哺乳动物Notch信号通路直接诱导T淋巴细胞特异性基因表达

摘要

Notch蛋白包含一个跨膜受体家族，在进化过程中一直保持不变，并参与许多组织中的细胞命运决定（有关综述，请参阅Artavanis-Tsakonas等人，1999年；Mumm和Kopan 2000). 哺乳动物Notch通路包括至少四个Notch受体基因(槽口1——槽口4)和多种配体(Jagged1型——杰格德2和三角洲家族）。在配体结合后，Notch蛋白被蛋白质水解分解，释放其细胞内结构域（NICD），该结构域代表Notch受体的激活形式。NICD随后转移到细胞核中，并通过其RAM和锚蛋白结构域结合转录因子CSL[人类CBF1的Su（H）果蝇属和滞后-1英寸秀丽隐杆线虫; 在小鼠中也称为RBP-Jκ]。CSL是一种DNA结合蛋白，通常通过与几个辅抑制复合物的相互作用来抑制转录。NICD的结合将CSL转化为转录激活物，从而诱导靶基因的表达，尤其是转录抑制因子的Hes家族。Hes蛋白反过来调节组织特异性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的活性，进一步传播Notch信号的影响。在果蝇属，许多基因通过NICD/CSL复合物与其调控区域的结合，由Notch信号直接诱导(Bray和Furriols 2001). 老鼠也有类似的机制赫斯1基因，Notch的一般下游效应子(Jarriault等人，1995年). 然而，在哺乳动物系统中很少发现组织特异性Notch靶点，Notch诱导它们的机制仍不清楚。

几项研究揭示了Notch1受体信号在淋巴祖细胞向胸腺T细胞谱系承诺中的重要、非冗余作用（综述见Anderson等人，2001年；冯·博默2001). 例如，有针对性地中断槽口1(Radtke等人，1999年)或其下游效应器赫斯1(Tomita等人，1999年)在早期阶段阻止T细胞发育。相反，骨髓中的Notch信号引导造血前体接受T细胞命运(Pui等人，1999年；Jaleco等人，2001年). 除了其在T细胞承诺中的强制性作用外，Notch活性可能随后有利于T细胞受体（TCR）αβ承载T细胞的规范化，而不是TCRγδ承载T细胞(Washburn等人，1997年). 然而，Notch调控早期T细胞发育的分子基础在很大程度上尚不清楚。

最近TCR前α链基因(磷酸)被确定为T细胞中Notch信号的转录靶点(Deftos等人，2000年).磷酸编码一种跨膜蛋白，与新重排的TCRβ链配对，在发育中的T细胞中形成必要的TCR前信号复合物(von Boehmer和Fehling 1997年). 这个磷酸该基因在未成熟T细胞中表达，其上调与小鼠和人类胸腺前体中的不可逆T细胞谱系承诺一致(Res and Spits 1999年；罗森伯格2000). 此外，磷酸αβ而非γδT细胞发育需要(Fehling等人，1995年)，并可通过提供来自TCR前的指导信号促进αβ谱系承诺(Aifantis等人，1998年). 的表达和功能磷酸因此与Notch活性一致，进一步表明磷酸代表Notch的T细胞特异性功能靶标。为了深入了解Notch信号对阶段和组织特异性基因表达的调节，我们研究了Notch介导的磷酸诱导发育中的T淋巴细胞。

结果

pTa增强子包含CSL结合位点

之前，我们确定了上游磷酸增强剂(Reizis和Leder 1999)这在小鼠和人类之间是保守的，并且似乎对纠正来说既必要又充分磷酸T细胞表达(Reizis和Leder 2001). 如图所示​图1A，1A、 与一致的CSL结合序列（CGTGGGAA）同源的保守位点（CCTGGGAB）；Tun等人，1994年)在核心增强子区域内被鉴定。此外，在人类下游30 bp处发现了相同的序列，但在小鼠增强子中没有发现。为了测试这些位点结合CSL的能力，使用体外翻译的FLAG标记的人类CSL蛋白，在电泳迁移率变化分析（EMSA）中测试相应的短寡核苷酸探针。如图左侧面板所示​图1B，1B、 CSL蛋白和小鼠增强子位点（mE）形成一个复合物，可以被抗FLAG抗体超转移。人类增强子部位和已知的CSL结合位点（来自赫斯1启动程序（图。​（图1B，1B、 中间面板）。相比之下，这三个磷酸图中所示的含有突变的增强子位点​图1A1A无法绑定CSL。这些数据证实了CSL蛋白和来自磷酸增强剂。此外，当mE位点与T细胞核提取物孵育时，形成了类似迁移率的复合物（图。​（图1B，1B、 右侧面板）。这种复合物的形成被未标记的赫斯1位点和野生型mE位点，而不是突变的mE位点。尽管由于可用的抗CSL抗体质量不足，无法进行超位移实验，但观察到的复合物的大小和特异性与CSL一致。此外，未观察到与其他核因子的额外复合物。这些结果表明，但并不能证明，CSL可能是与来自磷酸增强剂。

