From the Cover: Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells

Muhammad Al-Hajj; Max S. Wicha; Adalberto Benito-Hernandez; Sean J. Morrison; Michael F. Clarke

doi:10.1073/pnas.0530291100

美国国家科学院院刊。2003年4月1日；100(7): 3983–3988.

2003年3月10日在线发布。数字对象标识：10.1073/pnas.0530291100

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PMID：12629218

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致瘤性乳腺癌细胞的前瞻性鉴定

穆罕默德·哈吉,^* 马克斯·维查,^* 阿达尔贝托·贝尼托·埃尔南德斯,^† 肖恩·莫里森,^*^‡^§和迈克尔·克拉克^*^‡^¶

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摘要

乳腺癌是美国女性最常见的恶性肿瘤，每年死亡人数超过40000人。这些乳腺肿瘤由表型多样的乳腺癌细胞群组成。使用一种在免疫功能低下小鼠中培养人类乳腺癌细胞的模型，我们发现只有少数乳腺癌细胞具有形成新肿瘤的能力。我们能够根据细胞表面标记物的表达区分致瘤性（肿瘤起始）和非致瘤性癌细胞。我们前瞻性地将致瘤细胞鉴定并分离为CD44⁺CD24型^−/低血统⁻在9名患者中有8名患者。只有100个具有这种表型的细胞能够在小鼠体内形成肿瘤，而数万个具有不同表型的细胞未能形成肿瘤。致瘤亚群可以连续传代：每次该亚群中的细胞生成含有额外CD44的新肿瘤⁺CD24型^−/低血统⁻初始肿瘤中存在致瘤细胞和表型多样的非致瘤细胞混合群。前瞻性识别致瘤癌细胞的能力将有助于阐明调节其生长和存活的途径。此外，由于这些细胞推动肿瘤的发展，针对这些人群的策略可能会导致更有效的治疗。

尽管转移性乳腺癌的检测和治疗取得了进展，但该病的死亡率仍然很高，因为目前的治疗受到耐药癌细胞出现的限制(1,2). 因此，根据目前的治疗策略，转移性乳腺癌仍是一种不治之症。癌症被认为是由遗传不稳定和/或环境因素导致的一系列连续突变引起的(三,4). 更好地了解这些突变对肿瘤细胞潜在生物学的影响可能会导致新的治疗策略。

在实体肿瘤中，已经证明只有一小部分肿瘤细胞能够在在体外克隆形成试验(5–11). 此外，为了在异种移植模型中形成肿瘤，通常必须移植大量细胞。对这些观察结果的一个可能解释是，肿瘤内的每个细胞都有增殖和形成新肿瘤的能力，但单个细胞完成这些分析中必要步骤的可能性很小。另一种解释是，只有一种罕见的、表型不同的细胞亚群具有显著增殖和形成新肿瘤的能力，但该亚群中的细胞具有非常有效的增殖能力(12). 为了区分这些可能性，有必要用将这些细胞与其他非致瘤细胞区分开来的标记物来鉴定这些肿瘤中的致克隆细胞。该鉴定已在急性髓细胞白血病中完成，在非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）患者中，白血病细胞（表达与正常造血干细胞类似的标记物）的特定亚群持续富集，具有克隆生成活性免疫功能低下的小鼠，而其他癌细胞则缺乏克隆形成活性(13–15). 此类实验在实体癌中未见报道。如果这一模型也适用于实体肿瘤，并且肿瘤中只有一小部分细胞具有增殖和形成新肿瘤的能力，那么这一发现将对理解这些肿瘤的生物学和制定治疗策略具有重要意义。

为了研究实体瘤异质性的机制，我们改进了NOD/SCID小鼠模型，其中人类乳腺癌在小鼠乳腺脂肪垫中高效繁殖(16). 在本研究中，我们发现实体肿瘤包含独特的细胞群，它们具有在小鼠体内形成肿瘤的唯一能力。我们将这些细胞称为致瘤细胞或致癌细胞，因为它们持续形成肿瘤，而其他癌细胞群则缺乏能够形成肿瘤的细胞。我们确定了能够区分这些细胞群的细胞表面标记。我们的发现提供了一个以前没有特征化的乳腺肿瘤生物学模型，其中定义的细胞子集驱动肿瘤发生，并产生肿瘤细胞异质性。对这种致癌细胞群体的前瞻性鉴定应考虑到对这些细胞中表达的分子的鉴定，这些分子可以作为消除这一临界癌细胞群体的靶点。

