生成、肝星状细胞
人们普遍认为肝纤维化的发展与慢性肝病的进展有关。1研究表明，肝窦内皮细胞（SEC）的毛细血管化和表型改变发生在肝纤维化的发展过程中。2–4肝SEC是一种独特的内皮细胞，具有开窗和基底膜缺失的特征。它们在形态和功能上都与普通EC不同。5窦毛细血管化涉及SEC的变化，包括开窗的丧失和基底膜的沉积，以及肝窦中细胞-细胞和细胞-基质相互作用的改变。2–6这种所谓的SEC毛细血管化是由新生血管的形成或原有窦的改变引起的，这两种情况都可能是对血管生成刺激的反应。6
血管生成是指从预先存在的血管和/或循环的EC干细胞中发展出新的血管系统。7,8新的证据表明，血管生成在许多生理和病理过程中起着关键作用，例如肿瘤生长、关节炎、银屑病和糖尿病视网膜病变。7,9虽然以前的研究是独立进行的，以确定与纤维化和血管生成相关的分子过程，但最近的研究表明，这两种生物现象是协同出现的。6在人类和动物实验研究中，发现肝纤维化发展过程中新生血管显著增加。10–12此外，具有抗血管生成活性的伏马菌素半合成类似物TNP-470抑制了实验性肝纤维化的发展。13这些结果表明血管生成在肝纤维化的发展中也起着重要作用。
血管生成受促血管生成因子和血管生成抑制剂之间的净平衡调节。到目前为止，已经确定了许多阳性和阴性的血管生成调节因子。其中，血管内皮生长因子（VEGF），也称为血管通透性因子，在血管生成过程中作用最强。14–16新的证据表明，血管内皮生长因子在许多生理和病理血管生成中起着关键作用。血管内皮生长因子（VEGF）不仅是一种血管生成因子，也被称为EC的生存因子。17–19关于肝纤维化，最近的实验研究表明，在肝纤维化发展过程中，VEGF的表达显著增加，并且VEGF参与肝窦毛细血管化。11,12,20除肝细胞外，活化的肝星状细胞（HSC）在肝纤维化形成中起着重要作用，已证明在活化过程中可增加VEGF的表达。21–24
两种酪氨酸激酶，fms（飞行管理系统）-与酪氨酸激酶（flt-1：VEGFR-1）和激酶插入结构域受体/小鼠同源物一样，胎肝激酶-1（KDR/Flk-1:VEGFR-2）均为III型酪氨酸激酶受体，已被确定为主要的VEGF受体。通过与这两种受体的高亲和力结合，VEGF可以刺激EC的增殖、迁移和分化，并在体内外诱导血管生成。16,25研究表明，这两种受体在许多病理事件中起着不同的生物学作用。26–28据报道，VEGFR-2在体内外都发挥着更重要的作用。15,16,29然而，最近的研究表明，VEGFR-1在病理性血管生成（如肿瘤生长）中也发挥一定作用。30–34研究表明，尽管在不同的培养条件下，如缺氧和CCl，VEGFR-1和VEGFR-2的表达上调模式不同，但在体外激活HSC的过程中，VEGFR-1和VEGFR-2的表达是被诱导的4治疗。22–24据报道，在实验性肝纤维化中，VEGFR-1在肝脏中的表达增加，VEGFR-2组成性高表达，尽管其表达水平没有显著改变。11,23VEGF及其受体之间的相互作用在肝纤维化发展中的体内作用尚未阐明。
在本研究中，我们使用VEGFR-1和VEGFR-2的特异性中和单克隆抗体，检测了VEGF及其受体在肝纤维化进展中的生物学作用。
方法
动物
雄性BALB/c小鼠，6周龄，购自日本SLC公司（日本静冈滨松）。在受控条件下（温度23±3°C，相对湿度50±20%），他们被安置在不锈钢网箱中，每小时换气10-15次，每天光照12小时。在驯化和实验期间，动物可以随意获得食物和自来水。
化合物和动物治疗
