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《维罗尔杂志》。2006年6月；80(11): 5168–5178.
数字对象标识：10.1128/JVI.02199-05
预防性维修识别码：项目经理1472134
PMID：16698997

埃博拉病毒VP35蛋白结合双链RNA并抑制RIG-I信号诱导的α/β干扰素的产生

华盛顿B.Cárdenas,1 月明路,2 小迈克尔·盖尔。,2 艾米·哈特曼,三 克里斯托弗·金伯利,4 路易斯·马丁内斯·索布里多,1 埃里卡·奥尔曼·萨郡,4和克里斯托弗·巴斯勒1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

埃博拉病毒（EBOV）VP35蛋白阻断病毒诱导的干扰素调节因子3（IRF-3）磷酸化和激活，IRF-3是诱导α/β干扰素（IFN-α/β）表达的关键转录因子。然而，发生堵塞的机制仍不完全明确。我们现在提供证据表明VP35具有双链RNA（dsRNA）结合活性。具体来说，VP35与聚（rI）·聚（rC）涂层的Sepharose珠结合，但不与对照珠结合。相反，发现两个VP35点突变体R312A和K309A的dsRNA-结合活性严重受损。竞争分析表明，VP35与来源于EBOV序列的poly（rI）·poly（rC）、poly（rA）·poly（rU）或体外转录的dsRNA特异性相互作用，而不是与单链RNA（ssRNA）或双链DNA相互作用。然后，我们筛选了野生型和突变型VP35，以确定其靶向激活IRF-3的信号通路不同成分的能力。这些实验表明，VP35阻断了RIG-I过度表达诱导的IRF-3激活，RIG-I是一种细胞解旋酶，最近被病毒或dsRNA激活IRF-3。有趣的是，在这些分析中，dsRNA结合受损的VP35突变体的IFN拮抗活性降低，但可以测量。此外，发现野生型和dsRNA-binding-mutant VP35具有同等的能力来抑制IFN-β启动子的激活，该启动子由IPS-1的过度表达诱导，IPS-1是RIG-I下游的一种最近发现的信号分子，或IRF-3激酶IKKɛ和TBK-1的过度表示诱导。这些数据支持dsRNA结合可能有助于VP35干扰素拮抗剂功能的假设。然而，在靠近IRF-3激酶的点上，也很可能存在其他抑制机制。

激活α/β干扰素（IFN-α/β）的产生是对病毒感染的先天免疫反应的关键步骤。双标记RNA（dsRNA）长期以来一直被用作干扰素-α/β的实验诱导剂，并有可能在许多病毒复制过程中合成。因此，病毒dsRNA被假设为触发细胞抗病毒反应(29). 许多细胞dsRNA识别蛋白与干扰素诱导的感染抗病毒反应有关。这些包括dsRNA-依赖性蛋白激酶PKR、2′，5′-寡腺苷酸合成酶和ADAR1(20,44,59,63). 最近，两种IFN诱导的、含有胱天蛋白酶募集结构域（CARD）的DExD/H家族解旋酶，即视黄酸诱导基因I（RIG-I）蛋白和黑色素瘤分化相关基因5（MDA-5）蛋白，被认为是病毒感染的关键传感器(1,30,56,66,67). 这些蛋白被病毒感染激活，可能通过识别dsRNA或感染期间产生的核糖核蛋白复合物，并传递下游信号以激活IFN-α/β反应(34).

转录因子干扰素调节因子3（IRF-3）在干扰素-α/β基因的激活中起着关键作用。IRF-3是一种处于非活性状态的细胞质蛋白，在丝氨酸和苏氨酸残基上过度磷酸化，二聚并积聚在细胞核中，参与初始IFN-α/β基因表达(37,68,69). RIG-I和MDA-5激活IRF-3以响应dsRNA或IRF-3激酶TBK-1和IKK上游的病毒感染(18,30,54,66). 这种信号似乎涉及解旋酶的CARD与另一种含有CARD的蛋白质IPS-1、MAVS、VISA或Cardif的同型相互作用(31,41,53,65).

病毒已经进化出多种机制来避免识别或阻止由干扰素介导的抗病毒反应(2,19). 一些这样的蛋白质也表现出dsRNA-结合活性。对抗细胞抗病毒反应的dsRNA-结合蛋白示例包括A型流感病毒（NS1A）和B型流感病毒的NS1蛋白、痘苗病毒的E3L蛋白、呼肠孤病毒的σ3蛋白和人巨细胞病毒的pTRS1蛋白(5,11,12,14,16,17,22,27,57). 虽然dsRNA结合似乎有助于干扰素拮抗剂的功能，但NS1A、NS1B和E3L具有额外的dsRNA结合诱导依赖机制来抑制细胞抗病毒反应。

已发现埃博拉病毒（EBOV）VP35蛋白可抑制IFN-α/β的产生和IRF-3的激活(三,4,9,23,48). 最近，有人认为VP35可能包含一个dsRNA-结合基序，类似于在a型流感病毒NS1蛋白中发现的基序(23). 进一步表明，这种dsRNA-结合活性可能是VP35抑制干扰素生成的能力所必需的(23). 这里，我们提供证据表明VP35具有dsRNA-结合活性，可能有助于干扰素拮抗。VP35很可能还具有dsRNA-binding-independent机制，靶向IRF-3激酶TBK-1和IKKɛ处或下游的一个点。

材料和方法

试剂。

CNBr活化的Sepharose 4B和聚核糖核苷酸poly（rI）·poly（r C）（pIC）来自英国Amersham Biosciences。兔抗hIRF-3（sc-9082）来自加州圣克鲁斯生物科技公司。绵羊多克隆抗人干扰素-β来自新泽西州PBL生物医学实验室。单克隆抗FLAG（M2）、poly（rA）·poly（rU）（pAU）、poly（rU）和poly（r A）来自Sigma（密苏里州）。与西奈山杂交瘤中心合作产生了抗埃博拉病毒扎伊尔VP35 N末端（6C5）和C末端（17C6）单克隆抗体。重组人干扰素-β来自Calbiochem（加州圣地亚哥）。

细胞系和病毒。

HEK293、293T和Vero细胞保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基中，补充10%胎牛血清、青霉素（100单位/ml）和链霉素（100μg/ml）。所有细胞系均在37°C和5%CO下培养2仙台病毒Cantell（SeV）和表达绿色荧光蛋白的新城疫病毒（NDV-GFP），如前所述(46)，在37°C的10天龄鸡胚中培养2天。

质粒。

埃博拉病毒扎伊尔VP35开放阅读框（ORF）是从其他地方描述的pcDNA3表达载体亚克隆的(4)，进入哺乳动物表达载体pCAGGS(45). VP35点突变体R312A和K309A是使用Quik-Change-XL试剂盒（Stratagene）通过定点突变产生的。RIG-I ORF是从pEF-BOS载体亚克隆的(56)pCAGGS中，并在克隆过程中添加了N末端FLAG标签序列。IPS-1（IFN-β启动子刺激因子1）是从ATCC获得的人类5751684 pCMV-SPORT6克隆中PCR扩增出来的，并用氨基末端血凝素标记克隆到pCAGGS中。编码人类FLAG-tagged TBK-1和IKKɛ的质粒由John Hiscott（麦吉尔大学）善意提供，之前已进行过描述(54). 报告载体pHISG-54-CAT（CAT，氯霉素乙酰转移酶）和pIFN-β-CAT已在前面描述过(8,61). 将萤火虫荧光素酶克隆到pCAGGS中作为转染对照。

报告基因分析。

293T细胞（1.6×106)通过磷酸钙沉淀法将指定数量的表达质粒DNA与ISG54-CAT或IFN-β-CAT报告质粒一起转染(51). 转染后20小时，用SeV（感染多重性[MOI]为8）裂解或感染细胞1小时。感染后12小时，用报告裂解缓冲液（Promega）裂解细胞并测定CAT活性(51). 按照制造商（Promega）的建议对萤火虫荧光素酶活性进行了测定，并用于使CAT活性正常化。报告基因激活表示为未诱导、空载体转染对照的诱导（折叠）。

干扰素生物测定。

将来自293T转染的SeV感染细胞的条件培养基（100μl）经紫外线处理以灭活感染的SeV，并覆盖在接种在96 well黑色微型滴定板（Costar，Corning，NY）中的Vero细胞上。在治疗24小时后，Vero细胞在6的MOI下感染IFN敏感性病毒NDV-GFP 1小时。感染后24小时，通过荧光显微镜评估病毒复制，并在FLUOstar OPTIMA平板阅读器（北卡罗来纳州BMG Labtechnologies）中量化GFP荧光，激发波长和发射波长分别为485和530 nm。为了验证是否存在干扰素-β，在将其覆盖在Vero细胞上之前30分钟，向指示的条件培养基中添加一种中和抗hIFN-β（最终浓度为～10μg/ml）。在NDV-GFP感染前24小时，将重组hIFN-β以一系列两倍稀释液直接添加到Vero细胞中，以诱导抗病毒效果。