材料和方法

小鼠准备。

通过腹膜内注射0.2ml氯胺酮/甲苯噻嗪（300mg氯胺酮与20mg甲苯噻嗪合并，体积为4ml；每20g小鼠使用0.02ml溶液）麻醉8周龄雌性NOD/SCID小鼠。使用Hanks的平衡盐溶液（HBSS）稀释至200μl。然后，通过腹腔注射给小鼠注射VP-16（足叶乙甙）（每1 kg小鼠30 mg足叶乙苷剂量，在无血清HBSS中稀释，最终注射量为200μl）。同时，用套管针将雌激素丸皮下注射在小鼠颈部背面。所有肿瘤注射/植入均在手术后5天进行。在以下程序中，始终按照上述方法对小鼠进行麻醉。

原发肿瘤标本植入。

为了植入新鲜标本，在手术后一小时内收到了人类乳腺肿瘤的样本。用剪刀将肿瘤切成小块，然后用刀片将其切碎，得到2×2mm的块。在无菌RPMI培养基1640中，在冰上的无菌条件下进行粉碎。植入前用无血清HBSS清洗肿瘤块。然后在中腹部区域做一个2毫米的切口，用套管针将一到两个小肿瘤块植入右上和左上乳腺脂肪垫区域（两侧第二个乳头的右下方）。在乳房脂肪垫乳头周围缠绕了两圈6-0的缝合线，使其能够将植入的部分固定到位。5天后拆线。使用奈沙班封闭切口，每周监测小鼠肿瘤生长情况。

胸腔积液注射。

对于胸腔积液的注射，在胸腔穿刺后不久接受细胞，并用无血清HBSS清洗。然后将细胞悬浮在无血清RPMI/Matrigel混合物（1:1体积）中，然后使用22号针头将其注射到右上和左上乳腺垫中。通常注射0.2ml的量，含有100万到200万个细胞。针头注射部位用内沙班密封，以防止任何细胞泄漏。

肿瘤细胞单细胞悬液的制备。

在用胶原酶消化之前，异种移植瘤或原发性人类肿瘤被切成小块，然后用无菌刀片完全切碎。为了获得单细胞悬浮液，然后将胸腔积液细胞或产生的肿瘤碎片与超纯胶原酶III在介质199（每毫升200–250单位胶原酶）中混合，并允许在37°C下培养3–4小时。每隔15–20分钟用10毫升移液管移液一次。培养结束时，细胞通过45-μl尼龙网过滤，用RPMI/20%FBS洗涤，然后用HBSS洗涤两次。然后将待注射的细胞悬浮在HBSS/Matrigel混合物（1:1体积）中，并如上所述注入乳腺脂肪垫区域。使用奈沙班密封注射部位。

用于流式细胞术的细胞染色。

对细胞进行计数，然后转移到5 ml试管中，用含2%热灭活小牛血清（HICS；1000 rpm下5分钟）的HBSS冲洗两次，然后在100μl中重新悬浮（每10分钟⁶细胞），含2%HICS。然后添加5微升Sandoglobin溶液（1 mg/ml），并在冰上孵育10 min，然后用HBSS/2%HICS清洗样品两次，并在100μl（每10μl⁶电池），HBSS/2%HICS。然后添加抗体（每个抗体的适当稀释度），并在冰上孵育20分钟，然后用HBSS/2%HICS清洗两次。当需要时，通过重新消耗100μl（每10μl）进行二次抗体添加⁶细胞），然后添加1–4μl二级抗体（取决于二级抗体及其浓度），然后培养20分钟。当使用链霉亲和素步骤时，细胞在100μl（每10⁶然后添加1μl与所示荧光染料结合的链霉亲和素，然后进行20分钟的培养。用HBSS/2%HICS清洗细胞两次，并将其重新悬浮在含有7-氨基放线菌素D（7AAD，1μg/ml最终浓度）的0.5ml（每百万细胞）HBSS/2%HICS中。

流式细胞术。

使用的抗体是抗CD44[别藻蓝蛋白（APC）、藻红蛋白（PE）或生物素]、抗CD24（PE或FITC）、抗B38.1（APC）、抗上皮特异性抗原（ESA）-FITC（Biomeda，Foster City，CA）和抗H2K^d日（法尔敏根）。血统标记抗体为抗CD2、-CD3-CD10、-CD16、-CD18、-CD31、-CD64和-CD140b。除非另有说明，抗体是从PharMinen购买的。根据实验，抗体直接与各种荧光色素结合。在所有实验中，小鼠细胞和/或世系⁺细胞通过丢弃H2K被清除^d日+（小鼠组织相容性I类）细胞或世系⁺流式细胞术中的细胞。使用活性染料7AAD去除死细胞。流式细胞术在FACSVantage（Becton Dickinson）上进行。侧面散射和前向散射剖面用于消除细胞加倍。细胞常规分选两次，并对细胞进行再次分析以获得纯度，通常纯度大于95%。

