Doa4脱泛素酶在功能上与液泡蛋白转运和内吞途径

did突变体的分离

这个第1天到did5型突变体最初是在屏蔽期间隔离葡萄裂殖酵母的直系词酿酒酵母DOA4基因（A.Y.Amerik.和M.Hochstrasser，未发表数据），基于X-gal板增强型检测1度-β-半乳糖降解doa4-1突变型MHY11D5-8a(《爸爸和霍克斯特拉瑟》，1993年)。从约70000株中鉴定出7株质粒非依赖性回复体聚居地。回交显示抑制突变是未链接到doa4-1所有情况下的抑制隐性的。突变体被分为五个互补组基于不同的交配做了4-1双重的突变体。当与doa4-1等位基因，所有突变体除外did5-1被发现很容易得分隐性缺陷。在多次尝试失败期间克隆DID5型通过抑制1度-β加仑中的退化did5-1doa4-1细胞，我们还执行了的控制变换doa4-1应变MHY1096空向量。另外五个做抑制器与doa4-1分离，抑制也是隐性的。其中三个抑制器是新的第3天等位基因基于克隆人的互补DID3（数字接口3）基因，还有两个，第6-1天和第7-1天的基因中没有对应于DID1（DID1）–DID4号机组。没有克隆的做低拷贝质粒上的基因能够逆转did5-1doa4-1抑制表型。

这个做基因是从两个基因中的任何一个克隆出来的欧洲标准化委员会/URA3公司-基于酵母基因组文库，一个YCp50中(玫瑰色等人。, 1987)另一个在YCplac33（A.Y。亚美利克。和M.Hochstrasser，未公布数据）。通过基于图版的选择，假定做含基因克隆通过抑制相应的做0.8μg/ml卡纳凡尼的单一突变体硫酸盐。为了消除质粒非依赖性回复体，在含有5-FOA、，对表达URA3公司基因，至鉴定丢失文库质粒的细胞。来自的质粒5-FOA后不再对卡那凡尼耐药的转化子治疗在年恢复大肠杆菌然后在突变酵母细胞。DNA亚克隆用于追踪补体从原始质粒插入到单个ORF的活性案例DID2型（见下文）。六个克隆基因的连锁带有各自的染色体做突变已被证实通过子克隆做YIp352中含有基因的DNA片段(希尔等人。, 1986)，直接集成结果质粒进入酵母基因组，并对其进行连锁分析YIp352-出生URA3公司标志物与卡那凡尼超敏反应由做突变。

要确定DID2型ORF公司(YKR035w-A型),最初未在酵母菌属基因组数据库（SGD）被表达为蛋白质，ORF在其5′端为编码T7-Tag表位（Novagen）的序列。A类两步PCR程序用于表位标记(爸爸et（等）阿尔。, 1999). PCR产物在pGEM-T/Easy（Promega，威斯康星州麦迪逊市）不是一、 并将子克隆到欧洲标准化委员会/URA3公司酵母–大肠杆菌梭形矢量pRS316型(西科尔斯基和希特，1989年). pRS316-T7-DID2质粒为转化为MHY1234细胞(第2天Δ：：HIS3). 因为假设DID2型/YKR035w-A型ORF完全被这个YKR035c型相反链上的ORF，选择性灭活DID2型通过改变假定的DID2型启动ATA密码子的密码子。突变，第2-3天，没有改变预测的蛋白质序列YKR035c型。中的下一个ATGDID2型ORF是密码子89，如果用于启动翻译，将导致截断蛋白质。这个did2-3等位基因被克隆到pRS316中，作为T7-Tag的添加，等位基因通过DNA验证测序。

通过DNA序列分析，我们注意到预测DID4型/YKL002w型ORF孔显著与5′区域的相似性DID3（数字接口3）ORF公司。完美匹配一致认为5′和3′剪接位点和分支点序列是发现就在SGD-注释的上游YKL002w型ORF、，暗示内含子的存在。我们通过PCR验证了这一点使用预测的引物从cDNA文库中扩增侧翼内含子位置。PCR片段的测序证实了基因组中缺少68碱基对（bp）DNA元素序列，与预测的内含子相对应。这个内含子编码序列跨越核苷酸437476到437543第十一号染色体（SGD）。