聚（rI）·聚（rC）-Sepharose共沉淀和Western印迹。

用磷酸钙沉淀法将所示质粒转染293T细胞。在500μl裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，280 mM NaCl，1%Igepal，0.2 mM EDTA，2 mM EGTA，10%甘油）中裂解转染后24小时的细胞，并添加1 mM原钒酸盐，1 mM二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。将澄清的细胞裂解液与指定量的pIC-Sepharose悬浮液混合，之前用磷酸盐缓冲盐水清洗。将小球和细胞裂解物在4°C下轻轻搅拌培养2 h。然后用裂解缓冲液洗涤小球10次，在变性和还原条件下用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离沉淀蛋白。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭在溶于Tris缓冲盐水的5%脱脂奶粉中，然后用指示的一级抗体进行检测。使用与辣根过氧化物酶结合的二级抗体和化学发光检测系统（Perkin-Elmer）对抗原进行可视化。为了评估dsRNA结合的特异性，在pIC-Sepharose共沉淀之前，将细胞裂解物与可溶性竞争对手进行模拟处理或孵育，包括pIC、pAU、在体外生成的dsRNA、poly（rU）、polyrA和双链DNA（dsDNA）中的可溶性竞争对手。这些合成RNA的精确摩尔浓度是不可用的，因为制造商没有提供关于其长度的信息。在体外，200、400、600、800和1000 bp的dsRNA也被用作竞争物。这些dsRNAs是通过T7 RiboMax Express RNAi系统（Promega）使用从EBOV VP35 cDNA扩增的PCR片段生成的。正向PCR引物设计为5′-T7启动子序列，随后是VP35 ORF的前20个核苷酸。在VP35 ORF的不同位置退火反向引物，以生成所需长度的PCR产物。

细菌产生的VP35。

扎伊尔埃博拉病毒VP35的羧基端171个氨基酸通过羧基端六组氨酸标签表达，来自于pET22b（+）大肠杆菌折纸B宿主菌株。用塔龙钴金属亲和珠柱从细胞裂解液中纯化细菌产生的蛋白质。加载后，用含有17 mM咪唑的HEPES缓冲液清洗柱，以去除任何污染物，然后用含有250 mM咪唑啉的HEPES-缓冲液洗脱。

IRF-3二聚体形成。

如前所述，为了评估内源性IRF-3的激活，我们进行了一个分解IRF-3单体和二聚体的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(42). 使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将所示质粒转染HEK293细胞。转染后20小时，细胞被SeV（MOI为8）感染1小时。感染后8小时，细胞在50μl 50 mM Tris-HCl中溶解，pH 8.0，1%Igepal，150 mM NaCl，补充5 mM原钒酸盐和蛋白酶抑制剂混合物（Roche）。通过离心澄清裂解液，并将其装入7.5%天然聚丙烯酰胺凝胶中，该凝胶在40 mA下预运行30分钟，在阴极室和阳极室中分别加入和不加入0.2%脱氧胆酸钠。样品在25 mA下电泳50分钟。按照前面所述进行Western blot分析。以1:500稀释度使用兔抗hIRF-3抗体。

结果

VP35与dsRNA特异结合。

野生型VP35先前被假设与dsRNA结合，两个VP35点突变体R312A和K309A被预测在dsRNA结合中受损，并损害IFN拮抗剂的功能(23). 因此，我们通过体外“下拉”实验评估了这些VP35与dsRNA结合的能力。用血凝素标记VP35、未标记野生型VP35或未标记VP35突变（R312A或K309A）表达质粒转染293T细胞。作为对照，还包括编码萤火虫荧光素酶或之前描述的dsRNA-结合蛋白RIG-I的质粒(67). 然后将转染细胞的裂解液与裂解液/珠比为0.05的pIC-Sepharose珠培养。如图所示。​图1A，1安培RIG-I和野生型VP35与pIC珠共沉淀，而R312A和K309A均未检测到与pIC珠子结合。为了解决干扰素-α/β反应激活可能调节VP35功能的可能性，我们比较了模拟感染和SeV感染细胞中的dsRNA-结合活性，但发现野生型或突变型VP35的结合没有差异（图。​（图1A）。1安培). 注意，没有VP35与“空”Sepharose珠共沉淀（数据未显示）。最后，我们通过用于下拉分析的细胞裂解物的Western blotting证实所有VP35结构都以类似的水平表达（图。​（图1A1安培).

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埃博拉病毒VP35与dsRNA结合。（A）293T细胞转染500 ng指定蛋白表达质粒（Luc，萤火虫荧光素酶）。转染后20小时，细胞要么被模拟感染（mock），要么在MOI为8时被SeV感染。感染后12 h，制备细胞裂解物，并在4°C下与pIC-Sepharose孵育2 h。通过离心收集蛋白质复合物，洗涤10次，并用12%十二烷基硫酸钠-PAGE分离。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并使用抗Flag M2（WB:Flag）或抗VP35 6C5（WB:VP35）单克隆抗体通过Western blotting进行可视化。为了确定蛋白质表达水平，分离出一部分（2%）全细胞提取物（WCE）进行Western blotting。（B） 为了评估VP35突变体对dsRNA结合的损伤程度，将表达野生型VP35（VP35）或VP35突变型（R312A或K309A）的细胞中越来越多的裂解物与固定量的pIC-Sepharose孵育，以获得0.05、0.5和5（楔形物）的细胞裂解物/珠比率，结合情况如图a所示。通过Western blotting（WB:VP35）评估野生型和突变型VP35蛋白的输入水平。（C） 通过竞争试验确定dsRNA结合的特异性。在添加pIC Sepharose之前，将12.5、25、50和100μg/ml的可溶性pIC、pAU、poly（rU）（pU）、poly（rA）（pA）或dsDNA（来自鲑鱼精子）添加到细胞裂解物中（楔形，上图）。在添加pIC-Sepharose之前，在浓度为1、10、100、1000和10000 ng/ml的条件下进一步测试可溶性dsRNA分子（楔子，下面板）。（D） 通过在VP35序列前克隆一个T7驱动的启动子，在体外合成病毒RNA，从而生成不同长度的阳性或阴性转录物。在体外退火互补的ssRNAs以获得相应的dsRNAs。这些dsRNA在琼脂糖凝胶上进行分析。车道：1210 bp；2，409个基点；3609个碱基对；4809个基点；51013个基点。DNA阶梯位于最左侧的通道中，包含碱基对中指定大小的分子。（E） 在添加pIC-Sepharose之前，将含有野生型VP35的细胞裂解物在没有竞争对手（−）的情况下孵育，或在体外转录的dsRNA竞争对手分子中孵育（见面板D）。每个结合反应的dsRNA浓度为30 nM。作为对照，使用20μg/ml的可溶性pIC。如前所述，通过Western blotting检测VP35。（F） 野生型VP35（C-171）的羧基端171个氨基酸在带有C端His标签的细菌表达系统中产生，并使用Talon钴金属亲和柱纯化。如前所述，在pIC-Sepharose结合分析中以～80 ng/ml的浓度使用纯化蛋白，不使用（−）或使用（+）可溶性pIC作为竞争物。作为阳性对照，将野生型VP35-转染293T细胞的裂解物并排运行。输入代表用于免疫沉淀的总蛋白质的2%。用C末端10C7单克隆抗体检测VP35。

接下来，我们进一步评估了R312A和K309A突变体的dsRNA-结合活性受损的程度。将含有等量野生型或突变型VP35的细胞裂解物（5、50和500μl）与固定量的pIC珠培养，使细胞裂解物与pIC珠的比率分别为0.05、0.5和5。通过该方案，当使用50或500μl细胞裂解液时，我们能够共沉淀野生型VP35（图。​（图1B）。1B年). 点突变体R312A和K309A在Western blot中几乎未被检测到，尽管在所用的最高体积细胞裂解液中，R312A表现出非常弱的结合活性（图。​（图1B）。1B年). 为了解决VP35对dsRNA的结合特异性，在添加pIC微球之前，将不同的可溶性合成多核苷酸添加到含有VP35的裂解物中。只有dsRNA分子pIC和pAU能够与pIC-Sepharose竞争结合VP35（图。​（图1C）。1摄氏度). 在测试浓度下，单链RNA（ssRNAs）poly（rU）、poly（r A）和dsDNA（鲑鱼精子DNA）无法与pIC-Sepharose竞争。竞争分析所需的可溶性pIC和pAU相对较少，凸显了VP35对dsRNA型分子的特异性。只要100 ng/ml的合成pIC或pAU就足以消除VP35与pIC珠的结合，而100μg的ssRNA或dsDNA分子不足以阻止VP35的结合（图。​（图1C1摄氏度).