结果和讨论

肿瘤标本和移植率。

从9名不同患者的原发或转移部位获得的人类乳腺癌标本[指定肿瘤1-9（T1-T9）]均植入NOD/SCID小鼠（表（表1）。1). 在一个病例中，癌细胞取自原发性乳腺肿瘤（T2），而在其他病例中，细胞取自转移性胸腔积液（T1和T3–T9）。一些实验是在小鼠体内传代一次或两次后对细胞进行的（指定的第1代和第2代），而其他实验是在直接从患者处获得的未经传代的新鲜或冷冻肿瘤样品上进行的。在使用小鼠体内传代肿瘤中的人类癌细胞时，通过消除H2K去除了污染的小鼠细胞⁺细胞（小鼠组织相容性I类）。

表1

人乳腺癌在NOD/SCID小鼠体内的移植

肿瘤	原产地	小鼠体内的形成	小鼠通过	诊断
T1类	转移	是的	是的	浸润性导管癌
T2段	乳房初级	是的	是的	腺癌
T3航站楼	转移	是的	是的	侵袭性小叶癌
T4类	转移	是的	不	侵袭性小叶癌
T5类	转移	是的	是的	侵袭性小叶癌
第6页	转移	是的	是的	炎症性乳腺癌
第7天	转移	是的	是的	侵袭性小叶癌
T8型	转移	是的	是的	炎症性乳腺癌
T9	转移	是的	是的	腺癌

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给小鼠注射未分类的T1和T3细胞以及2 mm的T2片段。如图所示，通过流式细胞术分离T4–T9细胞。图1。1所有9个肿瘤均植入我们的NOD/SCID小鼠模型。除原发性乳腺肿瘤T2外，其他肿瘤均为转移瘤。除T4外，所有肿瘤均在小鼠体内连续传代

肿瘤标志物的鉴定。

乳腺癌细胞在多种细胞表面标记物（包括CD44、CD24和B38.1）的表达方面存在异质性。CD24和CD44是粘附分子，而B38.1被描述为乳腺/卵巢癌特异性标记物(17–19). 为了确定这些标记物是否能够区分致瘤细胞和非致瘤细胞，使用流式细胞术从第1代T1或T2细胞中分离出每个标记物阳性或阴性的细胞。当2×10⁵至8×10⁵注射每个群体的细胞，所有注射CD44⁺电池（8/8），B38.1⁺细胞（8/8）或CD24^−/低细胞（12/12）在注射后12周内产生可见的肿瘤，但CD44没有⁻电池（0/8），或B38.1⁻细胞（0/8）注射形成可检测的肿瘤（表（表2）。2). 虽然在注射CD24的部位触诊没有发现肿瘤⁺细胞，注射CD24的12只小鼠中的2只⁺尸检发现，注射部位的细胞确实有小的生长。这些生长很可能来自于1-3%的CD24⁻总是污染分类CD24的细胞⁺细胞或来自CD24⁺增殖能力降低的细胞（表（表2）。2). 因为CD44⁺细胞仅为B38.1⁺，我们在随后的实验中重点关注CD44和CD24标记。

表2

分选细胞的成瘤能力

	肿瘤/注射
	8 × 10⁵	5 × 10⁵	2×10⁵
通过T1
CD44细胞⁻	0/2	0/2	-
CD44细胞⁺	2/2	2/2	-
B38.1条⁻	0/2	0/2	-
B38.1条⁺	2/2	2/2	-
CD24型⁺	-	-	1/6
CD24型⁻	-	-	6/6
通过T2
CD44细胞⁻	0/2	0/2	-
CD44细胞⁺	2/2	2/2	-
B38.1条⁻	0/2	0/2	-
B38.1条⁺	2/2	2/2	-
CD24型⁺	-	-	1/6
CD24型⁻	-	-	6/6