酵母菌株和质粒构建

使缺失等位基因DID1（DID1）,DID2型,和DID3（数字接口3），酵母HIS3型基因被扩增使用5′序列对应于起始密码子上游和各自的终止密码子做基因。这个扩增片段用于MHY606细胞的转化。这个由此产生的杂合二倍体形成孢子，四分体被解剖。伊斯⁺检查单倍体分离子通过菌落PCR。采用两步程序使DID4型400 bp的片段带有立即数5′或3′侧翼序列DID4号机组ORF被扩增1500-bp DNA片段包含LEU2级.5′序列在用于扩增的引物内LEU2级也对应于紧邻起始密码子和终止密码子的序列DID4号机组在第二轮放大中，重叠LEU2级和DID4号机组侧面的DNA片段是退火，延长Taq公司聚合酶，然后扩增使用最外层DID4号机组引物。产生的结果DNA片段包含LEU2级400bp的基因侧翼DID4号机组上游和下游序列。改造后利用该PCR片段对MHY606的二倍体进行孢子化如上所述解剖四分体。

携带质粒vps27Δ：：LEU2和vps45Δ：：URA3来自罗伯特·派珀（Robert Piper），爱荷华州爱荷华市爱荷华大学(派珀et（等）阿尔。, 1994,1995). 插入物被转化为酵母。通过菌落PCR验证突变等位基因的整合通过四分体分析鉴定了突变分离子。酵母菌株多个基因的缺失是由合适的基因造成的十字架。对于的高拷贝表达式DID1（DID1）–DID4号机组,将这四个基因分别亚克隆到2-μm载体中YEplac195年(Gietz和Sugino，1988年). 产生的质粒为变成各种各样的didΔ突变体。

构造Did1和Did3的HA-tagged版本的表达式通过PCR扩增相应基因产生使用与每个ORF的5′端和3′端匹配的引物。囊我和Xho公司I限制性位点被构建到5′和3′引物，PCR产物用囊我和Xho公司I和子克隆到表达式中矢量YATAG200（CEN/ARS）和YRTAG310（2μm），这导致基因在CUP1大学启动子和融合at它们的3′端是编码帧内HA表位标签的序列（参见锂和Hochstrasser，1999年)。

A类DOA4公司–进行GFP基因融合（S65T GFP变体）之前用于从低拷贝着丝粒质粒（F.R。Papa和M.Hochstrasser，未公布数据）。这个融合构造，它使用DOA4公司发起人，完全补充了卡纳凡尼敏感性doa4Δ突变体。插入DNA编码Doa4–GFP蛋白的基因被切除Hin公司dIII和千磅我和子克隆到YIp352。产生的质粒是被劈开Bgl公司二、 在一个独特的地点切入DOA4公司，将质粒直接整合到染色体DOA4公司在酵母菌株SEY6210和MBY11中的基因座。乌拉⁺选择了转化子通过连锁分析验证了整合性。

抗泛素免疫印迹分析

进行了抗泛素免疫印迹分析基本上如前所述(美国等人。, 1997)。细胞在30°C下生长至中对数期，由离心，并在Laemmli凝胶加载缓冲液中重新悬浮。之后加热至100°C 10分钟并旋转细胞碎片将上清液加载到16%Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶上(Schägger和von Jagow，1987年). 蛋白质被转移到Immobilon-P膜（Millipore，Bedford，MA）和印迹在抗体孵育之前在水中煮沸30分钟。抗体使用ECL试剂检测结合（阿灵顿阿默沙姆Heights，IL）。在所用条件下，自由基的反应性泛素明显弱于泛素蛋白结合物，尤其是与小鼠单克隆抗体结合。

降解分析

脉冲相位和脉冲标记分析如下如前所述(陈等人。, 1993). 细胞被标记持续5-10分钟³⁵S-TransLabel（ICN）标签制药公司，加利福尼亚州科斯塔梅萨）。等分的酵母细胞是通过与等体积的2%十二烷基硫酸钠、90 mM HEPES、pH混合进行破坏7.5和30 mM DTT，并在100°C下加热10分钟用抗α2抗体沉淀稀释的细胞提取物(Hochstrasser和Varshavsky，1990年)，β-半乳糖苷酶（有机质Teknika、Malvern、PA）或T7-Tag（Novagen）。测量退化在Ste3的最小培养基中培养10 ml细胞外径₆₀₀～0.8，造粒，再悬浮在1 ml中最小介质。将环己酰亚胺添加到最终浓度0.5mg/ml。在适当的时间，取出等分的细胞并在100°C下加热10分钟，通过14000×克.蛋白质被分解10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的抗Ste3分析免疫印迹分析和ECL检测。

