表达外源病毒抗原的重组新城疫病毒在灵长类中被减弱并具有高度免疫原性

摘要

副粘病毒有望作为疫苗载体，特别是用于鼻内免疫。例如，用表达麻疹病毒血凝素蛋白的重组人副流感病毒3型（HPIV3）对仓鼠进行鼻内免疫，可诱导高滴度的麻疹病毒中和血清抗体(5). 用表达HPIV1和HPIV2的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白的重组HPIV3免疫仓鼠，可诱导高滴度的HPIV1与HPIV2血清抗体，并诱导对这些病毒的攻击产生耐药性(42). 用表达人呼吸道合胞病毒（RSV）粘附（G）和/或融合（F）糖蛋白的重组减毒牛-人嵌合PIV3免疫恒河猴呼吸道，诱导高滴度RSV中和血清抗体(35). 事实上，表达RSV F蛋白的BHPIV3构建物计划作为RSV/HPIV3联合儿童疫苗进行临床评估(41). 用表达严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）尖峰（S）蛋白的减毒BHPIV3载体免疫非洲绿猴，可诱导针对SARS-CoV的血清中和抗体反应，并保护动物免受随后高剂量SARS-CoV-的攻击(1). 最后，用表达埃博拉病毒糖蛋白的HPIV3对豚鼠进行鼻内免疫，可产生杀菌免疫反应，以对抗随后的高剂量埃博拉感染（a.Bukreyev等人，未发表的数据）。HPIV3能够容纳和表达至少三个总大小至少为7.5kb的插入物，并且能够在体外多次传代中保持稳定(1,5,38). 然而，使用一个或两个插件可能是最佳的，因为增加插件数量和尺寸可能会导致过度衰减(39).

虽然减毒人副粘病毒作为鼻内疫苗载体似乎具有良好的特性，但它们可能仅对以前未接触过该载体的个人有效。这是因为现有的宿主对载体的免疫会限制其复制并降低其免疫原性。例如，野生型RSV只感染了50%的血清阳性成人志愿者，而减毒RSV变异株只感染了10%至33%（取决于毒株）的志愿者(14). 在另一项研究中，只有8%至20%的血清阳性成年志愿者感染了wt HPIV3或其减毒突变体(三). 甚至抗原分化的BPIV3在成人和儿童的呼吸道中的复制也受到高度限制(三,15). 因此，尽管人类副粘病毒是免疫学上缺乏经验的儿科人群用作载体的理想候选病毒，但它们可能对成年人无效，因为几乎所有人以前都感染过这些常见病原体，疫苗载体的复制将受到高度限制，导致免疫原性降低或缺失。这个问题可能适用于任何基于常见人类病原体的病毒载体，如麻疹病毒和常见腺病毒株。为了克服这一限制，我们检测了新城疫病毒（NDV）的传染性、安全性和免疫原性，这是一种禽副粘病毒，与常见的人类副粘病毒具有不同的血清型（即，不会经历显著的交叉中和）。

NDV是腮腺炎病毒属亚科属副粘病毒亚科家庭的副粘病毒科，一个不包括任何已知人类自然病原体的属。NDV分离株可根据其在鸟类中的毒力程度分为三类：（i）致长株，其引起轻度或非明显感染，主要局限于呼吸道，包括目前用作活疫苗的株；（ii）引起中度全身感染的中胚层感染；以及（iii）快速菌株，导致高死亡率的系统性感染。NDV的基因组是15162至15192个核苷酸（nt）的单负义RNA链(19)（有关示例，请参阅GenBank条目{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF077761“，”term_id“：”3386504“，”term_text“：”AF0077761“}}AF077761型,{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY935499”，“term_id”：“62901506”，“term_text”：“YY935499.”}}AY935499年、和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY562989”，“term_id”：“45511232”，“term_text”：“YY562988”}}AY562989年)编码七种主要结构蛋白：核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大聚合酶蛋白（L）。毒力的一个主要决定因素是F蛋白裂解位点的结构，在那里必须发生细胞蛋白酶的裂解才能产生由F蛋白组成的活性形式的蛋白质₁和F₂亚单位。含有细胞内蛋白酶furin（R-X-K/R-R）识别序列的裂解位点与毒性增加有关，而含有较少精氨酸/赖氨酸残基的位点必须被细胞外分泌蛋白酶裂解，与毒性降低有关(6,34). HN蛋白在向性和致病性中也起着重要作用(11)，其他致病性决定因素尚待确定。本研究涉及两种致病性不同的NDV毒株：慢生疫苗株LaSota（NDV-LS）和中生毒株Beaudette C（NDV-BC）。NDV-LS的F蛋白切割位点为SGGGRQGR↓LIG，因此缺乏furin基序，而NDV-BC的F蛋白裂解位点为SGGRRQKR公司↓图和包含此主题（下划线）。

