生物化学。作者手稿；PMC 2007年1月10日提供。
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力连锁在粘附受体机械化学中的重要性†
CBR生物医学研究所，哈佛医学院麻醉系和病理系，马萨诸塞州波士顿02115
‡当前地址：西班牙巴塞罗那罗赛罗161，7a planta，08036，Instituto de Investigaciones Biomedics de Barcelona-CISC。
摘要
整合素α的α亚基插入（I）结构域L（左）β2[淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）]与细胞间粘附分子-1（ICAM-1）结合。αI结构域的C端和N端在“下”面上彼此靠近，与“上表面”上的金属离子依赖性粘附位点（MIDAS）相对。在转换为开放的αI结构域构象时，C末端螺旋α7向下的轴向位移与MIDAS重排成其高亲和力构象有关。在这里，我们测试了这样一个假设，即当施加的力与构象变化适当相关时，构象变化可以稳定抵抗施加力的粘着相互作用。整合素αI结构域分别使用I型或II型跨膜结构域通过其C或N末端锚定到细胞表面。C端而非N端锚定在ICAM-1基板上以剪切流的方式牢固支撑细胞滚动。相反，当αL（左）I结构域通过二硫键在开放构象中突变稳定，它介导与I型和II型膜锚的可比牢固粘附水平。为了排除其他作为差异粘附来源的影响，使用通过N-或C-末端与聚苯乙烯微球共轭的αI结构域复制这些结果。我们的结果证明了一种用于调节粘合强度的机械反馈系统。综述了整合素α和β亚基I结构域的晶体结构以及高亲和力和低亲和力构象中的选择素，表明了一种常见的机械化学设计，在这种设计中，生物施加的张力稳定了更广泛的高亲和力构像。
白细胞在内皮细胞上参与滚动粘附相互作用的能力非常重要，这是测量内皮细胞触发迁移信号的第一步。白细胞的滚动是由作用于粘附细胞的血流的流体动力驱动的，涉及细胞的急速逐步运动，反映了受体-配体键分离事件。可以复制滚动在体外在平行壁流室中使用白细胞或转染剂，纯化的粘附配体被吸附到其中。稳定滚动介于牢固粘附和机械诱导剥离之间，需要在细胞上游边缘的机械应力下通过细胞与基质之间粘附区下游的键重新形成来平衡键的分离(1). 值得注意的是，生理滚动相互作用高度稳定体内和在体外、表面配体密度的变化以及作用于细胞的水动力，其与壁面剪切应力成正比。
虽然细胞和分子特征都有助于滚动的稳定性，但为什么滚动如此稳定尚不清楚(1–7). 剪切力增加的一个重要因素是细胞和底物之间受体-配体键数量的增加，这弥补了更快的键离解(1). 另一个因素是单个键的机械稳定性，即键解离率随作用力增加而增加的系数较低(2–6,8). 分子特化可能很重要，因为在粘附分子中，所有选择素-配体相互作用和整合素-配子相互作用的子集都支持滚动，而IgSF-IgSF-和钙粘蛋白-钙粘蛋白相互作用强烈支持牢固粘附，但不支持滚动粘附(9). 只有一小部分抗体-抗原对支持滚动，而那些确实表现出有限稳定性(10). 快速键结合和离解动力学似乎是必需的，但不足以支持滚动，如相互作用的IgSF粘附分子CD2和LFA-3所示，其动力学在适当范围内(11,12)但无法支持滚动(13). 考虑到这些因素，有趣的是，支持滚动、选择素和整合素的粘附分子类会经历与配体亲和力变化相关的结构域间和结构域内变构重排(14–19).