如前所述，产生抗VEGFR-1和VEGFR-2特异性中和抗体（分别为R-1mAb和R-2mAb）。31,33–36简而言之，这些抗体是在无血清培养基的大规模培养条件下产生的。单克隆抗体（mAbs）通过亲和层析在Gammabind-G-Sepharose柱上从条件培养基中纯化（美国新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚生物技术公司）。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，各受体的纯度大于99%，并使用鲎变种细胞裂解物内毒素检测试剂盒（美国马里兰州沃克斯维尔Bio-Whittaker Pyrogen Tplus）验证其不含内毒素（<1 EU/ml）。研究表明，R-2mAb以剂量依赖性方式发挥VEGFR-2抑制作用，每周给药两次的剂量为800μg/只时达到最大效果。34,37因此，我们在当前研究中使用了该剂量。
将小鼠分为四组（每组10只）。所有实验组均接受CCl4（2 ml/kg/体重溶于150μl玉米油中）每周两次发生肝纤维化。CCl治疗两周后4，第2组（G2）和第3组（G3）每周两次腹膜内给药R-1mAb和R-2mAb（800μg/只小鼠），给药时间与CCl给药时间不同4分别注射。第4组（G4）同时给予R-1mAb和R-2mAb。第1组（G1）的动物接受的对照免疫球蛋白G（IgG）的量与之前所述相同。35,36只接受玉米油的小鼠作为阴性对照组进行检查。CCl治疗八周后4，所有小鼠均在麻醉下死亡。所有动物程序均按照批准的方案和实验室动物正确护理和使用的标准建议进行。
组织学和免疫组织化学检查
在所有实验组中，常规处理5μm厚的福尔马林固定和石蜡包埋肝脏切片，进行Azan-Mallory（A-m）染色，以确定肝纤维化的发展。如前所述，使用石蜡包埋切片和初级抗α-SMA抗体对α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）进行免疫组织化学染色（日本京都Dako）。38–40使用Fuji-BAS 2000图像分析系统（日本东京富士）对五只小鼠的每个样本的六个视野（40倍放大）进行纤维化发展和免疫阳性细胞面积的半定量分析。我们没有计算假定为肝动脉的门脉区α-SMA阳性血管。我们仅在图像分析中将α-SMA阳性细胞纳入正弦线。38–40
肝羟脯氨酸含量和血清标志物
用200 mg冷冻样品测定肝脏羟脯氨酸含量，如前所述。40羟脯氨酸含量表示为μg/g湿肝。采用常规实验室方法评估天冬氨酸丙氨酸氨基转移酶（ALT）和总胆红素。还如前所述测量血清透明质酸和前胶原III-N肽（P-III-P）。38
免疫沉淀
为了确定800μg/小鼠剂量的R-1mAb和R-2mAb是否抑制肝脏中各自受体的自身磷酸化，如前所述进行免疫沉淀35腹腔注射R-1mAb和R-2mAb 15分钟后，每组三只小鼠的肝脏被切除，并立即速冻。浓缩肝池裂解液并用于免疫沉淀。为了进行免疫沉淀，在进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前，用抗磷酪氨酸对肝裂解物进行免疫沉淀。抗酪氨酸（4G10）购自Upstate Biotechnology（美国纽约），抗VEGFR-2（C-1158）和VEGFR-1（C-17）购自Santa Cruz（美国加利福尼亚）。在进行western blotting之前，我们用Ponceau溶液（美国密歇根州西格玛）对每个膜进行染色，以确认免疫沉淀的蛋白质数量相同（数据未显示）。使用扩增的碱性磷酸酶免疫印迹分析试剂盒（美国加利福尼亚州Bio-Rad）开发印迹。
实时聚合酶链反应检测VEGF、CD-31和α1-（I）-前胶原的RNA表达