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图1

CSL结合位点磷酸增强剂。(A类)小鼠（m）和人类（h）增强子核心序列的比对。先前确定的结合位点用方框标出，潜在的CSL结合位点用阴影方框标出。引入CSL位点的突变显示在位点旁边。(B)CSL与站点的绑定磷酸增强剂。EMSA使用放射性标记的寡核苷酸探针进行，得到的CSL–DNA复合物用箭头表示。探针包括来自赫斯1启动子（HES），小鼠磷酸增强子（mE）和人类5′和3′位点磷酸增强子（分别为hE5′和hE3′）。相应的探针携带如图所示的突变A类用星号（mE*、hE5′*和hE3′*）表示。(左侧面板）在存在抗FLAG抗体或对照抗体（ctrl.）的情况下，用mE探针培养体外翻译的CSL或对照翻译反应（–）。(中部面板）体外翻译的CSL与指示的探针孵育。(赖特面板）BW5147细胞的核提取物与mE探针在10倍和100倍摩尔过量的未标记竞争探针（C）存在下孵育。

缺口诱导pTa增强子

要测试磷酸增强子可以被Notch信号激活，我们瞬时表达包含增强子片段和NICD表达载体的报告结构。为了降低增强子的背景活性，我们使用了T细胞特异性调节元件通常不活跃的细胞，如人类胚胎肾细胞系293。如图所示​图2A，2A、 老鼠磷酸位于同源启动子上游或异源TATA盒上游的增强子受到NICD的弱但可重复诱导。此外，人类磷酸该增强子被NICD强烈激活，与CSL结合位点的存在一致。未观察到其他特征明确的T细胞特异性调节元件的诱导作用，如TCRβ和TCRδ增强剂和lck公司近端启动子，而短启动子赫斯1含有关键CSL结合位点的启动子片段被强烈诱导。重要的是，小鼠中单个CSL结合位点的突变磷酸人类CSL结合位点的增强子磷酸增强子完全消除了NICD对其的诱导作用。这种特定的归纳法磷酸NIH3T3成纤维细胞和磷酸-阴性成熟T细胞系BW5147（数据未显示）。两者的归纳赫斯1发起人和磷酸在NICD的RAM域缺失时，增强子也同样减少，后者介导与CSL的相互作用。此外磷酸NICD的增强子被一种不能结合DNA的显性阴性CSL形式抑制（数据未显示）。总之，这些结果显示了特定的诱导磷酸Notch信号转导的增强子活性取决于CSL与其增强子中结合位点的相互作用。

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图2

诱导磷酸NICD的增强子。用报告基因构建物和NICD表达载体转染细胞系293。测定了NICD或空表达载体存在时的正常报告活性，其比值表示为NICD的折叠诱导。结果表示三个独立实验的平均值+SD。报告结构包含小鼠上游的指示增强子片段磷酸发起人(磷酸)或的SV40型启动子TATA盒（TATA）。老鼠(最大允许偏差)或人类(羟丙基钽)pTa增强子要么是野生型，要么包含图中所示的突变​图1A1A类(英里/小时马特。，羟丙基钽）。

由于NICD的强大诱导作用，在随后的实验中，我们将注意力集中在人类磷酸增强剂。进一步探讨Notch介导的机制磷酸增强子诱导，我们测试了一组截短的增强子片段。图​图3A三A表明，与全长增强子相比，含有两个CSL结合位点的短增强子片段未被Notch激活。5′端或3′端的缺失仅对诱导产生轻微影响。然而，缺失3′侧翼区域的片段的5′缺失逐渐降低了对背景水平的诱导。这些数据表明，Notch诱导需要CSL位点和侧翼增强子区域，5′和3′区域以冗余方式促进诱导。