接下来，我们想评估VP35与具有更“自然”成分的dsRNA分子结合的能力（即VP35在受感染细胞中实际可能遇到的具有核苷酸成分的分子）。为此，从200到1000 bp大小的VP35 cDNA转录的单链RNA体外生成dsRNA分子（图。​（图1D）。一维). 这些分子中的每一个在大约30 nM的条件下使用时，都是一种有效的可溶性竞争对手，抑制VP35与pIC-Sepharose的结合（图。​（图1E）。1E级). 作为本实验的阳性对照，可溶于20μg/ml的pIC（图。​（图1E1E级).

为了研究VP35是否能直接与dsRNA结合，我们尝试在细菌表达系统中产生全长蛋白。然而，只有当羧基末端171个氨基酸（C-171）被表达和纯化时，才能获得可溶性形式的蛋白质。因为这个区域包含一个假定的dsRNA-结合基序(23)，我们在结合分析中测试了该突变蛋白。如图所示。​图1F，1楼，C-171与pIC微球共沉淀，可溶性pIC可有效竞争C-171结合（图。​（图1F1楼).

累积起来，这些数据表明VP35通过其羧基末端直接与dsRNA结合，突变R312A和K309A都显著削弱了这种活性。尽管更多的生化研究将进一步阐明VP35和dsRNA之间的相互作用，但我们接下来要问的是，这种活性是否在VP35的“IFN拮抗剂”活性中发挥关键作用。

VP35的dsRNA-binding突变体抑制SeV感染诱导的IFN-β基因表达。

dsRNA-结合活性是几种抑制宿主IFN应答的病毒蛋白共有的一种特性，包括甲型流感病毒NS1蛋白、乙型流感病毒NSI蛋白和痘苗病毒E3L蛋白(16,17,57,64). 这也是与宿主抗病毒反应有关的几种干扰素诱导蛋白的一种特性，其酶活性由dsRNA调节，包括PKR、OAS和ADAR1(52). 为了确定dsRNA结合可能影响VP35抑制IRF-3激活和IFN-α/β生成的能力的程度，我们比较了野生型VP35、R312A和K309A抑制表达CAT酶的IFN-β启动子报告质粒SeV诱导的激活的能力。虽然这些突变体先前被报道为干扰素拮抗剂活性受损，但我们希望对这两个突变体进行更定量的比较，并根据上述dsRNA结合数据解释这些结果。病毒感染后，报告基因在空载体转染细胞中强烈诱导表达（图。​（图2A）。2安培). 野生型VP35在所有测试的质粒DNA浓度下将这种激活抑制到背景水平。有趣的是，转染VP35和K309A（25纳克、250纳克或2500纳克质粒）可产生相当程度的抑制（图。​（图2A）。2安培). 当转染250和2500 ng质粒时，R312A突变体也抑制了报告基因的激活，但在25 ng时，抑制活性显著降低（图。​（图2A）。2安培). 报告基因激活的差异不是由于蛋白质表达的差异，因为所有构建物都显示出相似的蛋白质水平（图。​（图2A，2安培，插图）。这些数据表明，与野生型VP35和K309A相比，R312A突变体对SeV诱导的IFN应答的抑制效果较差，至少在这些蛋白表达水平相对较低时是如此。

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野生型和dsRNA-binding突变体VP35s抑制SeV感染诱导的IFN-β基因表达。（A） 将表达VP35和K309A和R312A突变体的质粒的浓度增加（25、250或2500 ng，用楔子表示），连同300 ng的IFN-β-CAT报告子和组成型pCAGGS-荧光荧光素酶报告子一起转染293T细胞。转染后20小时，细胞感染仙台病毒（MOI为8），并在感染后12小时测定CAT和荧光素酶活性。数值表示为空质粒模拟感染对照（未显示）的诱导（折叠）。病毒诱导的CAT活性归一化为萤火虫荧光素酶活性。误差条表示至少三个独立实验的标准偏差。通过Western blotting（inset）测定不同VP35结构的表达水平。用VP35（6C5）单克隆抗体检测印迹。显示了相同斑点的两次曝光；只有当胶片曝光过度（插图，下面板）时，才能检测到25-ng样本中的表达水平。（B） 紫外线照射后，将来自图a中所述实验的一系列两倍稀释的条件培养基覆盖在96孔板中的Vero细胞上。治疗后2h，细胞感染NDV-GFP（MOI of 6），感染后24h，用荧光显微镜检查病毒复制。显示了使用转染25、250或2500 ng VP35、R312A和K309A突变质粒的293T细胞的条件培养基时获得的结果。右栏：在空载体模拟感染面板中，NDV-GFP复制很容易被绿色荧光检测到。空载体SeV感染组缺乏GFP表达，表明IFN产生的抗病毒状态。由于仙台病毒感染转染的293T细胞，条件培养基中存在干扰素。这在空载体SeV感染加抗干扰素-β小组中得到证明，其中中和抗干扰物-β抗体可拯救NDV-GFP复制。所有面板均来自用16倍稀释的条件培养基处理的细胞。

接下来，我们利用干扰素生物测定评估了野生型VP35和dsRNA-结合突变体抑制SeV诱导的内源性干扰素-β生成的能力。在这些实验中，用空表达质粒或表达野生型VP35、R312A或K309A的质粒转染293T细胞。转染后一天，细胞被模拟感染或感染SeV（MOI为8）以诱导IFN生成。一天后，从这些细胞中提取培养基并用紫外线照射以灭活任何感染性SeV。然后将灭活培养基进行两次连续稀释，并转移至Vero细胞。该培养基中存在的干扰素（由SeV诱导）有望在Vero细胞中诱导抗病毒状态。隔夜培养后，取出培养基，然后用NDV-GFP（MOI of 6）感染Vero细胞。GFP的表达被用作病毒复制的指标。空载体转染293T细胞的SeV感染导致产生IFN，从而阻止NDV-GFP复制（图。​（图2B，2B型，比较空载体，模拟感染与空载体，SeV感染面板）。抗干扰素β抗体中和抗病毒活性的能力证明了干扰素-β在该试验中主要介导抗病毒作用（图。​（图2B，2B型，空载体，感染加抗干扰素β）。最后一项测试也证明了抗紫外线处理的活SeV对Vero细胞中NDV-GFP复制的任何影响。即使转染少量表达野生型VP35和K309A的质粒，也可以挽救Vero细胞中NDV-GFP的复制，表明这两种蛋白具有拮抗IFN-β生成的能力（图。​（图2B）。2B型). 当转染250或2500 ng表达质粒时，R312A突变株也能挽救NDV-GFP感染。最后一个突变体在阻止干扰素产生方面明显不如其他结构有效（图。​（图2B，2B型，中排）。因此，干扰素生物测定结果反映了报告基因测定，其中R312A突变体相对于野生型VP35和K309A突变体受损。然而，这两个dsRNA-结合突变体都保留了一些抑制SeV诱导的IFN-β生成的能力。

