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基因发育。2005年10月15日；19(20): 2458–2465.
数字对象标识：10.1101/编号1361905
预防性维修识别码：PMC1257400型
PMID：16195415

一个新的基序控制APC依赖的果蝇属体内ORC1

马里托·阿拉基,1 余洪涛,2和麻生太郎1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

调节降解在调节细胞周期进程的许多因素的水平方面发挥着关键作用。在果蝇属，起源识别复合物蛋白1（ORC1）的最大亚单位在M期末和整个G1的大部分时间被Fzr/Cdh1激活的后发复合体（APC）降解。我们在这里表明，之前确定的APC基序都没有针对ORC1进行降解。相反，一个新的序列，即O-box，对于在体外指导Fzr/Cdh1依赖的多泛素化和在体内降解是必要的和足够的。O型盒与特征良好的D型盒相似，但又不同。最后，我们发现其他两种蛋白质中的O-box基序，果蝇属主轴异常和葡萄裂殖酵母Cut2有助于体外Cdh1依赖性多泛素化，表明O-box可能介导多种细胞周期因子的降解。

关键词：APC、细胞周期、ORC1、蛋白水解、复制

细胞周期的进展严重依赖于蛋白质集合的预定降解。这种降解的调控不当会导致发育缺陷、细胞死亡和癌症。因此，了解调控细胞周期调控因子降解的分子机制具有重要意义。

蛋白质的细胞周期依赖性降解由蛋白酶体进行。底物蛋白质由E3泛素（Ub）连接酶标记，该连接酶催化多（UbCiechanover 1994年;Hochstrasser 1996年). 精确控制E3活性可实现时间和空间调控的蛋白质降解。

细胞周期调控中的关键E3之一是后期增殖复合体/环体（APC）。APC通过首先降解A型和B型细胞周期蛋白，然后降解securin/Pds1（以及其他蛋白质）来调节有丝分裂的进展和退出扎卡里亚和纳斯迈思1999;Harper等人2002;彼得斯2002). 在M和G1期间，两个不同的因素依次激活APC：Fizzy（Fzy）/Cdc20和Fizzy-related（Fzr）/Cdh1。每个激活物赋予APC不同的底物特异性；因此，衬底劣化的时间部分地由是否涉及Fzy/Cdc20或Fzr/Cdh1来确定。迄今为止，已确定底物中的四种不同APC靶向基序：D-box(Glotzer等人，1991年)，KEN盒(Pfleger和Kirschner 2000)，A盒(Littlepage和Ruderman 2002)，和GxEN盒(Castro等人，2003年). 虽然最近的实验表明D-盒直接与Cdh1、Cdc20以及APC本身结合，但每一种介导与APC激活物复合体相互作用的机制尚不清楚(Yamano等人，2004年;Burton等人，2005年;卡夫等人，2005年).

除了指导M期蛋白的降解外，APC还控制DNA复制因子的降解。迄今为止，果蝇属起源识别复合蛋白1（ORC1）(Araki等人，2003年)，哺乳动物Cdc6(Petersen等人，2000年),爪蟾杰米宁(McGarry和Kirschner 1998年)、和酿酒酵母数据库4(费雷拉等人，2000年)已显示APC已降级。这些蛋白质中的每一个都被认为在复制前复合物（pre-RC）的形成或复制起源的后续事件中起着关键作用（有关综述，请参阅贝尔2002;Bell和Dutta 2002;DePamphilis 2003年;Kearsey和Cotterill 2003;Diffley 2004年;斯蒂尔曼2005). 因此，APC介导的降解可能在起始结合复合物的分解和起始后起源的重置中发挥重要作用。

我们之前展示过果蝇属ORC1被Fzr/Cdh1激活的APC降级(Araki等人，2003年). 这个顺式-作用信号介导降解被映射到ORC1的N末端555残基。蛋白质的这一部分包含几个先前确定的靶向基序，我们认为这些基序是导致其降解的原因。在目前的工作中，我们表明这些序列都没有介导ORC1的破坏。相反，关键的失稳序列映射到一个新的基序，即O盒（ORC1-destruction box），它对体外泛素化和体内降解至关重要。