最近，重组NDV被用于表达猴免疫缺陷病毒和流感病毒的保护性抗原，并被证明在小鼠中诱导免疫反应(24,25). 然而，啮齿动物模型并不是人类的可靠替代品，也不是候选人类疫苗衰减、免疫原性和保护效力的可靠预测因子。原则上，任何可以通过重组DNA技术操纵并经工程表达外源表位或抗原的病毒都有潜力用作疫苗载体。在实践中，必须在体内实验环境中证明令人满意的复制、衰减、安全性和免疫原性水平，在宿主的系统发育和解剖特征以及剂量、给药途径和载体复制的许可性方面，该环境密切模拟预期用途。在本研究中，我们评估了NDV-LS和NDV-BC作为载体，以表达HPIV3的HN蛋白作为测试抗原。在对两种非人灵长类动物进行鼻内免疫后，对这些载体的复制、衰减和免疫原性进行了评估，这两种灵长类与人类有着密切的系统发育和解剖相似性，应该是人类在载体复制方面的良好替代品。

材料和方法

表达HPIV3 HN蛋白的重组NDV的构建。

NDV-LS和NDV-BC是高度相关的病毒（97%核苷酸序列一致性），通过共同的策略进行了修改。每种病毒的基因组都经过修饰，在P基因的下游非编码区产生了一个XbaI位点（图。​（图1）。1). 这涉及完整抗原序列中3185和3187位的两个C-to-A（阳性）核苷酸替换，以创建XbaI位点TCTA类G公司A类这些替换分两个PCR步骤进行。首先，扩增与NDV抗原cDNA 2354至3187位相对应的cDNA片段，并通过PCR进行诱变，以创建XbaI位点。正向PCR引物为GATC插科打诨C类CGCGG公司AAACAGTCC AGGAAAGACC，SacI网站下划线，SacII网站斜体。反向引物为ACT型C类T型AGA公司GAGGATTGCCGCTTGGAG，XbaI位点斜体化，两个突变核苷酸下划线。PCR产物用SacI和XbaI消化，并插入质粒pGem-7Zf（+）的SacI-XbaI窗口（Promega Corporation，Madison，WI）。其次，用正向引物AG PCR扩增NDV抗原组3182～3760位的cDNA片段T型C类T型AGA公司TTCCTCA GCCCCACTGAATG，XbaI位点为粗体，两个突变核苷酸下划线，反向引物CATGGACGT公司C类交流发电机CTT GACTGCATTCACTGATGAG，AatII网站下划线，PmlI网站斜体。用XbaI和AatII消化PCR产物，并将其插入上一步构建的质粒的XbaI-AatII窗口。这导致包含新创建的XbaI位点的NDV抗原基因组的SacII-PmlI片段（NDV基因组位置2354至3760）的亚克隆。接下来，通过PCR扩增HPIV3 HN开放阅读框（ORF）的cDNA，以连接NDV基因连接（基因终-间基因启动基序）（图。​（图1）1)和一个XbaI站点到其上游端，一个XbaI站点到下游端（图。​（图1）。1). 正向引物为CTTGAATCTAGA公司塔加AAAAAC类ACGGGTAGAA公司中国葛洲坝集团公司ATGGAATACTGGAAGCATAC，XbaI位点斜体，NDV基因末端转录信号下划线，C基因间核苷酸黑体，NDV-基因起始转录信号下线，以及一个7-nt长的间隔区，用于高效翻译(17)黑体字。NDV-LS和NDV-BC的大多数基因的基因起始和基因终止信号与自然发现的相同，基因间序列与M和F基因之间的序列相同。反向引物为TACTTGTCTAGA公司TATGA公司TTAAGACGTCGAAAAAGGAA，XbaI站点斜体化，一个5吨长的间隔棒保持6的规则(16)黑体字。PCR产物用XbaI消化，并使用新创建的XbaI位点插入SacII-PmlI亚克隆。最后，携带HN插入物的SacII-PmlI片段被替换到全长NDV抗原基因cDNA中。所有体外聚合酶反应区域的DNA序列均通过核苷酸测序进行确认。