野生型VP35和dsRNA-binding突变体可抑制RIG-I介导的IFN-β基因激活。

据报道，RIG-I蛋白在检测病毒感染和激活IFN-α/β生成方面起着关键作用(30,56,67). RIG-I可能通过其DExD/H盒解旋酶结构域识别dsRNA，并通过其N末端CARD激活下游信号，从而激活IRF-3(30,56,67). 考虑到VP35抑制IRF-3激活的能力(三)，我们研究了野生型VP35和dsRNA-binding突变体是否可以阻断RIG-I激活的信号通路。首先，我们测试了VP35结构体阻止RIG-I诱导的IRF-3应答性ISG54启动子激活的能力。我们发现，在没有病毒感染的情况下，RIG-I在293T细胞中的过度表达足以激活该启动子。如图所示。​图3A，3A级与空质粒转染对照相比，转染250 ng RIG-I质粒可使启动子的诱导率提高6000倍以上。当2500ng野生型VP35或dsRNA结合突变体与RIG-I共转染时，观察到对报告基因激活的强烈抑制，表明野生型和dsRNA结合突变体形式的VP35可以通过RIG-I抑制病毒非依赖性信号传导（图。​（图3A）。3A级). 然而，RIG-I在病毒诱导的干扰素反应激活中发挥作用，病毒感染后RIG-I的表达导致干扰素-β基因的协同激活(56,67). 因此，我们还测试了VP35构建物抑制RIG-I转染的SeV感染细胞中报告基因激活的能力。为此，我们转染了少量（25 ng）RIG-I质粒DNA，并增加了野生型或突变型VP35质粒（2.5、25、250和2500 ng）的浓度，以及IFN-β-CAT报告基因。在这些条件下，仅RIG-I的过度表达就导致报告基因的30倍诱导。病毒感染后，空质粒转染细胞中报告基因的诱导率大于700倍。当25 ng RIG-I表达质粒转染到随后感染SeV的细胞中时，报告基因诱导增加到近4000倍（图。​（图3B）。第3页). 值得注意的是，野生型VP35在转染2500和250ng表达质粒后有效地阻断了这种协同激活。将VP35质粒的数量减少到25和2.5 ng会导致抑制活性的丧失（图。​（图3B）。第3页). R312A和K309A突变体也能够抑制报告基因的激活，但仅当转染更多的表达质粒时。随着突变DNA的稀释，干扰素拮抗剂活性迅速丧失（与野生型VP35相比）。为了验证报告基因激活的差异不是由于蛋白质表达的差异造成的，通过Western blot分析转染细胞的提取物。在所有转染中检测到相当数量的RIG-I（图。​（图3C，3C公司，顶部面板）。转染质粒DNA的两个最高浓度处很容易检测到不同的VP35，但在两个最低浓度处检测不到，这与转染中发现的干扰素拮抗剂功能减弱有关（图。​（图3C，3C公司，下部面板）。基于这些数据，dsRNA-binding突变体保留了抑制由SeV感染和RIG-I过度表达联合诱导的报告基因激活的能力，但突变体的效力低于野生型VP35。为了确定VP35的异位表达是否导致蛋白水平与病毒感染细胞中的蛋白水平相当，我们对转染细胞提取物和EBOV感染的Vero细胞提取物（感染后1，48小时的MOI）进行了VP35的Western blot分析。VP35在EBOV感染的细胞中的表达水平与用250或2500ng表达质粒转染的细胞中的水平相当（图。​（图3D）。三维). 因此，我们得出结论，在我们的转染实验中，我们正在研究VP35的生物学相关水平。

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野生型VP35和dsRNA-binding突变体抑制由RIG-I介导的IFN-β基因激活。（A）用250 ng RIG-I表达质粒转染293T细胞，转染或不转染2500 ng VP35或R312A或K309A突变质粒。以300 ng转染一个ISG54-CAT报告基因和一个组成性表达的萤火虫荧光素酶对照报告基因。在转染24 h后测量CAT和荧光素酶活性。数值表示为空载体转染对照的诱导（折叠）。误差线表示至少三个独立实验的标准偏差。（B） 293T细胞单独转染25 ng RIG-I表达质粒，或转染2.5、25、250和2500 ng所示VP35构建物（楔形显示数量增加）。转染后20小时，细胞被模拟感染或感染仙台病毒（MOI为8）。在300 ng时使用IFN-β-CAT报告基因和萤火虫荧光素酶转染控制质粒。在感染后12 h测量CAT和荧光素素酶活性。值如前所示。误差线表示至少三个独立实验的标准偏差。（C） 使用单克隆抗FLAG和抗VP35抗体，通过Western blotting评估B组所述实验中RIG-I、野生型VP35和VP35突变体的表达。（D） 如上所述，用每种VP35构建物（野生型VP35、R312A或K309A）的25、250和2500 ng（楔形物指示的增加量）转染293T细胞，并在转染后24小时制备细胞提取物。模拟感染或感染扎伊尔EBOV（MOI of 1）的Vero细胞裂解液在感染后48小时制备，并用γ射线照射以消除感染病毒。用Western blot检测VP35的表达。使用单克隆抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体作为负荷对照。（E） 如前所述进行干扰素生物测定（见图。​图2B）2B型)用UV照射的两倍稀释的来自之前面板B中描述的实验的条件培养基。主面板代表转染了2.5、25、250和2500 ng VP35质粒的293T细胞的上清液。所示为64倍稀释条件培养基处理的细胞数据。（F） 使用荧光板阅读器分析干扰素生物测定。给出了条件培养基所有两倍稀释的数据。▪, 空载体模拟感染；•，RIG-I，模拟感染；▴, 空载体，SeV感染；⧫，RIG-I，SeV感染；□, VP35加RIG-I，SeV感染；▵, K309A加RIG-I，SeV感染；○, R312A加RIG-I，SeV感染。仅显示了使用2.5μg质粒DNA转染的数据。年-轴值是相对GFP荧光单位。x个-轴值是条件培养基稀释度的倒数。这是一个重复三次的实验的代表性结果。

为了支持从干扰素-β报告试验中获得的结果，我们用这些转染细胞的培养基进行了干扰素生物测定。如生物测定所评估的那样，本实验中转染的有限量（25 ng）RIG-I质粒没有导致IFN-β的显著产生（图。​（图3E，第三方，右侧，顶部面板）。当含有RIG-I的细胞感染SeV时，与空载体SeV感染的对照组相比，IFN-β分泌大大增强（图。​（图3E，第三方，右侧面板，比较感染空载体SeV和感染RIG-I、SeV的面板）。应注意，图。​图3E，第三方细胞上清液被稀释64倍，而在之前的实验中（图。​（图2B），2B型)，将上清液稀释16倍。这就是为什么在图。​图3E第三方来自空载体、SeV感染样本的培养基并不会大大减少NDV-GFP的复制。此外，添加一种中和性抗干扰素-β抗体可以恢复NDV-GFP感染（图。​（图3E，第三方，RIG-I，SeV感染加抗IFN-β）。转染250或2500 ng VP35质粒可抑制RIG-I加SeV诱导的IFN-β分泌（图。​（图3E，第三方，VP35配线架）。在本实验中，与野生型VP35相比，每个dsRNA-binding突变体表现出降低的IFN抑制活性。即使转染2500 ng质粒，R312A突变体的活性也明显降低，尽管一些抑制IFN-β生成的能力仍然很明显（图。​（图3E，第三方，R312A面板）。K309A突变体显示出更强的干扰素-β-拮抗剂活性，但仍不如野生型VP35有效（图。​（图3E，第三方，K309A面板）。干扰素生物测定的结果也在荧光板阅读器中进行了分析（图。​（图3F）。第三层). 空载体或RIG-I转染和模拟感染的培养基未产生足以诱导Vero细胞抗病毒状态的IFN-β水平；因此，在用这些上清液处理的细胞中，NDV-GFP显示出GFP荧光评估的最高复制水平（图。​（图3F，第三层，分别填充圆形和方形）。来自SeV感染、RIG-I转染细胞的培养基必须稀释约1000倍，才能失去可检测的IFN活性（图。​（图3F，3英尺，填充钻石）。相反，需要128倍的稀释才能消除空载体转染的SeV感染细胞中的IFN活性，这证实了IFN-β报告试验中观察到的协同效应（图。​（图3F，第三层，填充三角形）。当VP35以2500 ng转染SeV感染的细胞时，只需要8到16倍的稀释就可以消除培养基中的IFN活性（图。​（图3F，第三层，空方块）。转染2500 ng dsRNA-binding突变体的细胞在SeV感染后显示中间水平的IFN-β生成，R312A突变体（图。​（图3F，第三层，空圆圈）比K309A突变型（图。​（图3F，第三层，空三角形）。然而，这两个突变体都保留了一些抑制IFN-β生成的能力。这些结果表明，在增强IFN诱导条件下，这两个dsRNA-binding突变体的IFN拮抗剂效果不如野生型VP35；然而，突变体保留了一些活性。