结果

先前确定的APC靶向基序在ORC1降解中没有作用

介导Fzr/Cdh1依赖性泛素化和ORC1降解的信号存在于氨基酸1和555之间。在该结构域的N末端附近有一个KEN-box，它是其他蛋白质中Fzr/Cdh1特异性信号，因此是ORC1破坏基序的一个很有吸引力的候选者。为了确定其是否介导体内降解，我们对KEN-box（mkb）进行了突变，制备了一个编码ORC1与GFP融合的突变片段的转基因，并将该基因在眼科影像盘细胞的控制下表达GMR公司启动子，在形态发生沟后面的所有细胞中具有组成性活性。

如所示图1C，KEN-box突变基本上对ORC1-GFP融合的稳定性没有影响，ORC1-GFP融合在形态发生沟后面的S期、G2期和M期细胞条中积累，但在G1/G0期的大多数细胞中降解(图1B). KEN盒的突变对体外N-末端ORC1片段的泛素化也几乎没有影响(图1D)，这与KEN-box在其退化中不起任何作用的想法一致。

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先前确定的APC靶向基序中没有一个与ORC1降解和泛素化有关。(A类)图中分析的删除导数C类和D类，替换用红色星号表示。在突变的KEN-box（mkb）蛋白中，残基4-6处的KEN被AAA取代。在三倍突变的D-box（3×mdb）蛋白中，D-box的保守氨基酸残基313-321、388-395和539-546(R（右）xx个我xxxx年D类,R（右）xx个我xxx个N个、和R（右）xx个我xxx个D类分别）被丙氨酸取代。(B类)当形态发生沟（MF，用箭头标记）从后部（P）扫到前部（A）时，大多数视盘细胞首先经历同步的细胞周期转变，然后进入延长的G1/G0期。(C类)在控制下的各种蛋白质的表达GMR公司启动子，在眼盘MF（箭头）后面的所有细胞中都是活跃的。在GFP融合在M期（即ORC1）后退化的椎间盘中，散布在后部的少量细胞保留GFP，因为它们在APC不活跃的G2中停滞(Araki等人，2003年). 高知名度视图包括插入. (D类)体外APCFzr/Cdh1号机组-ORC1的D-和KEN-box突变衍生物的纯化酶依赖性泛素化分析（未反应输入左边每对的车道）。箭头表示35S标记基板。

降解信号接下来定位于残基242-556，它包含三个典型的D盒基序(图1A). 预先看来，这些似乎不太可能是体内靶向ORC1的原因，因为D-盒介导Fzy/Cdc20-和Fzr/Cdh1-依赖性降解，而ORC1是Fzr/Cdh1特异靶向的。然而，为了测试它们的潜在作用，我们对三个D-box基序进行了突变，并在眼盘中表达了突变蛋白；如所示图1CD盒在ORC1降解中没有明显作用。与这一观察结果一致，含有消融D盒的ORC1片段在体外通常是多泛素化的(图1D). 为了排除ORC1片段可能在不适当的上下文中呈现KEN或D基序或这些基序具有冗余作用的可能性，我们制备了一个编码全长ORC1衍生物（融合到GFP）的转基因，其中KEN盒和所有三个D盒被烧蚀。如所示图1C，四重突变ORC1蛋白仍然是眼睛影像盘中的细胞周期调节蛋白。由于ORC1的N末端554残基不包含其他特征性破坏基序（例如GxEN-或A-box），我们推断存在另一个APC靶向信号。

新型Fzr/Cdh1靶向基序O盒

为了鉴定ORC1破坏基序，我们制备了一系列缺失衍生物(图2A)并将其用作体外泛素化的底物(图2B). 通过估算（非均相）高分子量反应产物的平均分子量和测量剩余未反应底物来监测底物利用效率。这些实验表明，降解信号介于氨基酸245和307之间。使用第二系列缺失衍生物将临界区间进一步缩小到残基283-303(图2C).