在本研究中，我们将力作为支持滚动的整合素结构域的变构效应器进行研究。以前的研究表明，分离的整合素LFA-1αI结构域通过其C末端融合到I型跨膜结构域时，可以在流体动力流中细胞间黏附分子1涂层表面上介导抗剪切细胞滚动相互作用(20). 配体ICAM-11是一种细胞表面IgSF分子。LFA-1αI结构域采用α/β折叠，围绕六股β片有七个α螺旋。位于I结构域上表面的金属离子依赖性粘附位点（MIDAS）中的Mg（II）离子与配体（如ICAM-1）中的Glu残基相协调。与I结构域配体接触的氨基酸残基在上表面包围MIDAS，而与整合素β推进器的N-和C-末端连接位于相对的下表面。在αI结构域的活化（开放，高亲和力）构象中，C末端螺旋α7相对于基础（封闭，低亲和力）构型中的位置向下移位(). 螺旋α7的位置变构地调节含有金属配位和ICAM-1结合残基的环的构象，从而调节配体的亲和力(18).
我领受变质岩和武力。（A） I域的示意图。MIDAS从封闭构象到开放构象的转变与C端α螺旋的轴向C端位移有关（箭头所示）。（B） 细胞在剪切流中粘附在基质上，细胞受到流体动力的示意图（FS公司)和系绳上的力（FT型). （C和D）放大面板B中的方框区域，以显示通过I域–ICAM-1相互作用到基板的系链。ICAM-1与基质相连（直线，底部），I域与细胞表面相连（曲线，右上角）。系绳力（FT型)由相等但相反的法向力（F）平衡N个).
野生型、孤立的αI结构域主要存在于封闭的低亲和力构象中；然而，它必须转变为开放的、高亲和力的构象来支持滚动，因为滚动受到小分子拮抗剂的抑制，这些拮抗剂结合并稳定封闭的构象(21). 与ICAM-1结合可以稳定开放构象，如核磁共振实验所示，高浓度的ICAM-1和野生型αI结构域将平衡推向复合物形成(22). 而野生型、分离的αI结构域对ICAM-1的亲和力较弱(K（K）天~1 mM），突变αI结构域与锁定在向下（开放）构象中的C末端螺旋的亲和力提高了约10000倍(23). 靶向分子动力学模拟表明，施加在野生型αI结构域C末端螺旋上的力可以驱动从封闭（低亲和力）到开放（高亲和力）状态的转变，构象转变的程度与施加的力有关(24).
在这里，我们测试了这样一个假设，即如果通过一个能使作用力偏向与配体具有更高亲和力的构象状态的连接将力施加到受体-配体复合体上，则滚动可以稳定(). 我们以前曾提出整合素αI结构域的稳定滚动关键依赖于I结构域通过C末端与细胞的连接(21). 我们通过比较通过N端或C端锚定在细胞或珠子上的αI结构域来明确验证这一假设。此外，对其他粘附受体的结构分析表明，它们具有机械化学作用，因此施加在受体-配体复合物上的生理张力有利于更广泛的高亲和力构象。
实验程序
试剂
Pfu聚合酶和脱氧核苷酸混合物来自Stratagene（德克萨斯州Ceder Creek）。限制酶、碱性磷酸酶和T4 DNA连接酶来自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州贝弗利）。载体pcDNA3.1（+）-hygro和pcDNA3.1.（+）-puro来自Invitrogen（Carls-bad，CA）。生物素连接酶（BirA）来自Avidity（Bolder，CO），链霉亲和素涂层微球来自Bangs Labs（Fishers，IN）。ICAM-1-Fcγ来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州），人血清白蛋白（HSA）来自Sigma（密苏里州圣路易斯市）。抗体X63和TS1/11，用作培养上清液，已在前面描述过(25). 纯化的小鼠IgG1来自BD Biosciences（加州圣何塞）和MHM24(26)来自Dako Cytomation（加利福尼亚州Carpenteria）。