VP35和dsRNA结合突变体对病毒和RIG-I介导的IRF-3活化的影响。

IRF-3在dsRNA和病毒诱导激活IFN-α/β和IFN-刺激的基因表达中起关键作用(37,62,69). 病毒感染后，IRF-3在其C末端的关键丝氨酸/苏氨酸残基处磷酸化，触发其同二聚体化，并与细胞核中的共转录激活物结合(28,37,42,68). IRF-3二聚化经常被用作其活化的测量手段，并且可以通过天然PAGE分析进行监测(28,42). 在这里，我们发现与空质粒感染对照组相比，野生型VP35抑制了SeV诱导的内源性IRF-3二聚体形成（图。​（图4，4，顶部面板）。在K309A表达细胞中仅检测到弱IRF-3二聚体形成。相反，在用R312A突变体转染的细胞中很容易检测到IRF-3二聚化，尽管二聚体水平仍然低于在空载体、SeV感染的对照中观察到的水平（图。​（图4，4，顶部面板）。当RIG-I在感染SeV的细胞中过度表达时，内源性IRF-3二聚体在表达野生型VP35和K309A的细胞中再次被阻断。相反，表达R312A突变体的细胞中IRF-3二聚体增强（图。​（图4，4，顶部面板）。接下来，我们检查了观察到的IRF-3激活模式是否与内源性IRF-3应答基因人类561基因的转录相关。该基因的产物，即P56蛋白，在病毒感染期间很容易以IRF-3依赖的方式被诱导(21,47). 用抗P56抗体进行免疫印迹分析用于IRF-3二聚体形成的相同细胞提取物。空载体转染的模拟感染细胞裂解物不含可检测的P56水平，但在SeV感染后8小时，P56明显被诱导（图。​（图4，4，中间面板）。野生型VP35和K309A是单独由病毒或RIG-I加病毒诱导的P56表达的强抑制剂。R312A突变体不能完全抑制病毒感染诱导的P56表达，在感染RIG-I+病毒的细胞中，R312A突变体的损伤更为明显。因此，R312A突变体在阻止IRF-3激活和随后的基因激活方面不如野生型VP35或K309A突变体有效。

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VP35和dsRNA-binding突变体对病毒和RIG-I介导的IRF-3激活的影响。用4μg表达野生型VP35（VP35）、R312A和K309A的质粒转染HEK293细胞，如图所示，加入或不加入40 ng RIG-I质粒。如图所示，转染后20小时，细胞要么被模拟SeV感染，要么被仙台病毒感染（MOI为8）。感染后8小时，细胞被裂解，蛋白质被分离在一个连续的7.5%天然凝胶中，该凝胶在阴极室和阳极室分别预运行有和没有0.2%脱氧胆酸钠。通过Western blotting检测内源性IRF-3，使用一种初级兔抗hIRF-3（1:500）抗体和一种次级山羊抗兔免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶（1:5000）抗体（顶面板）。在12.5%十二烷基硫酸钠-PAGE分离蛋白质后，通过Western blotting分析P56和不同形式的VP35在同一细胞裂解液中的表达。使用小鼠抗人β-微管蛋白抗体作为负荷对照。

野生型VP35和dsRNA-binding突变体可削弱IPS-1、TBK1和IKK诱导的IFN-β报告基因激活。

由于VP35的dsRNA-binding突变体保留了对抗病毒感染和RIG-I诱导的IFN-β生成的能力，我们试图研究这些突变体破坏RIG-I下游信号成分的能力，这些成分既不与dsRNA感观也不与dsRNA-直接相互作用。最近描述的含CARD的蛋白质IPS-1，也称为MAVS、VISA或Cardif，已被证明在RIG-I下游发挥作用，并作为RIG-I信号转导的适配器分子(31,41,53,65). 如前所述，当我们在293T细胞中过度表达IPS-1时，IFN-β启动子被强烈诱导。值得注意的是，野生型VP35、K309A和R312A均表现出类似的IPS-1对报告基因激活的浓度依赖性抑制（图。​（图5A）。5A级). 接下来，为了进一步了解VP35可能影响RIG-I/IRF-3信号传导的位置，我们研究了VP35对IRF-3激酶TBK1和IKKɛ激活IFN-β启动子的影响。这些激酶负责IRF-3的磷酸化(18,54)和IPS-1下游功能(31,53). 如前所述，TBK1和IKKɛ的过度表达能够强烈诱导报告基因激活。令人惊讶的是，正如用IPS-1观察到的那样，野生型VP35和dsRNA结合突变体显示出激酶对报告基因激活的类似浓度依赖性抑制（图。5B和C).

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野生型VP35和dsRNA-binding突变体阻断IPS-1-、TBK-1-和IKK诱导的IFN-β基因激活。（A） 293T细胞转染25、250和2500 ng（楔形）所示VP35构建物以及25 ng IPS-1表达质粒。此外，所有转染均含有300 ng IFN-β-CAT报告子和pCAGGS-荧光荧光素酶质粒。误差条表示至少三个独立实验的标准偏差。（B） 实验与A组相同，但以50 ng TBK-1表达质粒作为基因表达激活剂。（C） 实验按A组进行，但以50 ng IKKɛ表达质粒作为基因表达激活剂。

累积起来，这些数据表明VP35的dsRNA-binding活性可能在其通过病毒感染抑制IRF-3信号传递的能力中发挥作用。然而，由于野生型VP35和dsRNA-binding突变体可以同样阻断病毒-RIG-I通路的下游信号成分，因此独立于dsRNA-binding活性的机制很可能促成VP35的IFN拮抗活性。

讨论

长期以来，病毒复制过程中产生的dsRNA物种被认为是先天性抗病毒反应的潜在触发因素。最近，DExD/H盒解旋酶RIG-I和MDA-5被证明作为病毒dsRNA传感器，导致IFN-α/β的产生(1,56,66,67). 病毒进化出了逃避这种识别的机制，一些编码蛋白，如痘苗病毒的E3L蛋白、甲型和乙型流感病毒的NS1蛋白以及呼肠孤病毒的σ3蛋白，据报道，这些蛋白通过与dsRNA结合，至少部分地对抗宿主的抗病毒反应(5,16,17,64).

最近，有人认为EBOV VP35蛋白可能具有dsRNA-结合活性，这一功能可能是其干扰素拮抗剂特性所必需的(23). 本报告首次对与VP35相关的dsRNA-binding活性进行了实验验证。我们使用了一种已建立的“下拉”实验，其中pIC共价结合到Sepharose珠，用于共沉淀一种可能的dsRNA-结合蛋白。这种测定最近已被用于证明细胞蛋白RIG-I和人巨细胞病毒蛋白pTRS1的dsRNA结合活性(22,67). 我们发现，存在于模拟感染或SeV感染的293T细胞的全细胞提取物中的VP35可以与pIC-Sepharose珠共沉淀。有几条证据表明，VP35与pIC微球的相互作用对dsRNA是特异的。首先，VP35没有检测到与没有核酸交联的Sepharose微球共沉淀（数据未显示）。第二，无论是合成的同寡聚体ssRNA分子[聚（rA）和聚（rU）]还是dsDNA，在任何测试浓度下，都不能与pIC珠竞争与VP35的结合。相反，三种类型的dsRNA分子确实有效地与pIC微球竞争与VP35的结合。可溶性pIC和pAU能够与pIC-Sepharose竞争VP35结合，即使可溶性dsRNAs的数量是测试的单链或dsDNA分子数量的1000倍。此外，从EBOV cDNA体外转录的具有更“自然”结构和复杂性的dsRNA分子（大小约为200到1000 bp）也有效地竞争与VP35的结合。

为了研究VP35是否可以直接与dsRNA相互作用，我们试图使用纯化的、细菌表达的VP35。虽然全长VP35不能以可溶性形式产生，但我们最终能够产生有限量的可溶性截短VP35（氨基酸171到340）。突变蛋白与pIC-Sepharose微珠共沉淀，可溶性pIC可以有效竞争结合，表明VP35可以直接与dsRNA相互作用。一个重要的目标是产生dsRNA-binding，突变版本的C-171，并对这些蛋白的dsRNA-inding亲和力进行更广泛的生化比较。

鉴于VP35抑制IRF-3激活和IFN-β生成的能力，以及其dsRNA-结合活性，我们检测了野生型和突变型VP35抑制病毒诱导的IFN反应的能力。如前所述，野生型VP35抑制SeV诱导的IRF-3活化和IFN-β的产生(三,23). 之前，当测试这两个dsRNA-binding突变体抑制SeV诱导的IRF-3应答的ISG56启动子激活的能力时，发现它们大部分处于非活性（R312A）和中间活性（K309A）(23). 在本研究中，通过滴定每个VP35结构体的数量，我们发现了一个类似的模式，其中R312A突变体比K309A突变体受损更严重，尽管这两个突变体都不能检测到结合dsRNA。然而，最重要的是，我们发现这两个突变都保留了一些阻止IFN-β启动子激活的能力，内源性IFN-β蛋白的产生和IRF-3的激活。因此，如上所述，当SeV单独用作激活剂时，dsRNA-结合活性可能对VP35的干扰素拮抗活性不是绝对必要的。

目前解释病毒感染如何激活IFN-α/β基因表达的模型将RIG-I置于导致IRF-3激活的途径的早期，至少在体细胞和常规树突状细胞中是如此(30,35). 然而，值得注意的是，另一种细胞RNA解旋酶MDA-5也被鉴定为病毒感染的传感器，导致IRF-3激活和IFN产生(1,66). 这些细胞解旋酶的激活导致需要IPS-1的信号通路，随后TBK-1和IKK会磷酸化IRF-3(7,25,31,65).