如前所述，通过实时聚合酶链反应（PCR）评估VEGF、CD-31（广泛用作新生血管标记物）和α1-（I）-前胶原mRNA的表达。38,41每个实验组（n=5）从动物的整个肝脏中提取mRNA。对于cDNA合成，按照ABI Prism 7700序列检测系统（PE Applied Biosystems，Foster City，California，USA）制造商手册中的说明使用了Taqman逆转录试剂，该系统根据Taqman通用PCR主混合协议（PE Appried BiosSystems）用于实时PCR扩增。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内部对照，按照手册中的描述对基因表达进行相对定量。使用阈值循环和标准曲线方法计算靶RNA的相对量，如PE所述。采用以下温度：在50℃下保持2分钟，在60℃下保持30分钟，在94℃下保持5分钟，循环45在94℃重复1分钟，在55℃下重复1分钟，并在72°C下保持一分钟。为了防止基因组DNA污染，所有RNA样品都经过DNase I消化，并通过40个PCR周期进行检查，以确认没有扩增DNA。
HSC和SEC的分离培养
R-1mAb和R-2mAb只与小鼠受体反应，而不与其他物种（如大鼠）的受体反应。31,42尽管我们多次尝试从小鼠肝脏中分离纯HSC，但不能排除其他类型非实质性细胞（如EC）的污染。此外，如前所述，小鼠纯化HSC的产量太低，无法进行多项实验。38因此，我们从大鼠肝脏中提取了HSC，并检测了VEGF治疗对激活的HSC中VEGF受体相互作用的影响。如前所述，从F344大鼠的肝脏中分离出肝HSC，38稍作修改。简单地说，在37°C下，先用Krebs-Ringer溶液灌注肝脏，然后用0.1%的蛋白酶E和0.032%的胶原酶（日本京都Nakarai）溶液灌注。将消化后的肝脏切割、切碎，并在含有0.08%蛋白酶E、0.04%胶原酶和20μl/ml脱氧核糖核酸酶的Krebs-Ringer溶液中在37°C（pH 7.3）下培养30分钟。细胞通过尼龙网后，在450℃下离心克八分钟。HSC富集部分通过在8.2%Nycodenz（Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway）溶液中1400离心获得克持续20分钟。在450℃下通过离心法清洗上层白色的HSC克8分钟，悬浮在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mU/ml链霉素的DMEM培养基中。根据台盼蓝排除试验测定，细胞存活率超过95%。细胞密度为5×105I型胶原上的细胞/ml，这是一种已建立的培养激活模型，43或基底膜样EHS基质，在20%胎牛血清存在下放置6天，血清饥饿48小时，用10和100 ng/ml的人重组VEGF（美国明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）进行治疗，如前所述。24如前所述，先用胶原酶从大鼠肝脏中分离SEC，然后进行差速离心，44并在HuMedia-EG2培养基（日本大阪Kurabo）中，在胶原蛋白I涂层培养皿中生长，培养皿中提供人类重组VEGF（10 ng/ml）作为VEGF，是SEC存活的先决条件。45
体外增殖试验
如前所述，使用MTT法测定VEGF对活化HSC和SEC体外增殖的影响。46简言之，通过96孔板中培养的细胞对四氮唑、3-（-4,5-二乙基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）的转化来量化细胞增殖。540 nm滤光片的吸光度表示转化为formazan，这与活细胞的数量成正比。用ELISA平板记录器读取吸光度（每组6个）。
统计分析
为了评估定量数据组间差异的统计显著性，使用Mann-Whitney U检验比较两组之间的平均值。Kruskal-Wallis检验用于比较两个以上组的平均值。