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如图所示，通过流式细胞术分离细胞。图11基于所示标记的表达，并在NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫注射8×10后检测其形成肿瘤的能力⁵, 5 × 10⁵、和2×10⁵每次注射的细胞数。在12周内，每周通过观察和触诊检查小鼠的肿瘤；然后对所有小鼠进行尸检，寻找注射部位太小而无法触诊的生长物。显示了每个人群中形成的肿瘤数量和进行的注射数量。通过肉眼检查和触诊，除了CD24的肿瘤外，所有肿瘤都很容易被发现⁺仅在尸检时发现的人群。

根据对小鼠多次传代肿瘤的分析，发现癌细胞不表达与正常细胞类型相关的几种抗原（谱系标记：CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64和CD140b）。通过消除世系⁺清除来自未经传代或早期传代肿瘤细胞、正常人类白细胞、内皮细胞、间皮细胞和成纤维细胞的细胞。通过显微镜检查，世系⁻肿瘤细胞始终具有肿瘤细胞的外观（数据未显示）。

根据肿瘤的不同，11%-35%的世系⁻肿瘤或胸腔积液中的癌细胞为CD44⁺CD24型^−/低（图。（图1）。1). CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻细胞或世系的其他种群⁻从9名患者身上分离出的癌细胞被注射到小鼠的乳腺脂肪垫中（表（表3）。三). 注射未分类的传代T1或T2细胞时，5×10⁴细胞不断地引发肿瘤，但10⁴只有少数病例中的细胞导致肿瘤。相比之下，只有10个^三T1或T2 CD44⁺CD24型^−/低血统⁻所有病例中的细胞都会引发肿瘤（表（表3）。三). 在T1和T2中，高达2×10⁴CD44细胞⁺血统⁻但CD24⁺未能形成肿瘤。这些数据表明CD44⁺CD24型^−/低血统⁻NOD/SCID小鼠的肿瘤形成能力是普通肿瘤细胞的10到50倍。CD44是否⁺CD24型^−/低血统⁻从传代肿瘤（T1、T2和T3）或直接从患者（T1，T4-T6，T8和T9）获得的未经传代的癌细胞中分离出细胞，并富集其致瘤活性。注意，T7是所研究的九种癌症中唯一不符合这种模式的一种（图。（图11（f）). 除T7、CD24外⁺血统⁻未传代和传代肿瘤中的癌细胞都不能形成新的肿瘤（表（表3）。三). 因此，异种移植和未经验证的患者肿瘤由表型不同的癌细胞类型的相似人群组成，在这两种情况下，只有CD44⁺CD24型^−/低血统⁻细胞具有增殖形成新肿瘤的能力(对< 0.001).

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图1

致瘤细胞的分离。流式细胞术用于分离T1亚群(一和b条)，T3(c（c）)，T5型(d日)，第6页(e（电子）)、和T7(（f）)在NOD/SCID小鼠中测试致瘤性的细胞。T1类(b条)和T3(c（c）)已在NOD/SCID小鼠中传代（P）一次，而其余细胞是从患者（UP）中取出后直接获得的冷冻或解冻样品。用CD44、CD24、世系标记物和小鼠H2K（用于从小鼠获得的传代肿瘤）和7AAD抗体对细胞进行染色。死电池（7AAD⁺)，小鼠细胞（H2K⁺)和世系⁺从所有分析中剔除正常细胞。每个图描绘了活体人类世系的CD24和CD44染色模式⁻癌细胞，以及每个样本中癌细胞所占比例的装箱致瘤癌人群的频率。

表3

ESA高度富集了致癌乳腺癌细胞⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低人口

	肿瘤/注射
	5 × 10⁵	10⁵	5 × 10⁴	2 × 10⁴	10⁴	5 × 10^三	10^三	500	200	100
鼠标通道1
未分类	8/8	8/8	10/10		3/12		0/12	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型⁺	-	-	-	0/10	0/10	0/14	0/10	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型^−/低	-	-	-	10/10	10/10	14/14	10/10	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型^−/低欧洲航天局⁺	-	-	-	-	-	-	10/10^*	4/4	4/4	1/6
CD44细胞⁺CD24型^−/低欧洲航天局⁻	-	-	-	-	-	-	0/10^*	0/4	0/4	0/6
鼠标通道2
CD44细胞⁺CD24型⁺	-	-	-	-	0/9	-	-	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型^−/低	-	-	-	-	9/9	-	-	-	-	-
患者肿瘤细胞
CD44细胞⁺CD24型⁺	-	第0页，共3页	第0页，共4页	0/8	1/13	0/2	-	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型^−/低	-	3/3	4/4	-	11/13	1/1	-	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型^−/低欧洲航天局⁺	-	-	-	-	-	2/2	2/2	-	-	-
CD44细胞⁺CD24型^−/低欧洲航天局⁻	-	-	-	-	-	2/2^†	0/2	-	-	-