鉴于RIG-I和MDA-5都被认为是dsRNA激活的病毒感染传感器，我们询问野生型和突变型VP35是否会通过RIG-I抑制信号传导。当RIG-I过度表达时，VP35及其突变体能够抑制IRF-3应答的ISG54启动子激活，表明VP35在导致IRF-3激活的信号通路中作用于RIG-I水平或RIG-I下游。为了进一步支持这一结论，当随后感染SeV的细胞中表达相对少量的RIG-I时，检测到IFN-β表达的强大协同激活，并且VP35保留其阻止这种激活的能力。当单独使用病毒作为激活剂时，dsRNA结合突变体相对于野生型VP35均受损；然而，K309A突变体的受损程度再次低于R312A。为了将基因表达数据与IRF-3的激活联系起来，我们通过二聚体分析直接检测了在野生型和突变型VP35缺失或存在的情况下内源性IRF-3激活情况。与我们的其他发现一致，R312A突变体在抑制IRF-3二聚体方面不如野生型VP35或K309A有效。无论SeV或SeV plus RIG-I被用作激活剂，这都是正确的。对一种IRF-3反应性内源性基因产物P56的检测进一步证实了这一结论。值得注意的是，我们的报告基因数据与我们检测IRF-3二聚体和P56基因表达激活的数据之间存在普遍相关性。在所有情况下，野生型VP35是比K309A更有效的IRF-3抑制剂，而K309A是比R312A更有效的抑制剂。然而，该试验无法区分两种样品中IRF-3均被强烈激活的不同样品。因此，尽管SeV感染单独诱导的总报告基因表达低于RIG-I加病毒感染的表达，但在单独被SeV激活的细胞和同时感染RIG-I和仙台病毒的细胞之间，我们看不到IRF-3二聚体水平的差异。这种明显的差异可能反映了几个事实。报告基因的激活是通过CAT酶的积累来评估的，CAT酶是一种相对稳定的蛋白质，半衰期约为50小时(58). 另一方面，像IRF-3这样的内源性蛋白经历了磷酸化依赖性激活和磷酸化依赖降解的动态过程，特别是在病毒感染期间，当反应以更快的动力学发生时(37). 因此，我们的蛋白质印迹代表了IRF-3激活的“快照”。此外，在我们的SeV感染期间，很可能100%的细胞被感染，因此观察到的内源性基因激活模式代表了整个细胞群。相比之下，VP35只会影响转染细胞中内源性基因的激活。尽管293T细胞的转染效率通常很高，但不太可能达到100%。因此，虽然接受报告基因的所有转染细胞都含有不同的VP35结构并对报告基因诱导产生直接影响，但内源性基因激活模式将反映成功转染VP35的细胞的平均效果。显而易见的是，这两种dsRNA突变体在病毒感染期间都保持了强大的干扰素拮抗剂功能，但在强刺激条件下（即RIG-i加病毒感染）测试时会受损。然而，K309A突变体似乎是比R312A突变体更有效的干扰素拮抗剂。

最后，我们评估了野生型和突变型VP35s靶向RIG-I下游IRF-3激活信号通路组分的能力。我们的结果表明，野生型和dsRNA-结合突变型VP35具有同等的能力来抑制IPS-1过度表达诱导的IFN-β启动子的激活，RIG-I下游最近发现的一种信号分子，通过IRF-3激酶TBK-1和IKKɛ的过度表达。这些数据支持这样的假设，即虽然dsRNA-binding活性可能有助于VP35干扰素拮抗剂的功能，但VP35很可能通过损害TBK-1和IKK下游的信号传导而具有dsRNA-independent功能。也有证据表明，A型流感病毒NS1蛋白和B型流感病毒NS1蛋白以dsRNA-结合诱导的干扰素产生为靶点(16,17).

还应记住，dsRNA-binding活性也可能影响VP35的其他功能。VP35抑制宿主天然抗病毒反应其他方面的能力尚未详细研究。除了抑制干扰素的产生外，流感病毒NS1蛋白和痘苗病毒E3L蛋白还抑制其他抗病毒功能，包括具有抗病毒活性的dsRNA活化蛋白，如PKR、2′、5′-寡腺苷酸合成酶和RNA特异性腺苷脱氨酶ADAR1(6,13,15,24,33,38,39,49,50,55,60). E3L也抑制细胞凋亡(32,40)而B型流感病毒NS1蛋白抑制ISG15酸化(70-72). 也有证据表明，NS1和E3L可以抑制RNA沉默，尽管RNA沉默在哺乳动物细胞抗病毒反应中的作用尚不清楚(10,36). VP35拮抗这些功能的能力及其dsRNA-结合活性在任何抑制中的可能作用可能令人感兴趣。除了与宿主细胞途径的相互作用外，VP35还在病毒RNA合成和病毒核衣壳结构的形成中发挥重要作用。dsRNA-结合活性也可能影响这些功能(26,43). R312A和K309A突变体的可用性是解决VP35 dsRNA-结合活性的其他潜在功能的第一步。

鸣谢

这项工作得到了国家卫生研究院对C.F.B.的拨款支持，包括AI053571和AI059536。C.F.B.是埃里森医学基金会全球传染病新学者奖的获得者。W.B.C.得到了东北生物防御中心Lipkin，PI（AI057158）颁发的奖学金的支持。M.G.和Y.-M.L.得到了NIH拨款AI060389、Burroughs Wellcome基金会传染病发病机制奖研究员和Ellison医学基金会全球传染病研究新学者项目（ID-NS-0032）的支持。M.G.是为纪念Bill S.Vowell博士而设立的Nancy C.和Jeffery A.Marcus医学研究学者。E.O.S.得到了NIH AI053423和Burroughs Wellcome基金生物医学科学职业奖的支持。

我们感谢Ganes C.Sen（克利夫兰诊所）提供抗P56抗体，感谢John Hiscott（麦吉尔大学）、David E.Levy（纽约大学）和Adolfo García-Sastre（西奈山医学院）提供质粒。我们感谢Ben K.Chen（西奈山医学院）提供荧光板阅读器的访问和培训。我们感谢劳伦斯·W·梁（Lawrence W.Leung）在评估转染细胞与感染细胞中VP35水平方面提供的帮助，感谢他批判性地阅读了原稿，感谢莫里西奥·桑切斯（Mauricio Sanchez）提供的卓越技术援助。