结果
VEGF mRNA表达
首先，我们检测了CCl过程中VEGF mRNA的表达4诱导肝纤维化的发展。与以前的报告类似，11,12CCl后肝纤维化发展过程中肝VEGF表达显著增加4治疗。在纤维化发展过程中，R-1mAb和R-2mAb治疗均未改变VEGF基因的表达（图1). 我们进行了初步的常规逆转录PCR，发现在选择性剪接的小鼠VEGF基因中，VEGF164和血管内皮生长因子120在CCI中含量丰富4治疗过的肝脏（数据未显示）。
血管内皮生长因子（VEGF）mRNA在CCl中的表达4治疗过的肝脏。如方法部分所述，通过实时聚合酶链反应检测VEGF mRNA的表达。肝纤维化发展过程中，肝VEGF表达增加。在纤维化发展过程中，R-1mAb和R-2mAb治疗均未改变VEGF基因的表达。对照组，免疫球蛋白G处理的小鼠（800μG/只）（G1）；R1、R2、R-1mAb和R-2mAb处理的小鼠（800μg/只）（分别为G2和G3）；R1+R-2、R-1mAb和R-2mAb联合治疗组（G4）；油、玉米油注射阴性对照小鼠。数据为平均值（SD）（n=5）。
组织学发现和纤维化标记物
A-M染色显示CCl治疗8周后4导致显著的肝纤维化发展（图2A). R-1mAb和R-2mAb治疗均显著抑制纤维化的发展（图2B、2CR-1mAb和R-2mAb的联合治疗几乎完全减弱了CCl4诱导性肝纤维化（图2D). 玉米油治疗组未发现纤维化发展，低剂量R-1mAb（400μg/小鼠）未发挥这种抑制作用（数据未显示）。密度分析显示纤维化区域（图3A)与组织学检查结果基本一致。尽管与对照IgG治疗组相比，R-1mAb和R-2mAb均显著抑制肝纤维化的发展（p<0.01），但R-2mAbs的抑制作用比R-1mAbs治疗组更强（p<0.01）。与单独的R-2mAb相比，两种mAb的联合治疗显示出进一步的抑制作用（p<0.05）。肝羟脯氨酸含量显示出与纤维化区域相似的结果（图3B). 这些结果表明，VEGFR-1和VEGFR-2在肝纤维化形成中都起着重要作用，并且VEGFR-2的作用比VEGFR-1。用R-1mAb和R-2mAb治疗后，血清纤维化标志物透明质酸和P-III-P也显著受到抑制，而血清ALT和总胆红素水平则不随R-1mAb和R-2m Ab的使用而改变（表1). 我们还检测了R-1mAb和R-2mAb对急性肝损伤和早期肝纤维化步骤的影响。研究表明，CCl后第7天可以观察到Masson三色阳性结缔组织蓄积4治疗。47CCl后2或7天4治疗后，R-1mAb和R-2mAb没有改变肝脏中的ALT水平（数据未显示）。这表明mAbs的抑制作用不是对CCl的细胞保护作用的次要反应4。对照组、R-1mAb治疗组和R-2mAb处理组小鼠死亡时的体重和肝脏重量没有显著差异（数据未显示）。
CCl肝脏切片的显微照片4治疗小鼠。（A） CCl后对照免疫球蛋白G治疗组4治疗组（800μg/只）（G1）。（B，C）R-1mAb和R-2mAb处理（800μg/小鼠）组（分别为G2和G3）。（D） R-1mAb和R-2mAb联合治疗组（G4）。G1期肝脏出现广泛纤维化。在G2和G3中，肝纤维化的发展显著减弱，并且R-2mAb治疗的抑制作用比R-1mAb治疗更有效。G4组肝脏的纤维化发展几乎完全消失（A-M染色，40×）。