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图1。

携带HPIV3 HN糖蛋白插入物的重组NDV-BC基因组图；NDV-LS的插入策略和相邻序列相同，未显示。亲本NDV-BC基因组显示在底部，工程XbaI位点显示。NDV基因显示为黑色矩形；Le和Tr是外源性先导区和先导区。NDV-BC/HN矢量显示在父级上方，HPIV3 HN插入为交叉阴影水平条。HN ORF两侧的核苷酸序列如上图所示，从积极意义上看，插入XbaI位点的DNA序列被括起来，基因开始和基因结束转录信号被装箱，基因间核苷酸被指示，HN ORF的ATG和TAA启动和终止信号下划线，HN ORF的其余部分被删除，并用三个点表示。

结果

重组病毒的体外特性。

为了证实HPIV3 HN插入物的表达，用NDV-LS/HN、NDV-BC/HN及其缺乏插入物的亲代病毒以每个细胞2 PFU的MOI感染DF1鸡细胞。同时，LLC-MK2恒河猴细胞被野生型HPIV3感染，感染倍数为2 TCID₅₀每个单元格。感染后24小时，收集细胞，分离细胞内总RNA。RNA在甲醛琼脂糖凝胶中进行电泳，并使用从HPIV3 HN基因的cDNA制备的双链DNA（dsDNA）探针进行Northern杂交分析（图。​（图2A）。2年). 这表明NDV-BC/HN和NDV-LS/HN（图。​（图2A，2安培（分别为第2和第4条通道），每个通道都表达一个大小合适的主RNA，作为HN基因盒的单顺反子mRNA，以及一个较大的mRNA，大小合适，可以通过上游NDV P基因或下游NDV M基因读取插入的HPIV3 HN基因；该RNA未作进一步分析。HPIV3表达类似大小的单顺反子HN mRNA（图。​（图2A，2安培，车道5）；它的表观大小略大于任一NDV结构所表达的大小，这与由于较长的非编码序列而使其计算长度大74 nt相一致。有趣的是，NDV-BC/HN载体在感染后24小时表达的HN mRNA水平显著高于NDV-LC/HN或HPIV3。我们还将这些病毒与上述相同接种物和相同24小时感染期的Vero非洲绿猴细胞中的病毒并排进行了比较，然后用HN特异性探针进行了Northern blot分析（图。​（图2B）。2B型). 观察到上述相同的mRNA谱，并且在这些条件下也观察到NDV-BC/HN病毒的较高表达水平。

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图2。

体外NDV-BC/HN和NDV-LS/HN对HPIV3 HN mRNA转录的Northern印迹分析。（A） DF-1鸡细胞（1至4道）或LLC-MK-2恒河猴细胞（5和6道）感染NDV-BC（1道）、NDV-BC/HN（2道）、NEV-LS（3道）、NIV-LS/HN和HPIV3（5道）或模拟感染（6道）。（B） 非洲绿猴Vero细胞感染了NDV-BC（第1道）、NDV-BC/HN（第2道）、NNV-LS（第3道）、NLS/HN（第一道）和HPIV3（第5道）或模拟感染（第6道）。细胞在2个PFU（NDV重组病毒）或2个TCID的MOI中感染₅₀（HPIV3）。感染后24小时采集细胞，采集细胞内总RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上分离，并用dsDNA探针对HPIV3 HN基因进行Northern杂交分析。显示了HPIV3 HN mRNA和一个通读mRNA的位置。