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从第1代（小鼠传代1）T1、T2和T3、第2代（小鼠传代2）T3和未经传代（患者肿瘤细胞）T1，T4，T5，T6，T8和T9中分离细胞。CD44细胞⁺CD24型⁺血统⁻人群和CD44⁺CD24型^−/低血统⁻如图所示，通过流式细胞术分离细胞。图1。1将每个表型的指示细胞数注射到NOD/SCID小鼠的乳房中。用改进的最大似然分析法计算的致瘤细胞频率≈5/10⁵如果单个致瘤细胞能够形成肿瘤，并且每个移植的致瘤细胞都会产生肿瘤(33). 因此，这一计算可能低估了致瘤细胞的频率，因为它没有考虑细胞间的相互作用和可能影响植入的局部环境因素。除了显示的标记外，所有实验中的所有分选细胞都是世系⁻，T1、T2和T3的致瘤细胞进一步被选为B38.1⁺每周观察小鼠4-6.5个月，或直到小鼠患上肿瘤。

^*在这些实验中注射了2000个细胞。

^†5000 T5 ESA肿瘤形成⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻注射后8–9周检测到细胞，而5000 T5 ESA检测到肿瘤形成⁻CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻注射后10～12wk检测细胞。

在其中三种肿瘤中，通过分离ESA可以进一步增强致瘤活性⁺CD44亚群⁺CD24型^−/低人口。ESA过去曾用于区分上皮癌细胞和良性反应性间皮细胞(20). 当ESA⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻从传代的T1细胞中分离出细胞，注射后5到6个月，只有200个细胞持续形成约1厘米的肿瘤，而2000个ESA⁻CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻细胞或20000 CD44⁺CD24型⁺细胞总是不能形成肿瘤（表（表3）。三). 12只小鼠中只有3只出现了一万个未分类的细胞形成肿瘤。这一结果表明，ESA⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻相对于未分化的肿瘤细胞，人群的肿瘤形成能力增加了50倍以上（表（表3）。三). 欧洲航天局⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻人群占第1代T1细胞的2-4%（癌细胞的2.5-5%）。欧洲航天局⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻与ESA相比，来自未经染色T5细胞的人群（0.6%的癌细胞）也富含致瘤活性⁻CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻电池，但ESA⁺和ESA⁻组分具有一些致瘤活性（表（表3）。三). 在未通电的T5电池中，只有1000个ESA⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻细胞不断形成肿瘤。

为了确定细胞群致瘤性的差异是否是由于细胞周期的差异，我们用流式细胞术分析了这些细胞群。通过比较T1中致瘤和非致瘤癌细胞的细胞周期状态，发现两者的细胞周期分布相似（图。（图2）。2). 因此，在细胞周期的特定阶段，这两个群体的细胞都没有得到富集，非肿瘤原性细胞在异种移植模型中至少能够经历有限数量的分裂。

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图2

致瘤性和非致瘤性乳腺癌细胞的DNA含量。ESA的细胞周期状态⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻致瘤细胞(一)和剩下的世系⁻非肿瘤原性癌细胞(b条)通过Hoechst 33342染色法测定T1分离物的DNA含量(20). 致瘤细胞和非致瘤细胞的细胞周期分布相似。

注射6个月后，20000个致瘤CD44的注射部位⁺CD24型^−/低血统⁻细胞和20000个非致癌CD44⁺CD24型⁺血统⁻通过组织学检查细胞。CD44⁺CD24型^−/低血统⁻注射部位的肿瘤直径约为1厘米，而CD44⁺CD24型⁺血统⁻注射部位没有发现肿瘤（图。（图3三c（c）). CD44位点的组织学检查仅发现正常小鼠乳腺组织⁺CD24型⁺血统⁻喷射（图。（图3三一)而CD44形成的肿瘤⁺CD24型^−/低血统⁻苏木精和伊红染色切片判断细胞中含有恶性细胞（图。（图3三b条). 即使CD44⁺CD24型⁺血统⁻在16～29周后，对58只小鼠（每只给药1000～50000个细胞）的注射部位进行检查，未发现肿瘤。此外，致瘤和非致瘤人群在形态学上无法区分。世系的致瘤和非致瘤亚群⁻通过赖特染色或巴氏染色和显微镜分析判断，来自传代和未传代肿瘤的细胞含有>95%的癌细胞。根据组织学，CD44⁺CD24型^−/低血统⁻细胞和世系的其他部分⁻细胞具有上皮癌细胞的外观（图。（图3三 d日和e（电子）).