荧光显微镜

FM4-64亲脂性染料对酵母细胞膜的染色如前所述进行了轻微修改(维达牌手表和Emr，1995年). 所有菌株在30°C条件下在10 ml YPD中培养至外径₆₀₀∼ 1. 收集细胞并重新悬浮166μl YPD中。FM 4-64（0.4μl的16 mM DMSO溶液）添加到每个试管中，并在30°C下培养20分钟通过离心收集，重新悬浮在0.2 ml新鲜YPD中，以及在30°C下培养1小时。细胞由收集离心并在YPD中重新悬浮，以及一滴细胞将悬浮液置于载玻片上并通过荧光显微镜观察。类似的条件被用于通过内源性GFP荧光。

检测了Did1、Did2、Did3和Doa4的亚细胞分布用间接免疫荧光法检测固定酵母菌株(锂和Hochstrasser，1999年). 最终添加了甲醛浓度为3.7%，培养基呈指数增长（10ml）。之后2 h，离心细胞并用10 ml缓冲液B（0.1M磷酸钾_,pH 6.8，0.5 mM氯化镁₂). 通过离心法收集细胞，用10 ml缓冲液C（0.1 M钾）清洗磷酸盐_,pH 6.8，0.5 mM氯化镁_2,1.2 M山梨醇），离心，以及在1 ml缓冲液C中重新悬浮。添加5μlβ-巯基乙醇和10μl发酵糖酶100T(生化学美国马里兰州罗克维尔；5 mg/ml缓冲液C），细胞在30°C持续1小时，收获，用5 ml缓冲液C清洗，以及重悬于1ml缓冲液C中。取等分细胞（15μl）放置在聚赖氨酸涂层多孔载玻片上，培养10分钟，以及用15μl PBS清洗，pH值为7。用15μl0.2%Triton X-100在PBS中浸泡10分钟，用PBS清洗三次，以及在含有0.5%BSA的PBS中孵育10分钟。初级抗体然后添加。隔夜培养后，将细胞清洗四次两次使用PBS和两次使用含有0.5%BSA的PBS，然后用二级抗体孵育1小时（俄勒冈州绿山羊抗小鼠和德克萨斯红抗兔免疫球蛋白G结合物；分子探针，尤金，俄勒冈州）。用PBS和空气多次清洗后干燥后，将安装介质添加到每个孔中，并覆盖载玻片带盖玻片。样本在蔡司（纽约州桑伍德）LSM 510共焦荧光显微镜。

DID基因的分离

这个DID1（DID1）,DID2型,DID3（数字接口3）,DID4号机组,DID6型、和DID7型基因被克隆通过酵母基因组DNA文库的功能互补相应酵母突变体的卡纳凡尼超敏反应（参见材料和方法）。从原始基因组中进行DNA亚克隆插入允许识别负责每种情况下的补充活动DID2型（请参见以下）（表​（表2）。2). 四个做基因被鉴定之前的基因筛查与现在的无关。DID1（DID1）与相同序号F7/视频处理32，其中编码一种参与克服葡萄糖抑制的蛋白质转录(图等人。, 1993)以及贩卖蛋白质进入液泡(巴斯特等人。, 1998)。DID3（数字接口3）与相同VPS24系列，这也是最近与空泡蛋白分选有关(巴斯特et（等）阿尔。, 1998). 最后，DID6型和DID7型是发现与VPS4系列(巴斯特等人。, 1997)和VPS27系列(派珀等人。, 1995)分别是。这两个基因也编码参与内体的蛋白质运输。DID2型和DID4号机组之前已编码未经特征化的蛋白质。

对于DID2型，包括最小的互补亚克隆两个潜在ORF，YKR035c型和YKR035w-A型. The后一序列与其他序列相似做产品（请参见但位于与之相反的股上，并完全由最初注释的YKR035c型ORF公司。因为这不寻常安排，我们首先希望确定YKR035w-A型实际上转化为蛋白质。这个YKR035w-A型ORF是在其5′端与编码T7表位标签的序列融合编码假定T7标记蛋白的低拷贝质粒是转化为第2天null突变体。野生型增长在高温下恢复了卡纳凡尼和预测的大小是特异性免疫沉淀的（图​（图3A）。三A） ●●●●。选择性灭活YKR035w-A型不影响预测的蛋白质序列属于YKR035c型前ORF的起始密码子为变异以产生第2-3天等位基因。预测的蛋白质，如果表达，将丢失野生型的前88个残基YKR035w-A蛋白质。这个第2-3天构造无法补码a的卡纳凡尼超敏反应did2Δ应变（图​（图3B）三B） 或防止抑制1度-βgal降解在一个did2-1doa4-1双突变体。我们的结论是Did2由编码YKR035w-A型，这一结论得到了下面讨论了序列相似性。