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图3

Notch介导的诱导和磷酸增强子片段。用含有指示人类的报告构建物转染细胞磷酸增强子碎片位于TATA盒上游。CSL结合位点（位置188-95和224-31）显示为阴影条，星号表示这些位点的突变，如图所示​图1A。1A.结果代表三个独立实验的平均值+SD。(A类)归纳磷酸NICD在293个细胞中测定的增强子片段如图所示​图2。2. (B)磷酸未成熟T细胞系LR1中的增强子片段被确定为报告活性与无增强子报告载体活性的比率。

接下来，我们试图定义磷酸在未成熟T细胞中介导其Notch反应性及其特异性活性的增强子。图​图3B三B说明了pTaa中的增强子片段磷酸-阳性未成熟T细胞系LR1。CSL结合位点的突变大大降低了Notch的诱导作用（图。​（图2A），2A） 只导致未成熟T细胞中增强子活性的中度降低。相反，5′缺失完全消除了内源性增强子的活性，尽管它们对Notch的诱导有边际效应（图。​（图3A）。三A） ●●●●。这与5′增强子区域中存在的c-Myb结合位点和其他未知位点一致。这些数据证实，增强子通过单独的结合位点整合来自T细胞特异性转录因子和Notch/CSL途径的信号。

CSL结合位点是T细胞承诺期间pTa表达开始所必需的

测试CSL结合位点在调节磷酸在体内表达，我们在一个完整的环境中突变了这些位点磷酸轨迹。为此，我们引入了EGFP公司记者走进人类磷酸113 kb基因组BAC克隆中的基因，然后突变磷酸增强器（图。​（图4A）。4A） ●●●●。使用含有野生型或突变增强子（分别构建EGFP-Ewt和EGFP-Emut）的BAC克隆生成转基因报告小鼠。建立每种类型的多个转基因株系，并分析其表达EGFP公司流式细胞术检测淋巴细胞。

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图4

生成转基因报告小鼠以检测体内CSL位点的功能。(A类)人类改造策略磷酸细菌中同源重组位点。编码区、UTR和上游增强子磷酸分别显示为黑色、白色和垂直渐变框。原核选择标记(厘米^第页和Zeo公司^第页)用灰色方框表示。这个EGFP公司基因（椭圆梯度盒）和polyA信号（pA，白盒）被引入第一个pTa基因组BAC克隆内的外显子。随后，两个CSL位点（垂直条）的突变被引入pTa增强剂。重组和Flp介导的切除后铝将增强子重复3′替换为单个FRT位点（黑色三角形）。结果构建物包含野生型（EGFP–Ewt）或突变型（EGFP–Emut）增强子序列。(B)修改后的表达式磷酸转基因小鼠的基因座。图示为EGFP–Ewt转基因小鼠（阴影迹线）和对照非转基因小鼠（空白迹线）的指示淋巴细胞亚群中EGFP荧光直方图。(左侧胸腺细胞亚群定义如下：DN（CD3^负极CD4细胞^负极CD8（CD8）^负极)、ISP（CD3^负极CD4细胞^负极CD8（CD8）⁺)，大DP（大CD3^负极CD4细胞⁺CD8（CD8）⁺)，小DP（小CD3^−/低CD4细胞⁺CD8（CD8）⁺)和SP（CD3^高的CD4细胞⁺CD8（CD8）^负极和CD3^高的CD4细胞^负极CD8（CD8）⁺). (赖特其他淋巴细胞亚群包括脾T细胞（CD3^高的)、NK细胞（NK1.1⁺)，脾B细胞（B220⁺CD3（CD3）^负极)，骨髓（BM）B细胞（lin⁺B220型⁺)和骨髓谱系标记阴性细胞（lin^负极B220型^负极).