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ORC1残基283-303对于Fzr/Cdh1依赖的多泛素化至关重要。(A类)中分析的删除衍生物的绘图B类和C类. (B类-D类)体外APCFzr/Cdh1号机组-用纯化酶对一系列ORC1片段进行依赖性泛素化分析。每个反应都在适合输入底物分子量的凝胶上进行分析(左边每对中的车道）。注意ORC11-245在体外是寡-泛素化的，但这种反应水平不足以破坏体内蛋白质的稳定性(图1C)，与之前的一份报告一致，即多泛素化是有效降解所必需的(投掷者等人2000). (D类)ORC1系列单丙氨酸取代衍生物的分析1-397，如所述B类和C类以上。这两个关键残基被装箱，其他取代更微妙地影响泛素化的残基被放在更大的字体中。如图所示，该图是根据两个实验的结果组装而成的。

为了更好地定义降解信号，我们接下来进行丙氨酸扫描突变，将P283的每个残基分别突变为E303。然后在体外测试每个突变体的泛素化(图2D). 两个残基L295和N299的取代消除了高阶多泛素化。此外，邻近残基P291、S293、P294、E297和K301的取代显著降低了高分子量产物的形成。根据这些结果，我们确定目标信号是PASP我TEK公司N个AK（带下划线的必需残基），并将该元素命名为ORC1破坏盒（O-box）。

O-box控制体内多种细胞类型中依赖细胞周期的ORC1降解

接下来，我们希望确定O-box是否负责体内ORC1的细胞周期依赖性降解。野生型ORC1和在两个关键O-box残基（L295和N299）中含有丙氨酸取代的突变型ORC1在视觉想象的椎间盘表达为GFP融合GMR公司启动子控制。如前所示(Araki等人，2003年)，野生型ORC1在大多数G1期细胞中降解且检测不到(图3A). 相比之下，带有突变O-box的ORC1衍生物是稳定的，基本上在每个细胞中积累到相同的水平。我们通过将眼睛成像盘分离成单个细胞并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分析来证实这一结果。如所示图3B与野生型ORC1不同，携带突变O盒的ORC1衍生物在G1/G0细胞中积累，野生型ORC2仅在Fzr失活时在S期和G2期细胞中稳定。因此，O-box介导眼成像盘细胞中全长ORC1的细胞周期依赖性降解。

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O型盒中的替代物可在体内消除依赖细胞周期的ORC1降解。(A类)表达GFP的眼影盘，GFP标记的全长野生型ORC1，以及带有突变O盒（mob）的GFP标记ORC1（L295和N299处的丙氨酸替换）。(B、 C类)从转基因动物中分离出眼图细胞和翼盘细胞，并通过FACS进行分析。GFP阳性细胞的分布以绿色显示，所有细胞以黑色显示。请注意，眼盘样品中G1细胞的比例略高于翼盘样品，因为GMR公司启动子活跃于眼盘的一个区域，在该区域，许多细胞在G1/G0期退出细胞周期并处于终末分化状态，而英语用于驱动翼盘表达的启动子在增殖细胞中是活跃的。(D类)12-13期胚胎上皮细胞的共聚焦图像，其中野生型或突变ORC1-GFP融合蛋白的转录普遍由肌动蛋白5C-GAL4大多数细胞位于G1期；只有少数以高水平的细胞周期蛋白B为标志的细胞仍处于S或G2中。

为了测试O盒依赖性降解是否是眼盘细胞的特性，我们使用雕刻的GAL4驱动器和在胚胎表皮细胞中使用肌动蛋白5C-GAL4驱动程序。在这两种细胞类型中，野生型ORC1-GFP在G2细胞中积累，在G1细胞中不稳定；相反，在G1和G2细胞中，ORC1-GFP与烧蚀的O盒融合是稳定的(图3D). 因此，O型盒似乎控制各种细胞类型中ORC1的细胞周期依赖性降解。