cDNA、细胞系和蛋白质
稳定转染I型α的K562细胞L（左）与血小板衍生生长因子受体跨膜结构域（IPDGFR）融合的I结构域（野生型和K287C/K294C突变型(27). II型αL（左）I结构域融合到Us9（δ46–55）跨膜结构域(28,29)分三步通过灵活的链接器。天然Us9蛋白以两种形式存在，N末端甲硫氨酸的位置不同。我们的构造从第二个（内部）开始位置开始。通过PCR制备合成基因的每个片段；添加了独特的限制位点（带下划线）以便于组装。序列经DNA测序证实。使用了以下一组PCR引物：Primer_1向前地，标签AAGCTT公司ATGGACCGTTCGACCAGCGCC合同通用条款；底漆_1颠倒、TTAAGGATCC公司ACCTGAACCCCACGTGGCCGGGATGCC；底漆_2向前地，塔塔GGATCC公司GCTTCC公司TCCGGA公司GGTGTTCAGGCAACGTAG；底漆_2颠倒，收件人CTCGAG公司TTAATAGATCTCTTCTTCTGCAGCTCAG；底漆_3向前地，ATAAGGATCC公司GCTGGCCTCCTCCAGCGCTGTCGACGA公司ACAAAACTCATC；和底漆_3颠倒，AATAATCCGGAACCAGAGAGAGCCAGCGCGCGCGGTACCCACGATCTCGGGTC。
使用引物集1从pAB35（新泽西州普林斯顿大学微生物系L.W.Enquist善意提供）扩增Us9（δ46-55）基因。将载体pcDNA3.1（+）-hygro和PCR产物用HindIII和BamHI消化并连接成质粒pCUS9。使用底漆组2，α的连接剂残基和残基G128–Y307L（左）I结构域从之前描述的(30)用pNBirI表示的载体，其编码将PCR产物和pCUS9用BamHI和XhoI酶切并连接成pCALIUS9_short载体，然后将HindIII和Xho1片段亚克隆到pcDNA3.1（+）-puro中。引物集3用于扩增pIPDGFR的连接子片段(27). PCR产物和上述亚克隆到pcDNA3.1（+）-puro中的HindIII和XhoI片段用BamHI和BspEI消化并连接，得到pALIUS9-puro载体。然后将HindIII和XhoI片段亚克隆到pcDNA3.1（+）-higro中，得到pALIUS9-hygro。以类似的方式制备表达K287C/K294C（高亲和力）突变体I结构域的构建物，但PCR步骤2的模板是编码Bir标记与突变体I域的N末端融合的载体。
N端和C端锚定的I域。（A） I型（顶部）和II型（底部）TM域锚定I域的序列。将I域序列装箱，并显示前五个（GNVDL）和最后四个（KKIY）残基以供参考。TM域被覆盖。链接器序列位于装箱序列和覆盖序列之间。（B） I型和II型TM结构域I结构域的流式细胞术。用（灰色）1:10稀释的TS1/11培养上清或（白色）对照X63骨髓瘤上清对细胞进行染色，用FITC-标记的山羊抗鼠IgG（2μg/mL）检测。（C） 生物素化的可溶性I结构域的序列。将I域序列装箱，并显示起始和结束残基以供参考。Bir A标签下划线，生物素化赖氨酸加粗。（D） 与生物素化I结构域连接的链霉亲和素涂层微球，用1:5稀释的TS1/11培养上清液（灰色）或X63（白色）染色，用2μg/mL FITC-标记的山羊抗鼠IgG检测。