为了研究HN蛋白在细胞内的表达，DF-1细胞被NDV-BC、NDV-LS及其含HN衍生物的每个细胞2个PFU感染。同时，LLC-MK2细胞被2种TCID感染₅₀每个HPIV3细胞或模拟感染。在感染后24小时采集细胞，并使用针对蔗糖梯度纯化HPIV3的兔抗血清进行Western blot分析：NDV-BC和NDV-BC/HN的结果如图所示。​图3A。3A级HPIV3感染细胞的裂解液含有对应于P、N和M蛋白的强条带（图。​（图3A，3A级，车道4）。此外，HN蛋白被检测为一个小条带，这可能反映了由于HN表位的高度构象和变性敏感性，抗血清的反应性较差(4,23). 虽然在HPIV3感染细胞的裂解液中仅能微弱地识别出HPIV3 HN蛋白，但在感染NDV-BC/HN的DF-1细胞的裂解物中明显存在适当大小的条带（图。​（图3A，3A级和NDV-LS/HN（未显示），并且在感染亲本NDV-BC（通道2）和NDV-LS（未显示。

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图3。

用Western blot分析NDV-BC/HN体外表达HPIV3 HN蛋白，并将HPIV3-HN蛋白并入NDV病毒颗粒。（A） 细胞内表达。DF-1细胞（通道2和3）或LLC-MK2细胞（通道4和5）在每细胞2个PFU的MOI下感染NDV-BC（通道2）或NDV-BC/HN（通道3）或2个TCID₅₀每个HPIV3细胞（第4道）或模拟感染（第5道）。在感染后24小时采集细胞，在变性和还原条件下用4%至12%的凝胶电泳分离，并用梯度纯化的HPIV3兔抗血清进行Western blot分析。通道1包含分子量标记，分子量显示在左侧。右侧显示了一些主要的HPIV3蛋白。（B） 将HPIV3 HN蛋白掺入NDV颗粒中。NDV-BC（第2道）、NDV-BC/HN（第3道）和HPIV3（第4道）的制剂通过蔗糖梯度沉淀进行部分纯化，并使用HPIV3特异性抗血清进行凝胶电泳和Western blot分析，如A组图例所述。通道1包含分子量显示在左侧的标记。右侧显示了一些主要的HPIV3蛋白。

将编码异源病毒跨膜蛋白的基因插入负链病毒基因组有时会导致这些蛋白并入病毒颗粒(33). 我们通过在不连续的蔗糖梯度上纯化NDV-LS/HN、NDV-BC/HN及其亲代病毒，并通过银染色（未显示）和蛋白质印迹分析分析部分纯化的制剂来研究这种可能性（HPIV3和基于NDV-BC的病毒的结果如图所示。​图3B）。3B公司). 在这种情况下，通过Western blot分析检测到HPIV3 HN蛋白是HPIV3病毒制剂中的一条次要带（图。​（图3B，3B公司，通道4）以及NDV-BC/HN（通道3）和NDV-LS/HN，但不包括NDV-BC（通道2）或NDV-LS（未显示）。与HPIV3相比，估计NDV-BC/HN制备中HPIV3 HN带的相对丰度很有意义。然而，NDV制剂银染凝胶中的HN带被背景带掩盖，无法直接比较银染材料（未显示）。因此，我们使用间接方法估算了该丰度。具体来说，我们测量了图所示的Western blot中NDV-BC/HN和HPIV3通道中HN带的强度。​图3B。3B公司然后将每个值相对于银染凝胶（未示出）的相应泳道中的N蛋白的强度进行归一化。该值进一步标准化，以说明HPIV3和NDV的N蛋白之间的大小差异，从而将该值转换为相对摩尔量。这些计算表明，与HPIV3相比，NDV-BC/HN制剂中HN的相对摩尔量为15%。

观察到将HPIV3 HN蛋白并入NDV载体的病毒中，这就提出了一个问题，即这是否可以通过HPIV3特异性抗体产生中和敏感性。为了测试这种可能性，我们孵育了小份样品，每个样品含有50个携带HN的NDV载体的PFU，它们的亲本病毒没有插入物，或50个TCID₅₀HPIV3与1:20至1:1280稀释的HPIV3阳性非洲绿猴血清、用梯度纯化HPIV3病毒超免疫兔子的血清或猴子或兔子的非免疫对照血清在37°C下与豚鼠补体共存1小时。通过DF-1细胞单层（NDV）或TCID的斑块试验量化每等分中残留的感染病毒₅₀LLC-MK2细胞上的滴定（HPIV3）。尽管HPIV3特异性抗体制剂在1:1280的稀释度下完全中和了HPIV3，但即使在1:20的稀释度（未显示）下，也未观察到含有HPIV3 HN蛋白的重组NDV的中和作用。因此，即使在存在补体的情况下，HPIV3 HN蛋白并入NDV载体的病毒颗粒的水平显然不足以赋予对HPIV3中和抗体的显著敏感性。