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图3

Did2由编码YKR035w-A型，一个ORF嵌入另一个基因。（A） 蛋白质表达来自YKR035w-A型通过表位标记和放射性标记酵母细胞的免疫沉淀。分子质量指示标准（kDa）。（B） 破坏预测的蛋白质编码序列YKL035w-A型但不是的YKR035c型在相反的链上不能互补一did2Δ突变。用指示物转化的细胞质粒在30°C下用1.0μg/ml卡纳凡尼涂布。

四个DID基因编码相关蛋白质

出乎意料的是，当比较预测的Dod蛋白Did1时，发现Did2、Did3和Did4按顺序相关（图​（图4A）。4A） ●●●●。这四个都相对较小，预计主要为α螺旋的高电荷蛋白质并在其N末端具有卷曲-卷曲蛋白相互作用域地区(卢帕斯等人。, 1991). 都有酸性等电点点，但它们在电荷分布上也都有偏差碱性残留物集中在其N端半部分和酸性C末端片段中的残留物。这些序列和结构相似性表明，Did1–Did4蛋白与可能有类似的作用机制。

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图4

Did1–Did4蛋白是相关的。（A）Did1（YLR025w）、Did2（YKR035w-A）、Did 3（YKL041w）、，和Did4（YKL002w）。（B） Did2与替代读数对齐人体的框架减贫战略1基因(斯科特et（等）阿尔。, 1996). （C） 酵母Did4与人类的相似性BC-2乳腺癌标志蛋白（GenBank登录号2828147).

之间的几个遗传相互作用做基因支持这一点最后一个推论。在对起初的做突变体，我们注意到第2-2天/+第4-1天/+双杂合子仍然存在与类似的双组分相比，部分对卡纳凡尼敏感涉及杂合子did2-1，这是完全抗卡纳凡尼。这是真的，尽管did2-1单个突变体对卡那凡尼的敏感性略高于第2-2天（图​（图2B）。2B） ●●●●。这种等位基因特异的“非连锁”“未完成”通常表示这两个编码蛋白质在同一蛋白质复合体中起作用(斯坦恩斯和博茨坦出版社，1988年)。我们还将每个DID1（DID1）–DID4型中的基因高拷贝质粒，并确定其中是否有任何质粒可以抑制与另一个空等位基因相关的缺陷做基因。的高拷贝表达式DID4号机组抑制了温度和乙烷敏感性did3Δ，但是在其他病例中未观察到交叉抑制。Did3和Did4是图中所示的酵母蛋白关系最密切​图4A，4A、，在161个残基的重叠中共享30%的同一性和57%的相似性。

尽管酵母Did1–Did4蛋白与单个酵母之间的相似性更强其他真核生物的蛋白质和蛋白质很明显（图​（图4）。4)。因此，出现了Dod蛋白的功能专门化发生在真核生物进化的早期保护（～40–50%身份）支持这些的重要性影响正常细胞功能的因素。我们注意到几个有趣的序列Did2和Did4与其他生物蛋白质的相似性。Did2，它是从完全嵌入在另一个ORF中的ORF表示的ORF显示出47%与先前被忽视的预测人类的一致性多肽（图​（图4B）4B） 也可以通过嵌入在另一个基因，在本例中来自同股减贫战略1(斯科特等人。, 1996)。减贫战略1预计编码分泌型金属蛋白酶，并且在多种细胞类型中检测到单个mRNA。这个减贫战略1基因座，包括DID2型-像序列，是最近绘制的乳腺癌候选基因易感基因(惠特莫尔等人。, 1998)对于淋巴水肿病基因(芒果等人。, 1999)，其中两者均定位于染色体16q24.3。Did2也表现强劲与DG1118相似，a粘液菌所需蛋白质正常形态发育（GenBank登录号3789911）。酵母Did4与人类BC-2蛋白的同源性为45%（相似性为68%），一种可能的乳腺癌标记物（图​（图4C）。4C） ●●●●。因此酵母蛋白质中有可能在乳房中改变的人类同源物吗肿瘤。

泛素途径其他成分中的缺陷未被抑制进行了突变

我们测试了做等位基因可以抑制突变泛素-蛋白酶体途径中除Doa4外的其他成分。双突变体涉及第1天和第3天和泛素几个特征良好组分的突变该系统是通过遗传杂交构建的。使用的等位基因是方位3-1,uba1-2、和ubp14Δ。DOA3公司编码20S的必需β5催化亚单位蛋白酶体(Chen和Hochstrasser，1995年). Uba1是一种必需酶负责激活泛素(麦格拉思等人。,1991)，以及乌巴1-2是一个非致命的低形态等位基因(斯旺森和Hochstrasser，2000年). Ubp14是一个非托管反汇编的Dub多泛素链和，如Doa4，是正常的蛋白酶体降解(美国等人。, 1997). 未检测到抑制与这些突变相关的降解缺陷通过对几种衬底的脉冲相位分析发现。此外，双突变体的生长通常比单突变体差突变体，最引人注目的是uba1-2 did1Δ和ubp14Δdid3Δ未能形成菌落温度分别为35和37°C。因此，通过做突变是特定于行动方向4.