参考文献

1Andrejeva，J.、K.S.Childs、D.F.Young、T.S.Carlos、N.Stock、S.Goodbourn和R.E.Randall。副粘病毒的V蛋白结合干扰素诱导的RNA解旋酶mda-5，并抑制其激活干扰素β启动子。程序。国家。阿卡德。科学。美国 101:17264-17269.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Basler、C.F.和A.Garcia-Sastre。病毒和I型干扰素抗病毒系统：诱导和规避。国际免疫学评论。 21:305-337. [公共医学][谷歌学者]
三。Basler，C.F.、A.Mikulasova、L.Martinez-Sobrido、J.Paragas、E.Muhlberger、M.Bray、H.D.Klenk、P.Palese和A.Garcia-Sastre。埃博拉病毒VP35蛋白抑制干扰素调节因子3的激活。J.维罗尔。 77:7945-7956.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4.Basler，C.F.、X.Wang、E.Muhlberger、V.Volchkov、J.Paragas、H.D.Klenk、A.Garcia-Sastre和P.Palese。埃博拉病毒VP35蛋白作为I型干扰素拮抗剂发挥作用。程序。国家。阿卡德。科学。美国 97:12289-12294.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Beattie，E.、K.L.Denzler、J.Tartaglia、M.E.Perkus、E.Paoletti和B.L.Jacobs。1995.通过呼肠孤病毒S4基因的表达逆转缺乏E3L的痘苗病毒的干扰素敏感性表型。J.维罗尔。 69:499-505.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Bergmann，M.、A.Garcia-Sastre、E.Carnero、H.Pehamberger、K.Wolff、P.Palese和T.Muster。流感病毒NS1蛋白对抗PKR介导的复制抑制。J.维罗尔。 74:6203-6206.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Bin、L.H.、L.G.Xu和H.B.Shu。TIRP，一种参与TIR信号传导的新型Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域适配蛋白。生物学杂志。化学。 278:24526-24532. [公共医学][谷歌学者]
8Bluyssen，H.A.、R.J.Vlietstra、A.van der Made和J.Trapman。1994年。干扰素刺激基因54 K启动子包含两个强度不同的相邻功能性干扰素模拟反应元件，它们协同作用以获得最大干扰素-α诱导率。欧洲生物化学杂志。 220:395-402. [公共医学][谷歌学者]
9Bosio，C.M.、M.J.Aman、C.Grogan、R.Hogan、G.Ruthel、D.Negley、M.Mohamadzadeh、S.Bavari和A.Schmaljohn。埃博拉病毒和马尔堡病毒在单核细胞衍生的树突状细胞中复制，但不诱导细胞因子的产生和完全成熟。J.感染。数字化信息系统。 188:1630-1638. [公共医学][谷歌学者]
10Bucher，E.、H.Hemmes、P.de Haan、R.Goldbach和M.Prins。2004年A型流感病毒NS1蛋白结合小干扰RNA并抑制植物中RNA沉默。《病毒遗传学杂志》。 85:983-991. [公共医学][谷歌学者]
11Chang，H.W.和B.L.Jacobs。1993年。确定痘苗病毒E3L基因产物与双链RNA结合所必需的保守基序。病毒学 194:537-547. [公共医学][谷歌学者]
12Chang、H.W.、L.H.Uribe和B.L.Jacobs。1995年。通过E3L突变体拯救缺乏E3L基因的痘苗病毒。J.维罗尔。 69:6605-6608.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Chang，H.W.，J.C.Watson和B.L.Jacobs。牛痘病毒的E3L基因编码一种干扰素诱导的双链RNA依赖蛋白激酶抑制剂。程序。国家。阿卡德。科学。美国 89:4825-4829.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Dauber，B.、G.Heins和T.Wolff。B型流感病毒非结构NS1蛋白对于有效的病毒生长和对抗β-干扰素诱导至关重要。J.维罗尔。 78:1865-1872.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Davies，M.V.、H.W.Chang、B.L.Jacobs和R.J.Kaufman。1993.E3L和K3L牛痘病毒基因产物通过不同机制抑制双链RNA依赖性蛋白激酶来刺激翻译。J.维罗尔。 67:1688-1692.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Donelan，N.R.、C.F.Basler和A.Garcia-Sastre。表达RNA-结合缺陷NS1蛋白的重组甲型流感病毒诱导高水平的β-干扰素，并在小鼠中减弱。J.维罗尔。 77:13257-13266.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17.Donelan，N.R.、B.Dauber、X.Wang、C.F.Basler、T.Wolff和A.Garcia-Sastre。B型流感病毒NS1蛋白的N端和C端结构域可以独立抑制IRF-3和β-干扰素启动子的激活。J.维罗尔。 78:11574-11582.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Fitzgerald，K.A.、S.M.McWhirter、K.L.Faia、D.C.Rowe、E.Latz、D.T.Golenbock、A.J.Coyle、S.M Liao和T.Maniatis。IKKepsilon和TBK1是IRF3信号通路的重要组成部分。自然免疫学。 4:491-496. [公共医学][谷歌学者]
19.Garcia Sastre，A。负链RNA病毒中I型干扰素病毒拮抗剂的鉴定和特征。货币。顶部。微生物。免疫学。 283:249-280. [公共医学][谷歌学者]
20Gribaudo，G.、D.Lembo、G.Cavallo、S.Landolfo和P.Lengyel。1991年。干扰素作用：在感染脑心肌炎病毒的干扰素处理HeLa细胞中，病毒RNA与40-千道尔顿2′-5′-寡腺苷酸合成酶的结合。J.维罗尔。 65:1748-1757.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21郭，J.，K.L.Peters和G.C.Sen。干扰素、双链RNA或病毒感染诱导人类蛋白P56。病毒学 267:209-219. [公共医学][谷歌学者]
22Hakki，M.和A.P.Geballe。2005.人类巨细胞病毒pTRS1的双标记RNA结合。J.维罗尔。 79:7311-7318.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Hartman，A.L.、J.S.Towner和S.T.Nichol。扎伊尔埃博拉夫病毒VP35的C末端基本氨基酸基序对于I型干扰素拮抗剂至关重要，并且与另一种干扰素对抗剂，即甲型流感病毒的NS1蛋白的RNA结合域高度一致。病毒学 328:177-184. [公共医学][谷歌学者]
24Hatada、E.、S.Saito和R.Fukuda。带有缺陷NS1蛋白的变异流感病毒不能阻止感染细胞中PKR的激活。J.维罗尔。 73:2425-2433.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Hemmi，H.、O.Takeuchi、T.Kawai、T.Keisho、S.Sato、H.Sanjo、M.Matsumoto、K.Hoshino、H.Wagner、K.Takeda和S.Akira。2000.Toll样受体识别细菌DNA。自然 408:740-745. [公共医学][谷歌学者]
26Huang，Y.、L.Xu、Y.Sun和G.J.Nabel。埃博拉病毒核衣壳的组装需要病毒相关蛋白35和24以及核蛋白的翻译后修饰。分子电池 10:307-316. [公共医学][谷歌学者]
27.Imani，F.和B.L.Jacobs。干扰素诱导蛋白激酶的抑制活性与呼肠孤病毒血清型1σ3蛋白相关。程序。国家。阿卡德。科学。美国 85:7887-7891.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28岩村、T.、M.Yoneyama、K.Yamaguchi、W.Suhara、W.Mori、K.Shiota、Y.Okabe、H.Namiki和T.Fujita。2001.诱导IRF-3/-7激酶和NF-kappaB对双链RNA和病毒感染的反应：常见和独特的途径。基因细胞 6:375-388. [公共医学][谷歌学者]
29Jacobs，B.L.和J.O.Langland。1996.当两股优于一股时：细胞对双链RNA反应的介质和调节剂。病毒学 219:339-349. [公共医学][谷歌学者]
30Kato，H.、S.Sato、M.Yoneyama、M.Yamamoto、S.Uematsu、K.Matsui、T.Tsujimura、K.Takeda、T.Fujita、O.Takeuchi和S.Akira。RIG-I在抗病毒反应中的细胞类型特异性参与。免疫 23:19-28. [公共医学][谷歌学者]
31Kawai，T.、K.Takahashi、S.Sato、C.Coban、H.Kumar、H.Kato、K.J.石井、O.Takeuchi和S.Akira。IPS-1，一种触发RIG-I和Mda5介导的I型干扰素诱导的适配器。自然免疫学。 6:981-988. [公共医学][谷歌学者]
32Kibler，K.V.、T.Shors、K.B.Perkins、C.C.Zeman、M.P.Banaszak、J.Biesterfeldt、J.O.Langland和B.L.Jacobs。双标记RNA是痘苗病毒感染细胞凋亡的触发因素。J.维罗尔。 71:1992-2003.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Langland，J.O.和B.L.Jacobs。2004年。痘苗病毒对PKR的抑制：E3L的N端和C端结构域的作用。病毒学 324:419-429. [公共医学][谷歌学者]
34利维、D.E.、I.玛丽和A.普拉卡什。2003年，敲响干扰素警报：先天免疫和适应性免疫界面基因表达的差异调节。货币。操作。免疫学。 15:52-58. [公共医学][谷歌学者]
35利维、D.E.和I.J.玛丽。2004.装配抗病毒防御系统-它在CARD中。自然免疫学。 5:699-701. [公共医学][谷歌学者]