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图3

CD24的组织学⁺注射部位(一; ×20客观放大倍数）仅显示正常小鼠组织，而CD24^−/低注射部位(b条; ×40客观放大倍数）含有恶性细胞。(c（c）)小鼠CD44的代表性肿瘤⁺CD24型^−/低血统⁻注射部位，但不在CD44⁺CD24型⁺血统⁻注射部位。T3细胞用巴氏染色法染色，并在显微镜下检查（×100物镜）。两种非肿瘤原性(d日)和致瘤性(e（电子）)人群中含有肿瘤样细胞，细胞核大，核仁突出。

致瘤人群能够产生在初始肿瘤中发现的表型异质性。

少量CD44的能力⁺CD24型^−/低血统⁻产生新肿瘤的致瘤细胞让人想起正常干细胞的器官生成能力。正常干细胞自我更新，产生表型多样的细胞，增殖潜能降低。为了测试致瘤乳腺癌细胞是否也表现出这些特性，来自200 ESA的肿瘤⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻T1或1000 CD44⁺CD24型^−/低血统⁻分离T2细胞并用流式细胞术进行分析。继发性肿瘤中ESA、CD44或CD24的异质性表达模式类似于其来源肿瘤的表型复杂性（图。（图44 一和b条与。e（电子）和（f）). 在这些继发肿瘤中，CD44⁺CD24型^−/低血统⁻细胞仍然具有致瘤性，而世系的其他人群⁻癌细胞仍然不致癌（表（表3）。三). 因此，致瘤细胞产生额外的CD44⁺CD24型^−/低血统⁻致瘤细胞以及表型多样的非致瘤细胞，再现了源于致瘤细胞的原发肿瘤的复杂性。这些CD44⁺CD24型^−/低血统⁻来自T1、T2和T3的致瘤细胞现在已经在小鼠体内连续传代四轮肿瘤形成，在每一传代中都产生了类似的结果，没有证据表明其致瘤性降低（数据未显示）。这些观察结果表明CD44⁺CD24型^−/低血统⁻致瘤癌细胞经历类似于正常干细胞自我更新和分化的过程。

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图4

CD44引起的肿瘤的表型多样性⁺CD24型^−/低血统⁻细胞。这些图描绘了活体人类世系的CD24和CD44或ESA染色模式⁻来自T1的癌细胞(一,c（c）、和e（电子）)或T2(b条,d日、和（f）). T1 CD44型⁺血统⁻单元格(一)或T2世系⁻单元格(b条)从已经在NOD/SCID小鼠中传代一次的肿瘤中获得。欧洲航天局⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻来自T1的致瘤细胞(c（c）)或CD44⁺CD24型^−/低血统⁻T2的致瘤细胞(d日)分离并注射到NOD/SCID小鼠的乳房中；e（电子）和（f）描述这些细胞产生的肿瘤的分析。在这两种情况下，致瘤细胞形成的肿瘤包含与原始肿瘤中观察到的细胞相似的表型多样性细胞。

我们的结果表明，乳腺癌细胞的异质性群体包括一个表型不同的致瘤群体，以及一个更大的缺乏这种致瘤潜力的群体。众所周知，乳腺癌细胞的遗传不稳定，因此，由于有丝分裂期间获得的染色体畸变，来自致瘤人群的单个乳腺癌细胞有时可能无法增殖(21–23). 然而，在九个肿瘤样本中的八个样本中，致瘤亚群显示了一个共同的表型，可以对其进行识别，这一观察结果表明，共同的途径可能会驱动该致瘤人群。