K562细胞（20×106)通过电穿孔法在250 mV和960μF条件下转染20μg DNA。在含有100μg/mL潮霉素的培养基中选择转染剂。2周后，以TS1/11抗体（1:20稀释度）和非结合性X63骨髓瘤（1:20倍稀释度）作为阴性对照，在4°C下用PE-结合山羊抗鼠IgG洗涤并染色30分钟，然后再次洗涤，通过荧光激活细胞分选选择最亮的1%细胞。在进一步生长后，最明亮的0.1%细胞被每孔一个细胞分为96个板。然后选择表达高水平野生型和高亲和力II型I结构域的克隆。所有细胞均保存在添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、500单位/mL青霉素、500μg/mL链霉素和100μg/mL潮霉素的RPMI 1640培养基中。
I型和II型生物素化可溶性I结构域
融合到BirA共有序列的重组可溶性I结构域的表达、重折叠、纯化和BirA连接酶生物素化与前面描述的N末端标记的I结构域完全相同(30). 最后一步是S75凝胶渗透色谱，表明材料是单体。C末端标记的I结构域构建如N末端标记构建所述，具有起始蛋氨酸、I结构域残基G128–Y307、连接子Ser-Gly-Gly-Gly和BirA酶识别标记（LGGIFEAMK-MELRD）(). 根据制造商的说明，将生物素化可溶性I结构域[5μg/mL，PBS（pH 7.4）和1%BSA]附着在9.95μm链霉亲和素微球上，在相同的缓冲液中清洗，并在1小时内使用。
细胞的制备
细胞在不含Ca（II）或Mg（II。细胞以最终浓度5×10悬浮6在每次实验之前，在不含Ca（II）或Mg（II。
剪切流中的堆积和滚动速度
将聚苯乙烯板涂上20μL ICAM-1-Fcγ斑点（10μg/mL），置于PBS缓冲液（pH 9.0）和10 mM碳酸氢钠（37°C）中1 h。用少量相同缓冲液清洗板，并用2%HSA在37°C的相同缓冲液中封闭1 h。
ICAM-1基板在平行板流动室中组装为下壁，并安装在倒置相控显微镜的工作台上。使用带有3mL塑料注射器的注射泵来产生所需的剪切应力条件。细胞重新悬浮在HBSS缓冲液、1 mM Ca（II）和1 mM Mg（II。细胞（0.5 mL，密度为5×105细胞/mL）以0.3 dyn/cm的速度灌注到平行板流动室中230秒，0.4 dyn/cm2用含1 mM Ca（II）和1 mM Mg（II2持续10s，剪切力每10s增加一倍，达到8dyn/cm2用10×尼康平面物镜在Hi-8录像带上以每秒30帧的速度记录贴壁细胞的图像，以供后续分析。使用前面描述的计算机成像系统离线分析每个剪切的中间3 s(10). 我们将每次剪切时每个视野的粘附细胞总数、牢固粘附细胞的分数（定义为每3 s间隔移动小于细胞直径的一半）以及平均滚动速度制成表格。
除了PBS（pH 7.4）和1%BSA中的缓冲液为2 mM Mg（II）外，使用与N-或C-末端生物素化I结构域结合的链霉亲和素涂层聚苯乙烯微球进行的实验与所述的细胞实验方案相同。
结果
建筑设计
整合素αL（左）I结构域在其N末端与54氨基酸残基间隔区和II型跨膜结构域融合，或如前所述(21)在其C-末端到54氨基酸残基间隔区和I型跨膜结构域(). 建立了稳定的K562转染子，其表达II型构建体略好于具有野生型αL（左）I域(). 作为对照，建立了表达高亲和力K287C/K294C突变体αL（左）I域与II型或I型TM域比较().
剪切流中I型和II型锚定I域粘附性的比较
将ICAM-1-Fcγ吸附到下壁，在平行壁流动室中检测表达I型和II型连接I结构域的K562细胞的粘附行为。以0.3 dyn/cm的速度注入细胞30 s2，然后以10 s的间隔将剪切力增加到0.4、1、2、4和8 dyn/cm2I型转染体主要以0.3和0.4 dyn/cm的速度累积2，以1 dyn/cm的速度额外累积2(). 在滚动计数中，只有每3秒移动细胞直径一半以上的细胞被视为滚动细胞，而不是牢固粘附的细胞()，但轧制速度的计算中包括了所有单元(). 具有I型TM-anchored I结构域的细胞是抗剪切的，大多数细胞在8 dyn/cm时仍然粘附2(). 平均轧制速度从~6μm/s增加到0.4 dyn/cm28 dyn/cm时为22μm/s2(). I型TM-anchored I域转染剂的这些结果与之前的结果一致(21). 三条证据表明，拉绳和滚动完全是由于I域–ICAM-1相互作用。(1)无细胞系在模拟（2%HSA）涂层基板上并滚动。(2)用5 mM EDTA替换1 mM Ca（II）和1 mM Mg（II。(三)10μg/mL MHM24（一种I域阻断抗体）抑制了97%的累积。