的表达式EGFP公司通常是低水平和异质的，每个群体中只有一小部分细胞显示绿色荧光（图。​（图4B，4B中，​B、 5）。5). 这种弱表达可能是由于人类的内在活动较低磷酸增强剂(Reizis和Leder 2001); 此外，不能排除我们的BAC改造方案引起的技术问题。然而，在大多数转基因株系中都清楚地检测到EGFP信号（EGFP-Ewt的9株中有7株，EGFP-Emut的5株中有4株），并且它始终遵循图中所示的模式​图4B。4B。EGFP公司在最早的双阴性（DN，CD4）中表达水平最高^负极CD8（CD8）^负极)胸腺细胞前体，然后在随后的未成熟单阳性（ISP、CD4^负极CD8（CD8）⁺)，双阳性（DP，CD4⁺CD8（CD8）⁺)，和成熟单阳性（SP，CD4⁺CD8（CD8）^负极或CD4^负极CD8（CD8）⁺)胸腺细胞发育阶段。外周血淋巴细胞（包括T、B和自然杀伤（NK）细胞）以及骨髓中未成熟的血统阴性细胞和发育中的B细胞呈EGFP阴性。这种表达模式与小鼠的表达模式一致pTaBAC转基因(Reizis和Leder 2001)和的磷酸基因本身(von Boehmer和Fehling 1997年)确认人类的适当调节磷酸转基因。EGFP-Ewt和EGFP-Emut结构体均以相同的方式表达，表明在谱系特异性或转基因表达下调方面没有差异（数据未显示）。

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图5

EGFP公司报告基因在最早胸腺细胞亚群中的表达。(A类)胸腺细胞用mAb与谱系标记物混合染色，谱系阴性胸腺细胞（总数的1%–2%）根据CD44和CD25的表达进行门控，如左侧密度图所示。所示为来自对照非转基因小鼠或代表性转基因小鼠的门控DN胸腺细胞亚群（DN1-DN4）中EGFP荧光的直方图。对数刻度用于Y（Y）轴以便于不同子集之间的比较。(B)对每种类型的三个独立转基因系的小鼠进行上述染色，并测定每个DN亚群中EGFP阳性细胞的百分比。对照野生型胸腺细胞在每个亚群中含有<0.5%的阳性细胞。代表性染色结果显示为EGFP–Ewt（开放圆）和EGFP-Emut（填充圆）线之间的成对比较，整体水平相似EGFP公司表达式。(C)来自与A类用单克隆抗体对谱系标记CD25和CD44或CD117进行染色。图中显示了血统阴性CD25中EGFP与CD117或CD44荧光的等高线图⁺细胞包括亚群DN2和DN3。水平线显示非转基因对照小鼠的基线EGFP荧光，垂直虚线定义CD44/CD117^高的（DN2）子集。

接下来，我们比较了EGFP-Ewt和EGFP-Emut构建物在DN胸腺细胞中的表达，其中包括最早的T细胞前体经历T细胞承诺、αβ/γδ细胞命运选择和前TCR信号。根据细胞表面标记物CD25和CD44以及CD117（c-kit）受体的表达，DN人群可细分为至少四个亚群(肖特曼和吴1996). DN1（CD25^负极CD44细胞⁺CD117号⁺)亚群包括最早的多功能胸腺前体细胞，其上调CD25并在DN2（CD25⁺CD44细胞⁺CD117号⁺)阶段。这些细胞随后下调CD44和CD117成为DN3（CD25⁺CD44细胞^负极CD117号^低的)经历TCR重排和TCR前信号传导的细胞。后一事件导致CD25的丢失和DN4（CD25）的快速增殖^负极CD44细胞^负极CD117型^负极)然后进入ISP和DP阶段。主要上调磷酸表达发生在DN2期，与T细胞结合相一致(von Boehmer和Fehling 1997年；罗森伯格2000).

图​图5A5A表示EGFP公司在DN胸腺细胞亚群中EGFP–重量和EGFP–表情转基因株系。正如预期的那样EGFP–重量转基因在DN1细胞中几乎检测不到，在DN2亚群中强烈诱导。然而EGFP–表情转基因在DN2细胞中仅略微上调，而在DN3期达到表达高峰。这些表达式模式如图所示​图5B，5B、 它显示了EGFP–重量和EGFP–表情表现出类似EGFP总体水平的转基因株系。事实上，每个构建体在多个行中显示了相同的表达谱，与表达水平无关。延迟发病EGFP–表情转基因表达在门控CD25中进一步明显⁺包含DN2和DN3子集的DN单元（图。​（图5C）。5C） ●●●●。当与CD44或CD117作图时，EGFP在CD25内均匀分布⁺人口来自EGFP–重量转基因小鼠（凸起图）。相反，EGFP仅在较成熟的CD44中检测到^低的或CD117^低的CD25细胞⁺来自的单元格EGFP–埃穆特转基因小鼠（凹面图）。这些差异EGFP公司在成人和胎儿转基因DN胸腺细胞中均观察到表达。总之，这些数据表明CSL结合位点是阶段特异性诱导磷酸T细胞承诺表达。