did突变抑制是底物特异性的

为了调查做中的突变行动方向4细胞对非底物的蛋白水解1度-βgal，我们测量了α2，Leu-βgal的降解和Ub-Proβgal（图​（图5）。5). 后两种蛋白质是通过不同的体内机制(瓦沙夫斯基，1997). 我们发现α2在所有测试中，降解缺陷都被完全抑制doa4ΔdidΔ双突变体。亮氨酸-β-半乳糖N末端规则底物在doa4Δdid1Δ,doa4Δdid3Δ、和doa4Δdid4Δ细胞，但在doa4Δdid2Δ紧张，即使有也很少看到了抑制。Ub-Proβgal在后者中保持长寿突变体，而在doa4Δdid1Δ,doa4Δdid3Δ、和doa4Δdid4Δ细胞，对doa4Δ观察到Ub-Proβgal降解缺陷。已知Ub-Proβgal降解是最敏感的受试底物对泛素-蛋白酶体途径的干扰(《爸爸和霍克斯特拉瑟》，1993年;范诺克等人。, 1996),这与强烈但部分绕过doa4Δ由突变引起的蛋白水解缺陷做基因。The inability ofdid2Δ但不是其他做删除以禁止doa4Δ中的缺陷Ub-Proβgal或Leu-βgal降解支持以下观点结构相关的Dod蛋白使重叠但不同Doa4介导的泛素依赖过程的作用。

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图5

基底特定抑制行动方向4基因突变引起的降解缺陷做基因。α2（A），Leu-βgal的脉冲相分析（B） 和同类野生型中的Ub-Proβgal（C），doa4Δ、和doa4Δ didΔ菌株。为了分析α2降解，细胞表达来自染色体的转录抑制因子材料轨迹。用于分析Leu-βgal和Ub-Proβgal诱导质粒衍生融合蛋白的降解和表达含半乳糖(巴赫迈尔等人。, 1986)。

do和doa4-do突变体中的泛素和泛素结合物

对于一些泛素-蛋白酶体途径底物，例如1度-βgal和α2行动方向4退化缺陷可以通过增加泛素水平显著抑制泛素在……中耗尽doa4型细胞。相反，泛素过表达导致Leu-βgal和Ub-Proβgal降解缺陷(斯瓦米纳坦等人。, 1999)。因此，一些蛋白质在行动方向4单元格是主要受泛素可用性降低的限制，而其他底物，蛋白质水解减少是由行动方向4缺陷。后一种缺陷被认为是由蛋白酶体靶向底物中受损泛素的回收(爸爸和Hochstrasser，1993年;爸爸等人。, 1999). 一些因此，上述基底特异性抑制效应可能反映出做突变影响一个人或者其他的doa4型分子缺陷，例如可能主要增加细胞泛素池。

为了研究这个想法，我们检测了泛素和泛素抗泛素在各种突变体中的偶联物免疫印迹（图​（图6）。6). 在所有的doa4ΔdidΔ双突变体，游离泛素水平恢复到野生型水平或接近野生型水平。此外，细胞内标志性低分子量泛素化物种的浓度在中找到行动方向4细胞数量大大减少突变体。对于组合的菌株doa4Δ具有did1Δ,did3Δ，或did4Δ，这些泛素化物种的浓度很低。在doa4Δdid2Δ双突变体一项发现是，小的共轭物稍高，但重复性较高与较弱的蛋白水解抑制一致did2Δ（见上文）。有趣的是，两者都是didΔ单身和doa4ΔdidΔ双突变体积累了广泛的高分子mass泛素-蛋白质结合物阵列很难与积累在蛋白酶体突变体，如方位3-1（图​（图6）6)（请参见德马里尼等人。, 1995). 这在did1Δ和doa4Δdid1Δ细胞。