表达野生型I结构域和I型或II型TM结构域的K562转染体在剪切流中的粘附。将表达具有I型（C末端）或II型（N末端）TM结构域的I结构域的K562转染子在含有1mM Mg（II）和1mM Ca（II）以及10μg/mL小鼠IgG1（对照）的HBSS培养基中输注到流动室中。细胞在0.3 dyn/cm的壁切应力下堆积2在带有ICAM-1-Fcγ基底的平行壁流室中保持30 s。壁剪切应力增加到0.4 dyn/cm2每10秒增加一次。（A和B）具有I（A）型和II（B）型TM域的牢固粘附和滚动细胞的数量。（C） 所有单元的平均滚动速度。条形图显示了三个实验的标准偏差，每个实验有五个重复。
与II型TM-anchored I结构域转染剂的结果相反。II型转染体的累积效率低于I型转染剂的10%(). 此外，II型转染剂的抗剪切性差得多，在4和8 dyn/cm时没有细胞保持粘附2此外，在0.4和2 dyn/cm时，II型转染体的滚动速度是I型转染剂的7–7.5倍2细胞积累水平较低，抗脱落能力较低，滚动速度较快，均表明II型转染体的滚动粘附性明显弱于I型转染剂。这与II型转染剂的I域表达水平高1.3倍形成对比(). 所有其他测试的II型转染克隆表达的I结构域数量较少，粘附性更弱（数据未显示）。5 mM EDTA或10μg/mL MHM24抗体完全抑制细胞在底物上的积累。
高亲和力突变体I结构域I型和II型转染子
N端和C端锚定的I结构域之间的差异表明，当沿着有利于过渡到I结构域构象的路径施加力时，配体亲和力更高，可以稳定滚动相互作用。我们的假设预测，当在链β6和螺旋α7之间引入二硫键桥时，不应发现N端和C端锚定结构之间的差异，二硫键桥接稳定了K287C/K294C突变体中的高亲和力构象(27). K287C/K294C突变体已经处于开放构象(18,30)我们假设施加在野生型I结构域上的C末端力更有利；此外，当力作用于C末端时，引入的二硫键应能稳定I结构域，防止进一步的构象变化。确实，高亲和力突变体I型和II型锚定I结构域转染体在剪切流中表现相同(). 对于高亲和力突变体，剪切流中的细胞积累水平和较高剪切力下的抗剥离能力略高()与野生型I型转染剂相比()对于高亲和力II型转染体来说，这一数值要高得多()与野生型II型转染剂相比(). 此外，基本上所有细胞都牢固地粘附在一起，即使在检测到的最高剪切力下也是如此(). 用5 mM EDTA或10μg/mL MHM24抗体处理完全抑制积聚（数据未显示）。
表达具有I型或II型TM结构域的高亲和力突变I结构域的K562转染体在剪切流中的粘附。表达高亲和力K287C/K294C突变体I结构域的K562转染体按照传说中的方式注入（A和B）具有I（A）型和II（B）型TM域的牢固粘附和滚动细胞数量。条形图显示了三个实验的标准偏差，每个实验有五个重复。
剪切流中N端和C端连接的I结构域在链霉亲和素涂层珠上的粘附性比较
为了排除I结构域与ICAM-1相互作用的内在机械化学以外的因素作为差异行为的来源，我们研究了用I结构域修饰的链霉亲和素涂层聚苯乙烯微球，这些I结构域在N-或C-末端特异地生物素化。生物素是通过生物素连接酶在特定赖氨酸上酶促引入的(). 我们验证了微球上等量的N-和C-末端连接的I结构域的显示().