R-1mAb和R-2mAb对CCl纤维化面积（A）和肝羟脯氨酸含量（B）的影响4治疗过的肝脏。（A） 如方法部分所述，通过图像分析仪评估纤维化区域。与对照组相比，R-1mAb和R-2mAb显著抑制肝纤维化的发展（p<0.01），R-2mAbs治疗组的抑制作用更强（p<0.01）。与单独使用R-2mAb相比，联合使用两种单克隆抗体显示出进一步的抑制作用（p<0.05）。（B） R-1mAb和R-2mAb对肝羟脯氨酸含量的抑制作用与对纤维化区域的抑制作用相似。对照组，免疫球蛋白G处理的小鼠（800μG/只）（G1）；R1、R2、R-1mAb和R-2mAb处理的小鼠（800μg/只）（分别为G2和G3）；R1+R2、R-1mAb和R-2mAb联合治疗组（G4）；油、玉米油注射阴性对照小鼠。数据为平均值（SD）（n=5）*所示组之间p<0.05，**p<0.01。
表1
R-1和R-2单克隆抗体对CCl治疗动物几种标志物的影响4
| 组 | 透明质酸（ng/ml） | P-III-P（纳克/毫升） | 丙氨酸氨基转移酶（U/ml） | 总胆红素（mg/dl） |
| 控制 | 190.2 (27.5) | 46.3 (6.4) | 242.4 (51.8) | 1.4 (0.2) |
| R1单克隆抗体 | 82.7 (17.4)** | 20.6 (6.0)** | 216.4 (55.7) | 1.1 (0.2) |
| R2单克隆抗体 | 28.7 (14.3)†† | 7.1 (3.4)†† | 233.8 (60.8) | 1.2 (0.2) |
| R1+R2 | 18.6 (7.9) | 3.8 (1.9) | 226.3 (54.5) | 1.1 (0.3) |
| 石油 | 11.4 (3.0) | 2.4 (1.1) | 45.1 (7.3) | 0.6 (0.2 |
新生血管形成
为了检测R-1mAb和R-2mAb的抑制作用是否与抑制肝脏新生血管有关，我们评估了肝纤维化发展过程中的血管生成反应。我们对所有实验组切片上的血管性血友病因子（vWF）相关抗原进行了初步免疫组化分析，发现R-1mAb/R-2mAb治疗显著抑制了vWF阳性血管。然而，由于难以识别R-1mAb和R-2mAb联合治疗组中的小切口血管，因此很难准确评估vWF阳性细胞（数据未显示）。据报道，CD34是一种比vWF相关抗原更敏感的标记物。4CD31也是EC的敏感标记。48在这些标记物中，已经报道了CD34的表达可能被VEGF降低。49因此，我们在当前研究中使用CD31表达。
我们对CD31基因表达进行实时PCR分析，以评估肝脏中的新生血管。图4表明CD31基因表达显著增加，与肝纤维化发展相关。与纤维化区相似，与对照组相比，R-1mAb和R-2mAb均显著抑制CD31基因表达（p<0.01）。与R-1mAb治疗相比，R-2mAb治疗的抑制作用更强（p<0.01），两种单克隆抗体的联合治疗几乎消除了肝脏新生血管。值得注意的是，通过R-1mAb和R-2mAb治疗抑制血管生成的程度与抑制纤维化区域的程度相似。
R-1mAb和R-2mAb对肝脏新生血管形成的影响。如方法部分所述，通过实时聚合酶链反应检测CD31 mRNA表达。CD31基因表达在肝纤维化发展过程中显著增加。用R-1mAb和R-2mAb治疗可显著减少肝脏新生血管。用R-1mAb和R-2mAb治疗抑制血管生成的程度与抑制纤维化区域的程度相似。对照组，免疫球蛋白G处理的小鼠（800μG/只）（G1）；R1、R2、R-1mAb和R-2mAb处理的小鼠（800μg/只）（分别为G2和G3）；R1+R2、R-1mAb和R-2mAb联合治疗组（G4）；油、玉米油注射阴性对照小鼠。数据为平均值（SD）（n=5）*两组间差异有显著性（p<0.05、**p<0.01）。
R-1mAb和R-2mAb对HSC活化的影响