将少量HPIV3 HN掺入重组NDV的病毒粒子中有可能引发感染。为了测试这种可能性，我们孵育了每一份含有10个⁵每孔携带HN的NDV载体或缺乏插入物的亲本病毒的PFU，或10⁵TCID公司₅₀HPIV3，与1:10至1:160稀释的鸡抗NDV血清在37°C下与豚鼠补体共存1小时。孵育后，用TCID对残余感染病毒进行定量₅₀有效支持NDV和HPIV3复制的Vero细胞滴定。我们观察到NDV-BC和NDV-BC/HN完全中和，而（如预期的那样）NDV特异性血清没有中和HPIV3。这表明，加入NDV病毒的少量HPIV3并未赋予NDV非依赖性感染敏感细胞的能力。

讨论

这项研究提供了证据，证明NDV是一种很有前途的人类鼻内疫苗载体。以前的一些研究表明，人副流感病毒在载体血清阴性的实验动物中被减弱并具有高度免疫原性（见引言）。这些人类病毒很有希望成为免疫学上幼稚的儿科人群的免疫载体。然而，成年人群对这些常见病原体具有免疫学经验，因此可能无法成功免疫（见引言）。通过鉴定与人类常见病原体血清型不同的载体，可以克服这一障碍；灵长类具有传染性、减毒性和免疫原性；并且能够在细胞基质中高效复制，例如适合疫苗制造的Vero细胞。NDV似乎具有这些可取的品质。

鼻内气管内免疫10^6.5NDV的PFU在两种非人灵长类动物中都有良好的耐受性，没有明显的疾病迹象，而且在呼吸道分泌物中最多检测到极低水平的病毒脱落。然而，病毒从呼吸道的脱落并不总是显示肺部复制的程度。例如，在感染SARS-CoV的非人灵长类动物中，肺部、气管或鼻甲组织匀浆中的病毒滴度始终高于鼻腔拭子或气管灌洗样本中的病毒(22). 因此，进行了第二次实验，直接检查非洲绿猴的肺组织，证明病毒复制率低且分散。这种高度的衰减表明NDV将是一种非常安全的鼻内载体。

以前有证据表明，NDV可导致接触该病毒的鸟类管理员发生结膜炎，导致血清转化(20,27). 虽然将NDV的致晶状体株、中胚层株或促卵泡株滴注到受伤的结膜上时，猴子可能会发生结膜炎，但在完整的结膜上方多次滴注大剂量病毒并没有做到这一点(2). 这表明人类可能感染NDV，但可能不易感染严重疾病。此外，在过去几十年的研究中，NDV的各种毒株已作为溶瘤剂非肠道给药给人，有时使用高剂量，有时涉及免疫抑制患者(26). 这些研究只涉及少数患者，没有监测病毒的复制或向性，因此没有为新冠病毒在人类中的复制提供完整的指导。尽管如此，这一经验提供了一些历史证据，表明即使在对免疫抑制个体进行大剂量肠外给药的某些极端条件下，人类对NDV也有良好的耐受性。

一次鼻内免疫10^6.5表达HPIV3 HN蛋白的NDV的PFU诱导了针对外源性HN蛋白血清HAI抗体的滴度，该滴度仅略低于感染野生型HPIV3所诱导的抗体滴度，并且等于或超过先前针对携带一个或两个外源性插入物的减毒BHPIV3载体的HN蛋白所诱导的滴度(36). 这种高水平的免疫原性是显著的，因为HPIV3和BHPIV3似乎比NDV复制效率更高。具体而言，携带HPIV3和BHPIV3的shed病毒的滴度比NDV的滴度高100到10000倍。我们对这些非人灵长类动物的野生型HPIV3和减毒衍生物进行免疫和挑战性研究的经验表明，这种水平的HPIV3特异性免疫将对HPIV3挑战具有高度保护作用。在用NDV载体免疫的动物中，28天后第二次给药提供了适度的提高，并导致HPIV3特异性血清抗体的滴度超过HPIV3感染后观察到的滴度。我们没有用HPIV3挑战这些双重免疫的动物，因为免疫水平很高，根据以往的经验，挑战病毒复制预计会受到高度限制(9,37).