具有C端和N端连接的I结构域的类似数量的珠以0.4 dyn/cm的速度在ICAM-1底物上积累2(). C末端附着I结构域的珠子以1和2 dyn/cm的速度进一步累积2(); 相反，具有N末端连接的I结构域的珠子在1和2 dyn/cm时没有积累2(). 此外，带有C末端连接的I结构域的珠子明显更耐分离。在高达8 dyn/cm的壁剪切应力下，C端连接I域的珠子没有分离2(); 相比之下，具有N-末端连接的I结构域的珠在4 dyn/cm时完全分离2发现用5 mM EDTA替换Mg（II）或添加10μg/mL的阻断MHM24抗体来特异性地抑制αL（左）I域消除了微球与基质的所有粘附（未显示）。
用N-或C-末端连接的I结构域修饰的微球在剪切流中的粘附性。将带有通过C末端（A）或N末端（B）生物素标记连接的I结构域的链霉亲和素涂层微球与含有2 mM Mg（II）、0.1%BSA和10μg/mL小鼠IgG1（对照）的PBS中的ICAM-1-Fcγ底物一起注入平行壁流动室。允许在0.3 dyn/cm的壁剪切应力下堆积珠子230秒后，壁面剪应力增加到0.4 dyn/cm2并且每10秒增加一次。（C）所有珠粒的平均滚动速度。条形图显示了三个实验的标准偏差，每个实验有五个重复。
轧制速度的测量结果支持通过C端连接的I域获得更大的粘合强度。使用牢固粘附的操作定义，即每3 s周期内小于胎圈直径一半的运动，C末端附着的I域主要以0.4和1 dyn/cm的牢固粘附介导2在较高的壁面剪应力下，主要是滚动附着力()而N末端连接的I结构域仅介导滚动粘附(). 此外，C端连接的I结构域介导的滚动速度明显慢于N端连接的Ⅰ结构域(). 在0.4 dyn/cm时，C末端附着I畴的珠子的滚动速度慢了2.5倍2以2 dyn/cm的速度减慢11倍2(). 两种焊道的轧制速度均随剪切力线性增加。我们的实验室已经向另一组提供了相同的C末端生物素化I结构域构造，获得了非常一致的定量数据(31).
讨论
在这里，我们测试了这样一个假设，即施加在抵抗外力的配体结合粘附分子上的机械张力可以与蛋白质合金结合，以调节剪切流中的粘附相互作用。我们通过以下方式明确验证了这一假设(1)表达整合素αL（左）锚定在C末端I型TM域或N末端II型TM域的转染剂上的I域和(2)显示αL（左）通过C端或N端生物素标签连接的细胞大小的聚苯乙烯珠上的I域。与II型N端锚定的I结构域相比，I型C端锚定I结构域在剪切流中支持更多的转染剂积累，在剪切流中更大的抗分离阻力，以及较慢的滚动。相比之下，当I结构域通过二硫键稳定在高亲和力构象中时，N端和C端锚定的I结构域转染体表现出相同的强粘附性。通过C-或N-末端生物素标记将野生型I结构域附着到珠子上的结果与野生型、细胞表面锚定的I结构域的结果相似。与N端连接的I结构域相比，C端连接的Ⅰ结构域在更高的剪切力下介导积累，对剪切剥离的抵抗力至少是N端连接Ⅰ结构域的4倍，并且滚动速度较慢约10倍。膜锚定和生物素附着I结构域的类似结果允许我们排除N端和C端连接差异的影响(1)间隔序列不同于膜锚定结构和生物素化结构，以及(2)细胞的特殊特征，如微绒毛、变形能力以及与其他蛋白质的特定相互作用。I型和II型TM-锚定、高亲和力突变体I结构域转染体之间缺乏差异进一步支持了这些结论，并表明野生型I结构域之间的差异是由于力对C末端α螺旋的影响。