据报道，不仅SEC，而且激活的HSC都表达VEGFR-1和VEGFR-2。23,24免疫组织化学检查表明，用R-1mAb和R-2mAb处理后，α-SMA阳性细胞显著减少（图5A-5D). 计算机辅助半定量分析表明，与对照组相比，R-1mAb和R-2mAb治疗组的α-SMA阳性细胞显著减少（p<0.01）（图6A). 我们还进行了实时PCR分析，以阐明这些单克隆抗体对α1-（I）-前胶原mRNA表达的影响。与对照组相比，R-1mAb和R-2mAb也显著抑制肝脏中α1-（I）-前胶原的mRNA表达（p<0.01）（图6B). R-2mAb对α-SMA阳性细胞和α1-（I）-前胶原mRNA表达的抑制作用均显著强于R-1mAb（p<0.01）。R-1mAb和R-2mAb对α-SMA、α1-（I）-前胶原mRNA表达和纤维化区域的抑制作用几乎相同，表明抑制HSC活化也有助于这些单抗的抗纤维化作用。
α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组织化学分析。与对照组（A）（G1）相比，R-1mAb（B）、R-2mAb（C。
CCl中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性细胞（A）和α1-（I）-前胶原mRNA表达（B）的密度分析4治疗过的肝脏。经R-1mAb和R-2mAb处理后，α-SMA阳性活化的肝星状细胞和α1-（I）-前胶原mRNA显著降低。R-2mAb的抑制作用强于R-1mAb。R-1mAb和R-2mAb对α-SMA和α1-（I）-前胶原表达的抑制作用几乎平行降低。对照组，免疫球蛋白G处理的小鼠（800μG/只）（G1）；R1、R2、R-1mAb和R-2mAb处理的小鼠（800μg/只）（分别为G2和G3）；R1+R2、R-1mAb和R-2mAb联合治疗组（G4）；油、玉米油注射阴性对照小鼠。数据为平均值（SD）（n=5）*所示组之间p<0.05，**p<0.01。
VEGFR-1和VEGFR-2受体原位激活
为了确定当前研究中使用的剂量（800μg/小鼠）的R-1mAb和R-2mAb是否抑制肝脏中的自身磷酸化，我们研究了腹腔注射R-1mAbs和R-2mAb后肝脏中酪氨酸磷酸化的VEGFR-1和VEGFR-2。R-1mAb和R-2mAb显著抑制了各自受体的酪氨酸磷酸化，R-1mAb和R-2m Ab的联合治疗几乎完全消除了肝脏中这两种受体的磷酸化。
服用R-2mAb和R-1mAb均未改变VEGFR-1和VEGFR-2的激活（图7).
R-1mAb和R-2mAb对血管内皮生长因子（VEGF）受体VEGFR-1（fms-like tyrosine kinase，Flt-1）和VEGFR-2（kinase-insert domain-containing receptor，Flk-1）活化的影响。注射R-1mAb和R-2mAb 15分钟后，从三只小鼠中切除肝脏并合并。如方法部分所述，浓缩肝裂解物并用于免疫沉淀。R-1mAb和R-2mAb显著抑制各自受体的酪氨酸磷酸化。服用R-2mAb和R-1mAb均未改变VEGFR-1和VEGFR-2的激活。VEGFR-1的激活水平低于VEGFR-2。Lane 1，免疫球蛋白G治疗对照组（G1）；2区，R-1mAb治疗组（G2）；3区，R-2mAb治疗组（G3）；泳道4、R-1mAb和R-2mAb联合治疗组（G4）；5巷，玉米油处理阴性对照组。
血管内皮生长因子对体外培养活化HSC和SEC的影响
据报道，I型胶原表面的HSC被逐渐激活，而与正常肝内皮下基质（EHS基质）相似的基底膜基质上的HSC保持静止。24,50我们检测了VEGF在不同培养条件下对HSC增殖的影响。图8A结果表明，10和100 ng/ml VEGF治疗均未增加EHS基质的体外增殖，而在I型胶原涂层培养皿上显著刺激（p<0.05），表明VEGF刺激活化的HSC增殖，但不刺激静止的HSC。我们还检测了VEGF是否增加活化HSC中细胞外基质（ECM）成分的合成。如图8B所示10 ng/ml的VEGF治疗显著上调活化HSC中α1-（I）-前胶原mRNA的合成。