致瘤CD44⁺CD24型^−/低血统⁻人群与正常干细胞具有广泛增殖的能力，并产生发育或增殖潜能降低的多种细胞类型(24). 仅有200个通过或1000个未通过ESA的能力证明了致瘤人群的广泛增殖潜力⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低血统⁻细胞产生肿瘤（直径>1 cm），可连续移植到NOD/SCID小鼠体内。T1、T2和T3的致瘤人群现已被纯化，并通过NOD/SCID小鼠连续传代四次。这种广泛的增殖潜能与大量CD44形成对比⁻和/或CD24⁺缺乏形成可检测肿瘤能力的癌细胞。不仅是CD44⁺CD24型^−/低血统⁻能够产生额外致瘤CD44的细胞群⁺CD24型^−/低血统⁻但它们也能产生表型多样的非肿瘤原性细胞，这些细胞构成了肿瘤的主体。即使经过两轮连续通行，情况也是如此。因此，CD44⁺CD24型^−/低血统⁻大多数肿瘤细胞似乎具有肿瘤干细胞的特性。对这些细胞的干细胞能力的不一致证明需要开发能够从单个细胞生成肿瘤的模型系统(25). 尽管如此，我们的研究结果表明，乳腺癌细胞存在一个层次，其中一些细胞具有广泛增殖的能力，而从该人群中获得的大多数肿瘤细胞的增殖潜力有限体内以前有研究表明，急性髓细胞白血病白血病生细胞的表型与早期造血祖细胞的表型相似(14). 我们的结果表明，这一结果也可能适用于致瘤性乳腺癌细胞，因为早期多潜能上皮前体细胞也被报道表达ESA和CD44(26–28).

分离肿瘤细胞的致瘤性和非致瘤性群体的能力应允许对这些细胞进行分子表征，并阐明导致其致瘤潜力的途径。此外，肿瘤中存在致瘤细胞子集将为乳腺癌患者的一些临床观察提供解释。例如，研究表明，多达30%的乳腺癌患者在发病时可能会在骨髓中出现微转移疾病。然而，5年后，只有≈50%的患者会出现临床明显的转移。这一发现被推测是由于肿瘤休眠所致。然而，与癌症干细胞模型一致的另一种解释是，患者骨髓中的癌细胞可能是由致瘤或非致瘤癌细胞的扩散引起的，只有当致瘤细胞转移时，才会发生具有临床意义的肿瘤。第二种解释表明，开发诊断试剂，用于前瞻性鉴定致瘤细胞，可能对乳腺癌患者的预后具有重要意义。

鉴别致癌和非致癌乳腺癌细胞也具有重要的治疗意义。传统上，药物治疗是基于这些药物在动物模型中导致肿瘤退化的能力而开发的。因为我们已经证明肿瘤中的大多数癌细胞是非肿瘤原性的，所以针对这些细胞的治疗会导致肿瘤退化。然而，如果治疗未能针对致瘤细胞，那么这些细胞在治疗后会持续存在，并能够再生肿瘤，导致肿瘤复发。众所周知，正常干细胞具有使其对化疗产生相对抗性的机制，例如BCL-2家族蛋白表达增加、膜转运蛋白（如乳腺癌耐药蛋白）表达增加以及多重耐药(29–32). 这种蛋白在致瘤乳腺癌细胞中的表达可能会使其对当前的治疗产生固有的更大的抵抗力。对癌细胞致瘤群体的前瞻性鉴定应允许鉴定这些细胞中表达的分子，这些分子可以靶向消除这一关键的癌细胞群体，从而实现更有效的癌症治疗。

致谢

我们感谢Mark Kukaruga和Ann Marie Deslaurier的流式细胞术，感谢Steve Ethier的肿瘤标本，感谢Brian Clarke对致瘤癌细胞频率的数学计算。这项工作得到了国家癌症研究所拨款CA-075136的支持。流式细胞术由国家癌症研究所拨款CA-46592支持。

缩写

NOD/SCID编号	非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷
HICS公司	热灭活小牛血清
欧洲航天局	上皮特异性抗原
T型n个	肿瘤n个

脚注

参见第页的注释3547.

参考文献

1Stockler M、Wilcken N R、Ghersi D、Simes R J。癌症治疗Rev。2000;26:151–168.[公共医学][谷歌学者]

2舒尔茨·L·B，韦伯·B·L。当前运营成本。1999;11:429–434.[公共医学][谷歌学者]

3Aubele M，Werner M。肛门细胞病理学。1999;19：53–58。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

4Golub T R.公司。N英格兰医学杂志。2001;344:601–602.[公共医学][谷歌学者]

5赫普纳·G·H。癌症研究。1984;44:2259–2265.[公共医学][谷歌学者]

6沃丁斯基一世、斯威尼亚斯基J、肯斯勒C J。癌症化疗代表。1967;51:415–421.[公共医学][谷歌学者]

7Southam C，Brunschwig A。癌症。1961;14:971–978. [谷歌学者]

8汉堡A W，三文鱼S E。科学。1977年；197：461–463。[公共医学][谷歌学者]

9Fialkow出版社。出生缺陷原始序列。1976;12:123–132.[公共医学][谷歌学者]