因此，我们的结果证明了粘附相互作用的机械化学调节，当适当地将作用力与构象变化的途径联系起来时，可以增强和稳定粘附。结果如图所示当含有I结构域的细胞或珠在剪切流中与底物上的ICAM-1结合时，细胞或珠上的流体动力作用于结合的ICAM1和I结构域分子、它们与细胞/珠和底物的系链（多肽间隔链）以及非共价受体-配体键。这种力是拉伸的，因此倾向于延长分子并分离，从而削弱受体-配体键，导致k个远离的随作用力呈指数级增加(32). 由于I畴的MIDAS金属位于ICAM-1结合位点的中心，因此I畴上张力的方向可以通过穿过MIDAS合金离子和I畴晶体结构中可见的最多C末端或N末端残基的Cα原子的线来很好地模拟(). 在I域变质岩中，连接到链β1的N末端没有运动，链β1在具有321456拓扑结构的β片中作为中心β链牢牢固定。因此，施加在N末端的力不能使一个构象相对于另一构象稳定。相反，在从封闭的低亲和力构象向高亲和力的开放构象转变的过程中，C末端螺旋α7向其C末端轴向位移7Å(17) (). 施加在I域C端的C端螺旋α7位移和张力的矢量在方向上相当相似(). 因此，力沿连接两个平衡构象状态的低势垒轨道施加，并沿稳定高亲和力开放构象的方向施加。因此，当通过C末端连接施加力时，施加力导致的键断裂程度的增加可以通过施加力使I结构域达到高亲和力状态的平衡来部分抵消，从而降低施加力导致键断裂的敏感性。施加力的这种机械化学效应在这里通过更大的分离阻力、更低的轧制速度以及轧制速度的逐渐增加（与N端连接的受体相比，C端的剪切力增加）得到了清楚的证明。
粘附分子的机械化学设计：（A）αL（左）I结构域、（B）P-选择素和（C）αV（V）β三和αIIb类β三头饰。高亲和力、配体（洋红色）和低亲和力、未配体（青色）构象使用在两种构象之间移动很小的主干区域进行叠加。虚线连接Mg2+（A和C）或Ca2+（B） 显示为配体结合位点中心的一个球体，连接到结构对之间共享的最多C末端残基，在完整的粘附分子中，该残基将连接到将粘附分子连接到细胞表面的其他域。图中显示了配体结合位点中的金属与该C末端残基之间的距离，张力将趋于增加。虚线和距离为红色，表示高亲和力、配体构象，蓝色表示低亲和力、无配体构像。实心圆柱强调每个构象中αI域（A）和βI域（C）的α7螺旋的轴。αL（左）I域模型（A）来自参考24和基于参考18和43.P-选择素-EGF结构域（B）来自参考19. αV（V）β三（低亲和力，无亲和力）和αIIb类β三（高亲和力，配体）头部结构（C）来自参考文献15和16.
此前，人们提出并实验支持了“捕捉”、“滑移”和“捕捉-滑移”键行为的概念，并将键寿命随作用力的变化建模为机械化学开关的结果(4,6,33). 然而，开关的机械基础尚不清楚，有人认为它可能位于配体结合位点(4). 在我们的系统中，我们已经控制了这种效应，因为配体结合位点在N端和C端系链I结构域中是相同的。
我们的结果证明了I域机械连接的关键性质，并提供了一个如何设计机械化学开关或变阻器的示例：通过连接以有利于构象变化到更高亲合状态的方式施加张力。一般来说，当施加在机械化学开关或变阻器上的张力有利于更延伸、更高亲和力的构象时，机械化学开关或变阻器将稳定受体-配体键。下面通过对整合素和选择素（血管系统中白细胞粘附的最重要分子）的结构研究进行综述，提出了这一设计原则的生物学相关性；对于整合素和选择素，构象越宽亲和力越高。
选择素以配体结合的形式结晶，与没有配体结晶的分子相比，凝集素和EGF结构域之间的角度发生改变，导致Ca2+在配体结合位点和EGF结构域末端(19) (). 设计用于稳定更广泛构象的突变增加了配体的亲和力(34)，并且已经假设了选择素延伸在支持捕获键行为中的重要性(5); 然而，由于N末端Trp残基位于凝集素-EGF界面的中心，因此，本文所报道的替代力连接的测试尚未完成，也很困难。大肠杆菌凝集素和菌毛结构域之间连接子的突变大肠杆菌膜蛋白调节剪切增强的粘附，而导向分子动力学和突变支持连接子延伸是滚动行为的关键调节器的假设(35).