O型盒足以实现Fzr/Cdh1特异性多泛素化

证明了O-box对于ORC1的泛素化是必要的，我们希望确定它是否足以直接修饰一种原始底物。为了解决这个问题，我们用另一个APC靶向基序——人类细胞周期蛋白B（CycB）的D-box替换了O-box。

哺乳动物CycB的降解由典型的D盒（RxxLxxxxN）介导(布兰迪斯和亨特1996). 我们首先表明，人CycB N末端片段的多泛素化依赖于该D-box的完整性，该D-box位于残基42-50。如所示图4AD盒高度保守残基的突变基本上消除了Fzy/Cdc20-和Fzr/Cdh1-激活的APC的泛素化。接下来，我们制备了衍生物，其中D-box被替换为野生型O-box或作为对照的突变型O-box。在体外测试时，O-box承载蛋白是多泛素化的，但只有在用Fzr/Cdh1刺激APC时；带有突变O盒的衍生物对Fzy/Cdc20和Fzr/Cdh1都是惰性的。ORC1对O-盒依赖的泛素化反应强烈，而CycB反应相对较少。虽然我们还没有系统地调查这种明显差异的来源，但已经描述了D-box的类似上下文相关活动(Zur和Brandeis 2002). 然而，从这些实验中得出的主要结论是，O-box是一个可携带的基序，它专门指导Fzr/Cdh1激活的APC的修饰。

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O形盒是APC的便携式图案Fzr/Cdh1号机组-定向泛素化。(A类)人细胞周期蛋白B片段的APC依赖性体外泛素化，其内源性野生型D-box（wtdb）序列突出显示。如图所示替换该序列在上面每组反应以安装突变体D盒（mdb）和野生型或突变体O盒（分别为wtob和mob）。(B类)APC依赖的体外泛素化果蝇属ORC1带有内源性O型盒或指示的替代物。

我们还进行了互惠交换，用人类CycB D-box代替了果蝇属ORC1。含有野生型D盒的ORC1衍生物在Fzy/Cdc20和Fzr/Cdh1的存在下泛素化(图4B). 因此，O-盒和D-盒在功能上是可以互换的，每个盒决定APC激活物的特异性，并充当指示泛素化的自主信号。

尽管序列相似，但O盒和D盒是不同的

D盒和O盒基序都是信息贫乏的，分别只有三个和两个严格指定的氨基酸。根据目前的定义，这两个基序表面上很相似，每个基序都有关键的L和N残基，由四个和三个残基分开：RtaLgdigN（D-box）和paspLtekNak（O-box）。鉴于这些相似性，我们希望确定O-盒是D-盒相对信号还是独特的APC靶向信号。为此，我们构建了用嵌合D-盒和O-盒编码底物的质粒，在-3处交换R和A残基（关于两个基序共同的L），并在关键L和N残基之间交换间隙GDIG和TEK残基。

如所示图5A，由O-box驱动的依赖于Cdh1的泛素化仅通过交换-3残基而略微增强，并且不受交换L-N间隔区的影响。相反，由D盒驱动的依赖于Cdh1的泛素化被其中一种相互取代显著削弱：交换-3残基或L-N间隔区显著降低反应性，并且引入这两种变化将聚泛素化降低到天然O盒所达到的水平以下（图。​（图4A，4A级,​，5B）。5亿). 据推测，天然O-box的其他特征也有助于其活性，这与丙氨酸扫描分析一致图2D根据这些标准，O型盒和D型盒似乎有很大不同。