讨论

我们的结果表明，Notch信号可能诱导其T细胞特异性靶基因磷酸通过CSL结合位点磷酸增强剂。一些组织特异性哺乳动物基因的调控元件已被证明含有CSL结合位点(白桦等人，1996年；Chen等人，1997年；Kannabiran等人，1997年；Lam和Bresnick 1998年；Oswald等人，1998年)，在某些情况下由NICD诱发(Chen等人，1997年；Oswald等人，1998年). 然而，尚不清楚这些基因是否代表Notch信号传导的真正靶点，CSL位点在体内的作用尚未研究。相反，磷酸NICD在细胞系和转基因胸腺细胞中上调(Deftos等人，2000年). 此外，我们还发现CSL结合位点在磷酸NICD体外诱导和阶段特异性诱导需要增强子磷酸体内表达。因此，磷酸似乎代表了一种可由NICD/CSL与其远端调控元件结合直接诱导的模型组织特异性哺乳动物Notch靶点。

Notch应答增强子可能通过Notch/CSL途径以及其他信号通路和转录因子的不同结合位点进行调节(Flores等人，2000年). 同样，我们可以将磷酸调节未成熟T细胞内在活性及其Notch反应性的增强子。此外，我们发现增强子的侧翼区域可能促进NICD的激活。这种效应不太可能涉及与CSL位点合作的任何特定位点，因为不同大小的5′和3′侧翼片段都是有效的。同样，没有观察到与内在增强子活性的相关性：例如，3′侧翼区域促进了NICD的诱导（参见图中的片段169-237和169-362。​图3A）三A） 但对T细胞中的增强子活性来说是不必要的（图。​（图3B）。三B） ●●●●。侧翼区域的不同碱基组成可能使增强子更容易被NICD/CSL复合物所接近。的确，人类和老鼠磷酸增强子富含65%G/C，人类增强子的200-bp核心富含75%G/C。相比之下，只有最小的60 bp片段赫斯1在我们的实验中，含有CSL结合位点的启动子被NICD有效激活。这些数据突出了整合包括Notch在内的多种信号的组织特异性增强子与专门的Notch响应元件（如赫斯1发起人。

来自Notch1受体的信号似乎对T细胞谱系的规范至关重要。在小鼠胸腺中，T细胞的结合被认为发生在DN2期，其特征是获得CD25标记和上调磷酸表达式。因此，在没有Notch1的情况下，DN2子集的开发被废除(Radtke等人，1999年)或Hes1(Tomita等人，1999年)，因此可能由Notch活动引起。事实上，我们发现槽口1mRNA在DN1亚群中表达最高，而赫斯1在DN1和DN2亚群中大量表达，随后减少（B.Reizis、P.Leder、F.Gounari和H.von Boehmer，未提交）。与此相一致，我们发现CSL结合位点的突变消除了磷酸在DN2处转基因，但对其后续表达没有明显影响。这些数据突出了T细胞承诺期间发生的Notch活性脉冲，并诱导了T细胞特异性基因表达程序。这种诱导可能涉及多种间接机制，包括Hes1的活性(Tomita等人，1999年)和Deltex(Deftos等人，1998年)以及抑制bHLH蛋白如E2A(Pui等人，1999年). 此外，我们的数据表明，至少一些T细胞特异性基因可能由NICD/CSL反式激活复合物直接诱导。

Notch诱导性在小鼠和人之间的保守性磷酸增强子暗示了这种作用的功能意义。可以假设，及时的Notch介导诱导磷酸在T细胞承诺后需要提供最佳水平的pTa蛋白用于在随后阶段组装前TCR复合物。在这种情况下，缺陷的Notch信号将延迟pTa的积累和前TCR的形成，从而损害αβT细胞的发育。相反，γδT细胞不使用前TCR，也不受Notch信号差异的影响。因此，Notch-induced磷酸T细胞承诺期间的表达可能有助于活化Notch选择性促进αβT细胞的发育(Washburn等人，1997年).

材料和方法

致谢

脚注

工具书类