如晶体结构和电子显微镜所示，缺乏和含有αI结构域的整合素与靠近细胞膜的配体结合位点呈弯曲的低亲和力构象，与距离细胞表面>100Å的配体连接位点呈扩展的高亲和力构像(15,16,36,37). 迄今为止，原子结构可用于孤立的整合素αI结构域()，但不适用于包含αI结构域的完整整合素。在缺乏揭示整合素αI结构域如何插入α亚基β螺旋桨结构域并被β亚基I结构域变构激活的原子结构的情况下(38,39)，我们只能推测外力也可能稳定完整整合素中αI结构域的高亲和力状态。然而，原子结构强烈支持这种βI结构域模型。
βI结构域存在于所有整合素β亚基中，在结构和功能上与整合素α亚基I结构域同源(16,40). βI域也是一个插入域，与混合域有N端和C端连接(). 整合素外域片段的结构可用于在开放、高亲和力状态下与配体结晶，在没有配体的情况下在闭合、弯曲、低亲和力状态结晶(15,16). 配体通过α亚基β螺旋桨结构域和β亚基βI结构域之间的界面结合，配体中的酸性残基与βI结构区MIDAS-Mg配合2+离子(). βI结构域经历了与αI结构域相似的形状变化，βI MIDAS处的配体结合残基重排与C末端螺旋α7的轴向位移耦合。螺旋线α7连接到混合区域的活塞和连杆式运动以及围绕另一个区域的旋转，βI和混合区域之间的曲轴轴承式连接导致混合区域摆动60°(16) (). 此外，在高亲和力状态下，βI结构域MIDAS金属离子上的配体结合位点与两种结构之间最常见的C末端残基之间的距离增加了19Å。此外，βI域螺旋α7位移矢量与作用力矢量很好地吻合(). 整合素通过α和β亚基中的TM结构域锚定在细胞膜上；然而，可以合理地预期，β亚基在抵抗外力方面起着重要作用，因为它是锚定在承载力的细胞骨架蛋白上的亚基，包括大多数整合素β亚基的talin和β的角蛋白4亚单位(40).
单个粘附受体-配体非共价键可以承受100 pN范围内的力(32). 力诱导展开的测量表明，许多域，包括ICAM-1的域1和域2（J.Seog和T.Springer，未发表的结果）(41)，在这一范围内保持其原状。因此，使用晶体结构来近似力载受体-配体复合物可达到的状态并非不合理(). 当用力将粘附分子与其结合的配体分离时，此处描述的粘附分子的机械化学设计将使构象平衡朝着高亲和力、更大范围的构象转变(). 施加的张力将使扩展状态的自由能相对于基态的自由能降低约F类δx个对上述选择素和整合素头盖结构施加10–100 pN张力的计算表明，延伸构象将通过施加在受体上0.5–25 kcal/mol的张力而稳定。这将导致延伸构象的相对数量大幅增加，在张力作用下，高亲和力构象与延伸较小的低亲和力构像相比。施力时有利于高亲和力构象(1)会引起抓键行为(4,6,33,35), (2)将抑制k个远离的通过施加的力(8), (三)将稳定剪切流中的滚动粘附相互作用，并可能解释只有某些类别的受体-配体对才能支持滚动相互作用的发现(10)，以及(4)可以解释细胞粘附和迁移过程中整合素的阻力和机械传递(42).
致谢
我们感谢G.Song博士提供的生物素化蛋白和带有Bir A标签的构建物，感谢L.W.Enquist教授提供的pAB35，感谢T.Jensen博士提供的建议，感谢Natasha Barteneva博士和Ken Ketman博士提供的细胞分类，感谢J.Martin女士提供的手稿准备。
脚注
†由国立卫生研究院资助HL48675。
1缩写：LFA-1，淋巴细胞功能相关抗原-1；细胞间粘附分子-1；MIDAS，金属离子依赖性粘附位点；IgSF，免疫球蛋白表基因家族；淋巴细胞功能相关抗原-3；与血小板衍生生长因子受体跨膜结构域相关的IPDGFR，I结构域；聚合酶链反应；PBS，磷酸盐缓冲盐水；HBSS，Hank的平衡盐溶液；人血清白蛋白；乙二胺四乙酸二乙酯；TM，跨膜；表皮生长因子；异硫氰酸荧光素；IgG，免疫球蛋白G。
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