确定自然种群的遗传结构金黄色葡萄球菌多焦点序列分型与脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性DNA分析和噬菌体分型的比较

摘要

金黄色葡萄球菌是临床上最重要的病原体之一。它也是医院感染和多药耐药菌株传播的主要原因之一，主要是耐甲氧西林菌株金黄色葡萄球菌耐万古霉素耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）最近的出现引起了世界各地医院的关注。自然，了解传播动力学和确定传播或疫情不仅对公共卫生流行病学家感兴趣，而且对临床微生物学家和实际上参与日常患者管理的临床医生也感兴趣。大多数当前的流行病学分型方案比较了染色体DNA限制或扩增产生的片段模式，或基于对裂解噬菌体敏感性的裂解模式差异。所有这些方法都能够区分无关菌株（尽管精度不同），但如果不了解自然发生人群的潜在遗传结构，就无法确定两种无法区分的模式预测流行病学关系（即传播）的概率。为了描述细菌种群的遗传结构和特定环境中某些克隆的丰度，诸如多点序列分型（MLST）等分型工具提供了一个全面的遗传框架(1,6)。我们使用MLST和其他三种常规流行病学分型方法来描述从社区非住院患者中系统收集的菌株的遗传群体结构。通过这种方法，我们能够客观地评估为流行病学目的而部署的分型技术的价值。

材料和方法

菌株金黄色葡萄球菌从大诺丁汉健康区（英国诺丁汉郡）非住院老年人（≥65岁）的代表性样本中分离出鼻携带(三)。一个随机样本（257个菌株中的117个）接受了四种不同的分型技术，包括MLST、脉冲场凝胶电泳（PFGE）(Sma公司I宏观限制性分析）、随机扩增DNA分析（RAPD）和噬菌体分型。所有的分型方法都是按照标准化出版的协议进行的(1,9,11)，并根据传统标准对基因型进行分类(1,4,7,10)。PFGE的标准化协议可在公共卫生实验室服务网站上找到(http://www.phls.org.uk/inter/harmonic/New%20PFGE%20protocol.pdf)。使用BioNumerics软件的统计套件（Applied-Maths，比利时根特）存储、处理和分析键入结果。多样性指数，定义为随机选择的两个分离物属于不同类型的概率，用于测量特定类型的生物体在所携带菌株群体中出现的频率，同时作为相关分型方法辨别能力的无偏估计(5,8)。如前所述，计算了判别指数的置信区间(2).

结果

PFGE公司。

Sma公司当三个或更多的谱带差异指示不同的类型时，我的宏观限制分析确定了57种PFGE类型。该方法对社区中个体携带菌株的鉴别能力为97.6%（96.8%至98.5%），与MLST相比有所提高，但差异不显著（表​（表1）。1)。重要的是，PFGE和MLST的结果高度一致。通过MLST和BURST分析确定为克隆复合体的大多数分离物（105个中的98个），在使用基于带的相似性值进行未加权成对群平均分析（UPGMA）聚类后，也在PFGE树状图中聚类（图。​（图1），1)因此，PFGE模式在克隆复合物中最多有五个谱带不同。

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图1。

UPGMA树状图，说明宏观限制条件的相似性（基于Dice系数）(Sma公司一） （PFGE）共117株金黄色葡萄球菌由社区中的个人携带。顶部的刻度显示相似性百分比。缩写：CC，MLST和BURST分析定义的克隆簇；ST，序列类型（MLST）；#，隔离数；sg，未在克隆簇中分组的单体。

表1。

117分型结果比较金黄色葡萄球菌社区中个人携带的菌株^一

方法	可打印性（%）	类型的数量	辨别能力（%）（CI95)b条	方法之间的总体相关性				组冲突（%）
				MLST公司	PFGE公司	RAPD系统	噬菌体分型
MLST公司	100	46	95.7（94.4-97.1）	1
PFGE公司	100	57	97.6 (96.8-98.5)	0.67	1			21.6
RAPD标记	100	16	85.7 (82.9-88.6)	0.53	0.27	1		49.4
噬菌体分型	76.1	23	80.9 (75.5-86.3)	0.11	0.04	0.12	1	86.9

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^一菌株与疾病爆发无关。

^b条CI公司₉₅，95%置信区间。

讨论

我们选择了一种基于计算机的算法，该算法将克隆复合体定义为一组，其中每个分离物在MLST识别的七个位点中的五个或多个与至少一个其他分离物相同。这种方法通过应用简单的系统发育规则来实现合理的分类。相反，当需要指定明确的类型时，基于带的分型技术（如宏观限制分析或RAPD）面临困难，因为其他匿名带位置的逐渐变化使得指定具有任意性。个体携带菌株的遗传群体结构以少数克隆复合物为主。此外，遗传多样性与牛津郡最近收集的医院和社区获得的疾病分离物样本没有显著差异（N.P.日，个人通讯）。因此，没有证据表明MLST与以下假设相矛盾，即来自侵袭性疾病病例的分离物代表来自金黄色葡萄球菌人类鼻内携带菌株。通过研究人类携带的自然发生菌株的频率，我们还能够确定当从两个不同的携带者中分离出一对不可区分的菌株时，每种分型方法可以确定流行病学关联（例如人对人传播）的阳性预测值，有人会将区分能力的较低置信值视为对此效果的保守估计。当我们为临床从业者或日益知情的公众解释分型结果时，我们认为这是极有价值的信息。显然，MLST和PFGE是最强大的高精度流行病学分型技术，当需要确定人际传播的发作时。然而，快速且能够处理大量菌株的RAPD和噬菌体分型似乎不适合这一目的。最重要的是，MLST提供了一个充分的工具，可以为大量分离株生成遗传图谱，尤其是在非流行情况下，即为国家参考服务或在比较大型国际菌株收集时。

我们发现，基于DNA的分型方案得出了非常相似的结论，结合不同的技术不会增加对金黄色葡萄球菌在很大程度上。此外，PFGE模式似乎可以从理论上预测克隆复合物，表明葡萄球菌基因组不同区域存在大致一致的系统发育信号。未来的工作应该确定信息量最大的核苷酸序列，这些序列可能构成多功能菌株命名的基础金黄色葡萄球菌.

参考文献