血管内皮生长因子（VEGF）对体外活化肝星状细胞（HSC）和肝窦内皮细胞（SEC）增殖和α1-（I）-前胶原mRNA表达的影响。如方法部分所述，分别通过MTT分析和实时聚合酶链反应测量细胞增殖和mRNA表达。（A） 在10和100 ng/ml的剂量下，VEGF治疗并未增加EHS基质上HSC的体外增殖，而显著刺激I型胶原（Col-I）的增殖*与对照组比较p<0.05。对照组，未治疗对照组；VEGF、VEGF治疗组的剂量分别为10和100 ng/ml。（B）当剂量为10 ng/ml时，VEGF显著增加活化HSC中α1-（I）-前胶原mRNA的合成**与VEGF未治疗组相比，p<0.01。（C） VEGF刺激后，SEC的增殖随着时间的推移显著增加（10 ng/ml）。外径，光密度*与第1天相比，p<0.05，**p<0.01。数据为平均值（SD）（n=5）。
接下来我们研究了VEGF对SEC增殖的影响。正如已经证明的那样，VEGF是SEC的生存因素，45我们按时间顺序检查了在VEGF（10 ng/ml）存在下SEC的增殖试验。图8C结果表明，随着时间的推移，VEGF刺激后SEC的增殖显著增加。如果没有VEGF，这些细胞会在几天内迅速萎缩并死亡。我们还检测了血管内皮生长因子是否诱导SEC产生可能影响HSC生物学的因子，如血小板衍生生长因子和转化生长因子β。我们发现，在SEC中使用VEGF治疗后，这两个因子都没有增加（数据未显示）。除了MTT测定外，我们还进行了[H]三HSC和SEC体外增殖的掺入实验。我们的结果与先前报道的结果相似51MTT和[H]三掺入分析（数据未显示）。
讨论
血管生成和纤维化是发育、生长、伤口愈合和再生的关键组成部分。最近的研究表明，在许多疾病状态下，这些过程通常同时发生，在这些状态下，新生血管被认为启动了病理级联反应。6在迄今为止已确定的血管生成因子中，VEGF是许多生理和病理过程中最有力和最核心的因子之一。14–16在肝纤维化中，研究表明，VEGF在人类慢性肝病和实验性纤维化中的表达增加。10–12据报道，VEGF的表达与慢性肝病相关的血管生成和正弦毛细血管化有关。12,52,53我们还观察到，在与肝脏新生血管相关的纤维化发展过程中，VEGF基因表达显著增加，并且VEGF受体相互作用的抑制显著减弱了肝纤维化和血管生成的进展。
VEGF的生物活性主要通过两种III型酪氨酸激酶受体介导，即VEGFR-1和VEGFR-2，它们在血管生成和信号转导途径中发挥不同的作用。15,16,26,28据报道，VEGFR-2在体内外的一些生物事件中发挥着更重要的作用。15,16,35,36猪EC中VEGFR-2的过度表达导致肌动蛋白重组、趋化和有丝分裂，以响应VEGF，尽管VEGFR-1在同一细胞中的表达在体外的影响最小。28然而，最近的研究表明，VEGFR-1也参与病理性血管生成，如肿瘤生长。30–34在本研究中，我们发现抑制VEGFR-1或VEGFR-2可显著减弱肝纤维化，并伴有血管生成抑制，而R-2mAb治疗效果优于R-1mAb。两种单克隆抗体的联合治疗几乎完全减弱了肝纤维化。这些结果表明，VEGF受体相互作用是肝纤维化过程的主要调节器。VEGFR-1和VEGFR-2均参与肝纤维化形成，与VEGFR-1相比，通过VEGFR-2中的信号传导是主要途径。