36.Li，W.X.，H.Li，R.Lu，F.Li、M.Dus、P.Atkinson、E.W.Brydon、K.L.Johnson、A.Garcia-Sastre、L.A.Ball、P.Palese和S.W.Ding。流感和痘苗病毒的干扰素拮抗蛋白是RNA沉默的抑制物。程序。国家。阿卡德。科学。美国 101:1350-1355.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Lin，R.、C.Heylbroeck、P.M.Pitha和J.Hiscott。IRF-3转录因子的病毒依赖性磷酸化调节核转位、反式激活潜能和蛋白酶体介导的降解。分子细胞。生物。 18:2986-2996.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Liu，Y.、K.C.Wolff、B.L.Jacobs和C.E.Samuel。疫苗病毒E3L干扰素抵抗蛋白抑制干扰素诱导的腺苷脱氨酶A-to-I编辑活性。病毒学 289:378-387. [公共医学][谷歌学者]
39Lu，Y.、M.Wambach、M.G.Katze和R.M.Krug。1995年。流感病毒NS1蛋白与双链RNA的结合抑制磷酸化eIF-2翻译起始因子的蛋白激酶的激活。病毒学 214:222-228. [公共医学][谷歌学者]
40Marques，J.T.、D.Rebouillat、C.V.Ramana、J.Murakami、J.E.Hill、A.Gudkov、R.H.Silverman、G.R.Stark和B.R.Williams。双链RNA下调p53调节抗病毒反应。J.维罗尔。 79:11105-11114.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Meylan，E.、J.Curran、K.Hofmann、D.Moradpour、M.Binder、R.Bartenschlager和J.Tschopp。Cardif是RIG-I抗病毒途径中的衔接蛋白，是丙型肝炎病毒的靶向蛋白。自然 437:1167-1172. [公共医学][谷歌学者]
42Mori，M.、M.Yoneyama、T.Ito、K.Takahashi、F.Inagaki和T.Fujita。干扰素调节因子3的Ser-386作为决定活化的诱导磷酸化的关键靶点的鉴定。生物学杂志。化学。 279:9698-9702. [公共医学][谷歌学者]
43Muhlberger、E.、M.Weik、V.E.Volchkov、H.D.Klenk和S.Becker。1999.使用人工复制系统比较马尔堡病毒和埃博拉病毒的转录和复制策略。J.维罗尔。 73:2333-2342.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Nanduri，S.、B.W.Carpick、Y.Yang、B.R.Williams和J.Qin。蛋白激酶PKR双链RNA-结合域的结构揭示了其dsRNA-介导活化的分子基础。EMBO J。 17:5458-5465.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Niwa，H.、K.Yamamura和J.Miyazaki。利用新型真核载体高效选择高表达转染体。基因 108:193-199. [公共医学][谷歌学者]
46Park、M.-S.、M.L.Shaw、J.Munoz-Jordan、J.F.Cros、T.Nakaya、N.Bouvier、P.Palese、A.Garcia-Sastre和C.F.Basler。基于新城疫病毒（NDV）的检测表明NDV蛋白和尼帕病毒V、W和C蛋白具有干扰素拮抗活性。J.维罗尔。 77:1501-1511.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47彼得斯、K.L.、H.L.史密斯、G.R.斯塔克和G.C.参议员。针对双链RNA，561和IFN-beta基因的IRF-3依赖性、NFkappa B和JNK非依赖性激活。程序。国家。阿卡德。科学。美国 99:6322-6327.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48里德、S.P.、W.B.卡德纳斯和C.F.巴斯勒。同源低聚化促进了埃博拉病毒VP35蛋白的干扰素拮抗活性。病毒学 341:179-189.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Rivas，C.、J.Gil、Z.Melkova、M.Esteban和M.Diaz-Guerra。疫苗病毒E3L蛋白是干扰素（i.f.n.）诱导的2-5A合成酶的抑制剂。病毒学 243:406-414. [公共医学][谷歌学者]
50Romano，P.R.、F.Zhang、S.L.Tan、M.T.Garcia-Barrio、M.G.Katze、T.E.Dever和A.G.Hinnebusch。牛痘病毒E3对双链RNA依赖性蛋白激酶PKR的抑制：复合物形成和E3 N末端结构域的作用。分子细胞。生物。 18:7304-7316.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Sambrook，J.、E.Fritsch和T.Maniatis。1989年，《分子克隆：实验室手册》，第二版。，第3卷《纽约州冷泉港冷泉港实验室出版社》。
52.塞缪尔，C.E。2001.干扰素的抗病毒作用。临床。微生物。版次。 14:778-809.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
53Seth，R.B.、L.Sun、C.K.Ea和Z.J.Chen。MAVS是一种激活NF-kappaB和IRF3的线粒体抗病毒信号蛋白。单元格 122:669-682. [公共医学][谷歌学者]
54Sharma，S.、B.R.tenOever、N.Grandvaux、G.P.Zhou、R.Lin和J.Hiscott。通过IKK相关途径触发干扰素抗病毒反应。科学类 300:1148-1151. [公共医学][谷歌学者]
55Sharp，T.V.、F.Moonan、A.Romashko、B.Joshi、G.N.Barber和R.Jagus。牛痘病毒E3L基因产物与PKR的调节区和底物结合区相互作用：对PKR自动调节的影响。病毒学 250:302-315. [公共医学][谷歌学者]
56Sumpter，R.，Jr.、Y.M.Loo、E.Foy、K.Li、M.Yoneyama、T.Fujita、S.M.Lemon和M.Gale，Jr。2005.通过细胞RNA解旋酶RIG-I调节细胞内抗病毒防御和丙型肝炎病毒RNA复制的许可性。J.维罗尔。 79:2689-2699.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
57Talon，J.、C.M.Horvath、R.Polley、C.F.Basler、T.Muster、P.Palese和A.Garcia Sastre。干扰素调节因子3的激活受到甲型流感病毒NS1蛋白的抑制。J.维罗尔。 74:7989-7996.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
58汤普森、J·F、L·S·海斯和D·B·劳埃德。1991年。萤火虫荧光素酶稳定性的调节及其对基因调控研究的影响。基因 103:171-177. [公共医学][谷歌学者]
59Valente，L.和K.Nishikura。2005.ADAR基因家族和A-to-I RNA编辑：转录后基因调控的不同作用。掠夺。核酸研究分子生物学。 79:299-338. [公共医学][谷歌学者]
60Wang，W.和R.M.Krug。1996年。病毒NS1蛋白的RNA-结合域和效应域在甲型和乙型流感病毒中具有不同程度的保守。病毒学 223:41-50. [公共医学][谷歌学者]
61Wang，X.，M.Li，H.Zheng，T.Muster，P.Palese，A.A.Beg和A.Garcia-Sastre。流感病毒NS1蛋白阻止NF-κB的激活和α/β干扰素的诱导。J.维罗尔。 74:11566-11573.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
62.韦弗、B.K.、K.P.库马尔和N.C.赖克。干扰素调节因子3和CREB结合蛋白/p300是双链RNA激活转录因子DRAF1的亚单位。分子细胞。生物。 18:1359-1368.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
63B.R.威廉姆斯。2001.通过PKR进行信号集成。科学。STKE公司 2001:RE2[公共医学][谷歌学者]
64Xiang，Y.、R.C.Condit、S.Vijaysri、B.Jacobs、B.R.Williams和R.H.Silverman。阻断痘苗病毒E3L双链RNA结合蛋白的干扰素诱导和作用。J.维罗尔。 76:5251-5259.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
65Xu，L.G.，Y.Y.Wang，K.J.Han，L.Y.Li，Z.Zhai，和H.B.Shu。VISA是病毒触发IFN-β信号传导所需的一种适配蛋白。分子电池 19:727-740. [公共医学][谷歌学者]
66Yoneyama，M.、M.Kikuchi、K.Matsumoto、T.Imaizumi、M.Miyagishi、K.Taira、E.Foy、Y.M.Loo、M.Gale，Jr.、S.Akira、S.Yonehara、A.Kato和T.Fujita。2005.DExD/H-box解旋酶RIG-I、MDA5和LGP2在抗病毒天然免疫中的共同和独特功能。免疫学杂志。 175:2851-2858. [公共医学][谷歌学者]
67Yoneyama，M.、M.Kikuchi、T.Natsukawa、N.Shinobu、T.Imaizumi、M.Miyagishi、K.Taira、S.Akira和T.Fujita。2004.RNA解旋酶RIG-I在双链RNA诱导的先天性抗病毒反应中具有重要功能。自然免疫学。 5:730-737. [公共医学][谷歌学者]
68Yoneyama、M.、W.Suhara和T.Fujita。2002.通过磷酸化控制IRF-3激活。《干扰素细胞因子研究杂志》。 22:73-76. [公共医学][谷歌学者]
69Yoneyama、M.、W.Suhara、Y.Fukuhara、M.Fukuda、E.Nishida和T.Fujita。病毒感染直接触发I型干扰素系统：含有IRF-3和CBP/p300的转录因子复合物的激活。EMBO J。 17:1087-1095.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
70Yuan，W.、J.M.Aramini、G.T.Montelione和R.M.Krug。2002.与B型流感病毒NS1蛋白结合的泛素样ISG 15蛋白的结构基础：a型流感病毒的NS1蛋白的相应N末端结构域不共享的蛋白-蛋白质相互作用功能。病毒学 304:291-301. [公共医学][谷歌学者]
71Yuan，W.和R.M.Krug。流感B病毒NS1蛋白抑制干扰素（IFN）诱导的泛素样ISG15蛋白的结合。EMBO J。 20:362-371.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
72Zhao，C.、C.Denison、J.M.Huibregtse、S.Gygi和R.M.Krug。2005.人类ISG15结合靶向干扰素诱导的和组成性表达的蛋白质在不同细胞途径中的功能。程序。国家。阿卡德。科学。美国 102:10200-10205.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）