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图6

抑制方式做基因突变在行动方向4细胞和泛素化蛋白的积累做单个突变体。分析了一组同源菌株的提取物通过抗泛素免疫印迹法。蛋白质是在16%的Tricine凝胶上分离；行动方向4细胞特异的物种标有星号。单泛素化物种抗泛素单克隆抗体检测结果不佳。底部面板显示考马斯蓝染滤光片的一部分，用于免疫印迹显示每条通道中的蛋白质。

did突变体均为E类液泡蛋白选择突变体

我们之前发现Doa4-regulated之间存在联系酵母中泛素稳态与内吞途径(斯瓦米纳坦等人。, 1999). 此外，六个突变体中有四个被鉴定在本研究中，第1天/第32版,第3天/第24版,第6天/第4版、和第7天/第27版，已被认定为E类空泡蛋白分类(虚拟专用交换机)突变体(派珀et（等）阿尔。, 1995;巴斯特等人。, 1998). 这些发现暗示了抑制doa4型Dod蛋白失活和细胞内蛋白水解缺陷蛋白质贩运。中的突变VPS公司基因导致新合成的空泡蛋白（如CPY）错配到培养基(布莱恩特和史蒂文斯，1998年). VPS途径与晚期内体室的内吞途径也称为聚氯乙烯。因此反式-高尔基网络和质膜通过这个腔室被输送到液泡。这个的子集的区别特征虚拟专用交换机突变体被称为E类突变体是指异常的多层膜结构称为E类室，这被认为是一种夸大的晚期内体。

为了确定Did2和Did4是否也是Vps蛋白，CPY排序在中did2Δ和did4Δ分析了突变体通过脉冲相位实验。球形体用放射标记³⁵S-TransLabel并在存在过量未标记的蛋氨酸和半胱氨酸。CPY是细胞内和细胞外部分的免疫沉淀，以及免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE和荧光照相法显示（图​（图7A）。7A） ●●●●。经过30分钟的野外追逐doa4Δ单元格CPY（p1）的内质网前体形式被转运到高尔基，糖链在那里被修饰以产生p2前体，最后到达液泡，在液泡中p2被蛋白质分解加工成成熟酶（mCPY）。相反，在所有didΔ突变体，是p2类CPY的重要组成部分同种型被分泌到培养基中。因此，第2天和第4天是虚拟专用交换机突变体。

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图7

液泡蛋白转运缺陷做突变体。（A） 液泡酶异常分泌在中做突变体。液泡水解酶的分类通过脉冲相位分析测定CPY。细胞球形体标记10分钟³⁵S-TransLabel，30分钟后追逐期，细胞内（I）和细胞外（E）的CPY用抗CPY抗体沉淀组分，并用SDS-PAGE电泳。中间产物由第1天细胞有电泳迁移率比p2形式稍慢在野生型细胞和其他菌株中观察到。这可能是由于CPY的糖基化改变第1天突变体，尽管这还没有经过测试。（B） FM 4-64染色第1天–第4天突变体。细胞被标记使用FM 4-64保持10分钟，并在30°C下保持1小时。细胞然后用外荧光光学进行观察。

可以看到液泡膜和E类隔间用亲脂性荧光染料FM培养活细胞4月64日(Vida和Emr，1995年). 在野生型细胞中，染料被吸入内胚体膜和运输到液泡膜。在课堂上E类虚拟专用交换机突变体，液泡周围E类隔室明显染色。我们的实验表明结构也存在于第2天和第4天突变体（图​（图7B）。7B） ●●●●。作为E类Vps函数的另一个度量，我们检测了酵母α因子受体Ste3的降解。这种蛋白质在质膜上泛素化，被内吞，并且运输到液泡中进行降解(罗斯和戴维斯，1996年)。通过删除政治公众人物4基因强烈稳定受体，而E类缺失VPS2/REN1型该基因也抑制Ste3降解，但案例效果相对温和(戴维斯等人。, 1993)。Ste3在didΔ通过以下方法分析突变体蛋白质翻译时受体消失通过向培养基中添加环己酰亚胺和监测蛋白的抗Ste3免疫印迹化学发光检测。基于此半定量分析，Ste3在所有测试的突变体中，蛋白质水解都受到了轻微的损害（图​（图8）。8). 因此内吞膜蛋白的降解可能是常见的E类突变体的特性。更严重的Ste3降解缺陷是在中观察到doa4Δ细胞，可能是由于泛素限制doa4Δ有相同的对Ste2受体的影响(特雷尔等人。, 1998)和尿嘧啶渗透酶(Galan和Haguenauer-Tsapis，1997年). 共同地，这些观察结果确定Did2和Did4为新的E类Vps蛋白质。