现已认识到活化的HSC在肝纤维化发展中起着重要作用。1,54除EC外，最近的研究表明，VEGF及其受体的表达也发生在活化的HSC中。22–24这表明VEGF的细胞靶点并不局限于EC，VEGF反应反映了EC和HSC的联合作用。最近，研究表明缺氧诱导的VEGF表达与血管生成和肝纤维化有关。作者表明，肝纤维化过程中，肝VEGFR-1表达增加，这可能源于活化的HSC。11体外研究表明，缺氧条件下活化的HSC中VEGFR-1选择性增加，而VEGFR-2的表达没有上调。23然而，值得注意的是，VEGFR-2是在活化的HSC中组成性表达的，并且VEGFR-2的表达水平远高于VEGFR-1。11,23,24我们发现活化的α-SMA阳性HSC和α1-（I）-前胶原mRNA被R-1mAb和R-2mAb显著抑制。据报道，α-SMA在活化的HSC中的表达可能被VEGF下调。21作者还声称，VEGF不影响体外活化HSC的增殖。相比之下，我们和其他人在不同的培养条件下表现出不同的结果，24提示VEGF在不同培养条件下对活化的HSC具有不同的生物学效应。肝损伤后，HSC增殖并激活为肌纤维母细胞表型，其特征是α-SMA表达增加。1由于现在广泛认为α-SMA是体内纤维化发生的有用和可靠的标记物，1,38,40我们在当前的研究中也使用了这个标记。
我们还发现，VEGF在体外刺激活化的HSC增殖，表明HSC中VEGF受体的相互作用在肝纤维化发生中也起着重要作用。我们发现HSC在Matrigel上培养时对VEGF没有反应。基质可以隔离VEGF，因为它可以与基质的蛋白多糖结合。然而，我们发现低和高外源性VEGF治疗（分别为10 ng/ml和100 ng/ml）也有类似的效果。对于高剂量的VEGF，我们假设VEGF可以作用于HSC，即使Matrigel可能隔离部分VEGF。据报道，VEGF对Matrigel中活化的HSC也有类似的作用。24
阐明R-1mAb和R-2mAb在肝纤维化形成过程中的结合位点具有重要意义。我们试图通过免疫组织化学双重染色定位这些单克隆抗体结合位点，但未能获得良好结果。背景非常强烈，解释非常困难（数据未显示）。此外，由于我们无法获得大鼠的特异性R-1mAb和R-2mAb，因此在激活的HSC中每个受体的具体作用目前仍不清楚。当针对大鼠VEGFR-1和VEGFR-2的单克隆抗体可用时，进一步的研究可能会阐明每种受体在肝纤维化中的作用。
VEGF最初被确定为一种血管通透性因子，其增加的微血管通透率约为组胺的50000倍。14,16,27它诱导血浆蛋白外渗，导致ECM增加。也有报道称，VEGF增加了结缔组织生长因子的mRNA水平，已知其对ECM的产生有作用。55在当前的研究中，我们发现VEGF显著增加激活的HSC中的α1（I）-前胶原mRNA，表明VEGF通过ECM的生成和激活的HSC中的增殖刺激肝纤维化。然而，众所周知，HSC是主要的ECM生成细胞类型，但SEC也通过合成刺激HSC活化的细胞纤维连接蛋白亚型对损伤作出快速反应。56它们还产生ECM成分，如IV型胶原蛋白和几种蛋白聚糖。57,58除了血管生成活性外，VEGF还可能通过这些生物活性刺激纤维化的发展。
总之，肝VEGF mRNA表达在纤维化发展过程中显著增加，R-1mAb和R-2mAb治疗均显著减弱与抑制肝内新生血管相关的纤维化形成。R-2mAb的抑制作用强于R-1mAb，与R-1mAbs和R-2mAbs联合治疗几乎完全缓解了肝纤维化的发展。R-1mAb和R-2mAb显著抑制α-SMA阳性活化HSC和α1-（I）-前胶原mRNA，VEGF刺激活化HSC体外增殖。这些结果表明，VEGF及其受体之间的相互作用反映了两者对HSC和SEC的联合作用，是肝纤维化发展的先决条件。
致谢
这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部科学研究拨款（C-14570498）的部分支持。
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