10Bergsagel D E，Valeriote F A。癌症研究。1968;28:2187–2196.[公共医学][谷歌学者]

11Weisenthal L，Lippman M E。癌症治疗代表。1985;69:615–632.[公共医学][谷歌学者]

12Reya T、Morrison S J、Clarke M F、Weissman I L。自然。2001;414:105–111.[公共医学][谷歌学者]

13Lapidot T、Sirard C、Vormoor J、Murdoch B、Hoang T、Caceres-Cortes J、Minden M、Paterson B、Caligiuri M、Dick J。自然。1994;17:645–648.[公共医学][谷歌学者]

14Bonnet D，Dick J。自然医学。1997;三:730–737.[公共医学][谷歌学者]

15Larochelle A、Vormoor J、Hanenberg H、Wang J C、Bhatia M、Lapidot T、Moritz T、Murdoch B、Xiao X L、Kato I等。自然医学。1996;2:1329–1337.[公共医学][谷歌学者]

16Sakakibara T、Xu Y、Bumpers H、Chen F、Bankert R、Arredondo M、Edge S、Repasky E。《美国癌症科学杂志》。1996;2:291–300.[公共医学][谷歌学者]

17Ahrens T、Sleeman J、Schempp C、Howells N、Hofmann M、Ponta H、Herrlich P、Simon J。致癌物。2001;20:3399–3408.[公共医学][谷歌学者]

18Uchida N、Buck D、He D、Reitsma M、Masek M、Phan T、Tsukamoto A、Gage F、Weissman I L。美国国家科学院程序。2000;97:14720–14725. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

19Kufe D、Nadler L、Sargent L、Shapiro H、Hand P、Austion F、Colcher D、Schlom J。癌症研究。1983;43:851–857.[公共医学][谷歌学者]

20Packeisen J、Kaup-Franzen C、Knieriem H。杂交瘤。1999;18：37–40。[公共医学][谷歌学者]

21Murphy K、Dennis A、Rosen J。美国财务会计准则委员会J。2000;14:2291–2302.[公共医学][谷歌学者]

22徐X。自然遗传学。1999;22：37–43。[公共医学][谷歌学者]

23Fukasawa K、Weiner F、Mai S。致癌物。1997;11:1295–1302.[公共医学][谷歌学者]

24莫里森·S·J、韦斯曼·I·L。免疫。1994;1:661–673.[公共医学][谷歌学者]

25Lagasse E、Connors H、Al-Dhalimy M、Reitsma M、Dohse M、Osborne L、Wang X、Finegold M、Weissman I L、Grompe M。自然医学。2000;6:1229–1234.[公共医学][谷歌学者]

26Stingl J、Eaves C、Kuusk U、Emerman J。区别。1998;63：201–213。[公共医学][谷歌学者]

27Liu A、True L、LaTray L、Nelson P、Ellis W、Vessella R、Lange P、Hood L、van den Engh G。美国国家科学院程序。1997;94:10705–10710. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

28Gudjonsson T、Villadsen R、Nielsen H L、Ronnov-Jessen L、Bissell M J、Petersen O W。基因发育。2002;16:693–706. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

29Lagasse E，Weissman I L。细胞。1997;89:1021–1031.[公共医学][谷歌学者]

30Lagasse E，Weissman I L。《实验医学杂志》。1994;179:1047–1052. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

31Domen J、Gandy K L、Weissman I L。鲜血。1998;91:2272–2282.[公共医学][谷歌学者]

32Zhou S、Schuetz J D、Bunting K D、Colapietro A M、Sampath J、Morris J J、Lagutina I、Grosveld G C、Osawa M、Nakauchi H、Sorrentino B P。自然医学。2001;7:1028–1034.[公共医学][谷歌学者]

33波特·E·H、贝里·R·J。英国癌症杂志。1964;17:583–601. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院

来自封面

致瘤性乳腺癌细胞的前瞻性鉴定

穆罕默德·阿勒哈吉

马克斯·维查

阿达尔贝托·贝尼托·埃尔南德斯

肖恩·莫里森

迈克尔·克拉克

摘要

材料和方法

小鼠准备。

原发肿瘤标本植入。

胸腔积液注射。

肿瘤细胞单细胞悬液的制备。

用于流式细胞术的细胞染色。

流式细胞术。

结果和讨论

肿瘤标本和移植率。

表1

肿瘤标志物的鉴定。

表2

表3

致瘤人群能够产生在初始肿瘤中发现的表型异质性。

致谢

缩写

脚注

参考文献