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图8

Ste3受体周转doa4Δ和didΔ用抗Ste3测定突变体添加蛋白质后的免疫印迹合成抑制剂环己酰亚胺。对数生长的细胞在指定时间对30°C（250μl）进行取样。

VPS C类和D类基因突变也抑制doa4Δ

评估干扰其他步骤的后果在分泌和VPS途径中doa4Δ退化缺陷，我们构建doa4Δvps45Δ,doa4Δvps33Δ、和doa4Δ埃及1-A136D双突变体和测量度其中1-βgal、Leu-βgal和/或α2降解细胞。Vps45属于D类Vps蛋白，参与蛋白质在反式-高尔基网络和聚氯乙烯(Cowles公司等人。, 1994;派珀等人。, 1994),而Vps33是一种C类Vps蛋白，对空泡蛋白分选，将转运中间体传递给液泡(班塔等人。, 1990;Rieder和Emr，1997年). Ypt1年是从内质网运输囊泡所必需的高尔基和高尔基复合体内(杰德等人。,1995). 删除视频处理33或VPS45系列抑制了1度-βgal和Leu-βgal降解缺陷doa4Δ单元格（图​（图9A）。9A） ●●●●。在对比埃及1-A136D突变，当引入doa4Δ细胞，没有改变1度-βgal或α2降解（图​（图9B）。9B） ●●●●。我们还尝试在中进行测试doa4Δ细胞的引入效应这个秒4-8突变，抑制蛋白质从这个反式-高尔基网络到质膜(Salminen和诺维克，1987年). 然而，秒4-8似乎是致命的与的组合doa4Δ，可能表示的角色这部分分泌途径中的泛素系统。

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图9

晚期癌症相关基因的突变空泡蛋白分选补偿行动方向4缺乏在酵母中。（A） 脉冲相位分析1度-β加仑中的退化doa4Δ vps45Δ,doa4Δ vps27Δ、和doa4Δ vps33Δ双突变体。（B）α2降解的脉冲追踪分析doa4Δ 埃及1-A136D双突变体。

总之，Doa4功能的丧失至少可以通过以下方式部分克服损害液泡蛋白分选的后期步骤的突变。，蛋白质运输到晚期内体或液泡，但在蛋白质分泌途径可能会恶化doa4Δ缺陷。

Dod蛋白质

引人注目的是，所有六个被确认的行动方向4抑制突变使E类Vps因子失活。停用这些蛋白质导致空泡周围结构的积累由叠层膜池组成(Rieder公司等人。,1996). 这种“E级隔间”被认为代表因失效而累积的过度晚期内体/PVC晚期内体成熟为多泡体（MVB）通常会与液泡融合(福特等人。,1996;奥多里齐等人。, 1998). MVB中的内囊泡富含特定油脂(小林寺等人。, 1999)以及以液泡/溶酶体为目的的细胞表面受体退化，退化(福特等人。, 1996). 因此，重要的是脂肪和蛋白质分类步骤必须发生在MVB。

几个结果证明了Dod的汇合机制作用MVB成熟过程中的蛋白质。首先，六种Dod蛋白中有四种是在一级序列中相关。其次，观察到遗传相互作用其中包括非等位基因未实现和高拷贝抑制。第三，六种Dod蛋白中有四种是观察到，当另一个注意力集中在E类舱室时蛋白质Did6/Vps4 ATP酶不活跃，ATP酶缺陷的Vps4蛋白质的行为类似(巴斯特等人。, 1998). 这些亲水性和通常可溶的因素被认为会形成晚期内体/PVC表面的超分子复合物驱动或促进膜内陷(奥多里齐et（等）阿尔。, 1998). 有趣的是，滴滴1–滴滴4、滴滴6和滴滴7都有假定的线圈域和Did6/Vps4中的线圈区域众所周知，它对PVC的本地化非常重要(巴斯特等人。, 1998). 还预测了潜在的螺旋线圈(卢帕斯等人。, 1991)在Doa4中（残基683–704），这可能对于其与Did/Vps线圈的可逆关联是必要的蛋白质。

两个新的E类Vp之间具有很强的序列相似性本研究中确定的因子（Did2和Did4）和两种哺乳动物基因与乳腺癌有关的产品（见结果）。TSG101，可能另一种酵母类E Vps因子Vps23/Stp22的哺乳动物同源基因，最初被鉴定为肿瘤易感基因(锂et（等）阿尔。, 1999). 这些挑衅性的发现表明，适当的MVB成熟是哺乳动物正常生长调节的关键。这个可能是由于生长因子受体不能下调例如受体蛋白酪氨酸激酶。在酵母中，有几个E类虚拟专用交换机突变体，包括第23版，导致失败降解细胞表面蛋白质（图​（图8），8)，至少在一种情况下，在质膜上有部分受体聚集，这可能反映了细胞表面或备用的晚期内体（E类）室由下游区块产生(戴维斯等人。, 1993)。