在本研究中，NDV-BC/HN和NDV-LC/HN这两种新冠病毒株在体内的大多数方面都具有可比性。主要的差异是，新冠病毒BC/HN在第一次感染后诱导了显著更高（几乎高出八倍）的新冠病毒特异性抗体水平，尽管在第二次感染后差异要小得多。NDV-BC/HN载体也诱导了对HPIV3 HN蛋白的血清HAI抗体水平稍高，尽管这种差异只有两倍或更少。一种可能性是，NDV-LS/HN病毒在灵长类动物中的限制性略强，因此免疫原性低于NDV-BC/HN。总的来说，这表明与鸟类相比，这两种NDV菌株在灵长类动物中的感染性差异不大。可能鸟类毒力的决定因素对灵长类动物的影响不同。两株NDV株之间的另一个差异在体外很明显，即NDV-BC/HN在24小时内表达的细胞内HN mRNA水平显著高于NDV-LS/HN或意外的野生型HPIV3。以前已经注意到NDV慢生株，包括NDV-LS，在体外转录水平降低(21). 这是否影响载体的免疫原性尚不清楚，尽管本研究中NDV-LS/HN和NDV-BC/HN的比较没有提供证据表明后者的免疫原性大幅度增加，同时其体外基因表达增加。

基于NDV的疫苗有可能针对已知的高致病性病原体，如SARS-CoV、禽流感和埃博拉病毒，以及未来可能出现的任何新病原体开发。这种疫苗可以通过单次鼻内注射局部使用，以控制区域疫情，因为在这种情况下，单次免疫诱导高水平免疫的能力将是有利的。例如，疫苗也可以用于预防，以保护在此类病毒流行地区工作的医务人员。为了优化这些医务人员的免疫反应，疫苗可以单独使用，也可以与DNA疫苗等其他疫苗一起使用。由于用新城疫病毒载体疫苗进行免疫可诱导针对该载体的免疫反应，并且由于新城疫病毒株具有高度抗原相关性，因此在本研究中使用的两种剂量之外重复使用基于新城疫病毒的疫苗可能是不可行的。然而，这一问题可以通过开发基于非新城疫病毒血清型禽副粘病毒的疫苗载体来解决。已知9种禽副粘病毒血清型；NDV属于血清型1。血清型2至9的代表在鸟类中引起不同严重程度的疾病(32)我们计划对其在鸟类、啮齿动物和非人类灵长类动物中的传染性、安全性和免疫原性进行评估。

基于NDV或其他类似副粘病毒的鼻内疫苗在控制高致病性毒剂方面具有许多优势。首先，鼻内免疫可诱导局部和全身免疫，从而防止感染或降低其严重程度。一些高致病性毒剂将呼吸道作为主要入口；在某些情况下，它们广泛复制并在该部位引起疾病。限制病毒病原体在呼吸道中的复制应大大减少其向易感接触者的传播。正因为如此，呼吸道免疫的直接刺激应该会提高疫苗的效力和对局部疫情控制的有用性。第二，在呼吸道注射人副粘病毒的人体临床试验方面有丰富的经验(12-14). 人类副流感病毒尤其如此，它们是NDV和其他禽副粘病毒的近亲。这一经验将有助于指导疫苗开发。第三，如果基于NDV或类似病毒的预测试疫苗载体可用，针对任何未来可能意外出现的病原体的疫苗开发可能会很快，因为它只需要克隆保护性抗原的基因并插入载体主干。这种疫苗的临床评估、生产和交付将因先前对载体进行测试的经验而加快。第四，这种疫苗的制造和使用是安全的，因为不会涉及高致病性病毒的传播。最近在SARS-CoV工作期间发生的实验室暴发说明了这一安全特性的价值(28,29). 最后，非片段化病毒如NDV不会发生基因重组，而非片段化负链RNA病毒的RNA重组可以忽略不计(40). 这与某些现有活疫苗（如脊髓灰质炎病毒）的情况形成了对比，对于这些活疫苗，已描述了与循环菌株的重组(8)或潜在的活疫苗，如禽流感病毒或SARS-CoV，其可能分别与流通菌株重组或重组。NDV载体疫苗基本上不会与流通病毒进行基因交换，这一观察结果表明，对于单个疫苗接种者和整个人群来说，这是一个关键的安全特征。

致谢

参考文献