Doa4与细胞内膜蛋白转运

泛素和Doa4可能如何参与这些内部膜分类和重排事件？许多血浆注定要在液泡/溶酶体在细胞表面泛素化(希克，1997年;布莱恩特和史蒂文斯，1998年)它们可能携带泛素标签最不利于晚期内体。一些细胞膜蛋白注定要进入液泡也可能需要泛素化，即使没有通过质膜(贝克等人。, 1999)，a可能与抑制doa4Δ通过vps45Δ，它被认为只在高尔基-空泡途径而非内吞途径(派珀等人。, 1994). 蛋白质的泛素化状态晚期内体表面可能有助于将其集中在内陷并形成最终被输送的内部囊泡到液泡内部，可能类似于蛋白质的功能细胞表面泛素化。在这方面，它很有趣Vps23具有与E2泛素结合相关的N末端结构域酶（但缺乏催化Cys残留）(庞廷et（等）阿尔。, 1997). 因此，Vps23可能结合泛素化膜蛋白并帮助其在后期聚集内体/PVC膜。然而，这些蛋白质的去泛素化蛋白质通常必须在完全发泡和输送之前发生到液泡，因为泛素的细胞池寿命很长(斯瓦米纳坦等人。, 1999). 根据提供的数据在这里，我们建议Doa4负责氘化事件在晚期内体/PVC表面。Doa4酶的招募此隔室似乎取决于在晚期内体和控制MVB的形成，这将有助于控制膜蛋白去泛素化的时间和位置。

抑制doa4ΔC类缺陷虚拟专用数据库33突变体，被认为可以阻止MVB融合随着液泡的出现，更难用所描述的模型来解释也就是说，这个街区似乎太晚了，不允许救援来自修饰膜蛋白的泛素。可以有几种解释建议。类似于细胞表面受体在E级虚拟专用交换机突变体(戴维斯等人。, 1993)，在那里可能是C类突变引起的VPS通路中的备份阻止PVC发泡。或者，PVC膜退化和囊泡形成可能是可逆的。逆行路径从液泡到高尔基体最近被证明是通过晚期内体/PVC(布莱恩特等人。, 1998). 有趣的是，在这条路径中，从PVC到高尔基体的转运并不依赖于Vps45，D类因子。抑制doa4Δ通过vps45Δ可能反映了泛素化的逆行退出从PVC到高尔基体的膜蛋白被其他Dubs去泛化，而顺行重路由Vps45的丢失阻止了泛素化蛋白质返回PVC(贝克等人。, 1999)。

最近的研究结果表明泛素化/去泛素化循环沿内吞途径进行，以及这些事件可能有助于确定内吞膜蛋白将继续向液泡方向移动或被传送到另一个隔间。在哺乳动物细胞中，EGF受体的泛素化似乎发生了在内胚体室(列夫科维茨等人。, 1998)。内吞机制本身的组件也可能是可逆泛素添加。例如，Eps15，一种内吞作用配体诱导EGF受体摄取所需的因子是泛素化以响应EGF结合(范·代尔夫特等人。,1997)遗传数据强烈暗示了内吞因子结合Eps15的epsin是果蝇属脂肪层面去泛素酶(卡达维德等人。, 2000)。Dubs在内吞途径早期发挥作用的可能性提示模型虚拟专用交换机/做抑制doa4Δ（见下文）。这也提出了一个问题：在酵母中也有必要的内部（再）泛素化事件因为被贩卖到真空室。与Lys-63连接泛素的结合低聚物增强了内吞作用，但不是绝对必要的和某些膜蛋白的降解(加兰和哈格努埃尔·沙皮斯，1997年;斯普林格尔等人。, 1999). 免费Lys-63连接链由Ubc13 E2同工酶合成需要在Ubc13和另一个E2相关物之间形成复合体蛋白质Mms2，与Vps23一样，也缺乏催化Cys残基(霍夫曼和皮卡，1999年). 通过类比，Vps23，可能与Ubc13或Ubc4型(Arnason和Ellison，1994年)，可能有助于（重新）泛素化内体膜蛋白或延长其单泛素的添加他们集中在PVC内陷部位，之后Doa4被招募来切割泛素标签。与野生型泛素不同，补充adoa4Δ含有泛素-K63R的菌株突变体未能修复其许多缺陷(斯瓦米纳坦et（等）阿尔。, 1999)。

我们感谢安东尼·库珀、威廉·格林、丹·戈特施林和帕姆抗体用银，质粒用Rob Piper和Markus Babst菌株。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款的支持GM53756和癌症研究的Fletcher学者奖芝加哥基金会授予M.H。