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O型盒和D型盒是不同的图案。体外泛素化试验果蝇属ORC1（ORC1）1-554(A类)和人类CycB1-106-6×myc(B类)衍生产品。图中显示了具有内源性降解信号侧翼各种取代的衍生物。L和N残基是O-盒和D-盒的关键特征，并用下划线标出，改变后的氨基酸以较大的字体显示。如中所示图4，每三个通道都来自未反应的输入底物，与Cdc20激活的APC反应，以及与Cdh1激活的APC反应。(C类)与333μM野生型（LRPRTALGDIGNKVS）或突变型（LRP）不同底物的Cdh1依赖泛素化竞争A类助教A类GDIG公司A类KVS）人CycB的D-box肽。野生型人类CycB2006年1月-6×myc（D-box）和果蝇属ORC1（ORC1）1-554（O-box）基板如上所述；KEN-box基板是果蝇属ORC1（ORC1）1-554用人Cdc20-KEN盒（KENQPEN）取代残基293-301。我们认为，剩余的O-box残基（291和292）不会显著改变KEN-box的活性，因为KEN替换为AAA会完全消除反应性（数据未显示）。

我们还检测了与Cdc20激活的APC反应中所有嵌合体的活性。从这些实验中得出的主要结论是，R at-3是与Cdc20有效反应和指定类D恒等式的关键决定因素。将O形盒的R替换为-3处的A，可以显著增强Cdc20驱动的反应。由此产生的嵌合体具有与D-box相同的核心RxxL基序；具有这种嵌合体或原生D盒的基底对L-N间隔区的长度同样敏感(图5A、B). 在互易实验中，D盒-3处R的替代将反应性降低到非常低的水平。

总之，-3处R的存在和L-N间隔物长度的差异都区分了D盒和O盒。O-盒的活性对-3处残基的特性和间隔物的长度不敏感，而D-盒的活动对这两个特征都非常敏感。大多数嵌合基序在人CycB（残基1-106）底物和果蝇属ORC1（残留物1-554）底物。两种底物的每种取代的相对效果相似（数据未显示），这驳斥了O盒是退化的D盒的观点，该D盒仅由于侧翼ORC1序列的影响而有效工作。我们得出结论，D-盒和O-盒是不同的。

接下来，我们希望确定O-box是否与D-box竞争，要么直接与Cdh1（或APC）结合，要么可能在多泛素化反应的下游步骤。为了解决这个问题，我们进行了肽竞争实验，使用一种短的D-box肽，该肽在APC依赖的泛素化分析中被证明有效竞争(Yamano等人，1998年;卡夫等人，2005年). 我们制备了三种底物，其中一个基序指导多泛素化：人CycB片段和果蝇属上述ORC1（分别带有本地D-盒和O-盒），以及ORC1的其他相同片段，其中用KEN-box代替O-盒。每种底物都与不同浓度的野生型或突变型D-盒肽孵育。野生型D肽在不同浓度下以相似的程度抑制所有三种底物的依赖于Cdh1的泛素化，只有一种在图5C; 在相同浓度下，突变的D肽不能检测到抑制与任何底物的反应。我们不知道观察到的抑制是发生在与Cdh1结合、与APC结合的水平上，还是发生在反应的后续步骤上。然而，主要结论是D-盒和O-盒基序直接利用了常见的下游成分，因此在功能上是同源的。

其他蛋白质中的O-box

由于O-box是一个可携带的自主基序，我们询问其他蛋白质是否有O-box介导与Cdh1激活的APC反应。虽然短O-motif的信息含量相当低，但我们能够使用各种模式查找算法识别许多序列中的O-box类元素，包括Flybase模式搜索和BLAST搜索，以获得短的、几乎精确的匹配。随后的测试显示，其中两个候选基因都含有功能性O型盒，每一个都与细胞周期进程的控制有关。这个果蝇属异常纺锤体蛋白（Asp），被认为在有丝分裂期间的纺锤体极组织中起作用(做Carmo Avides和Glover 1999)、和葡萄裂殖酵母后期抑制剂Cut2（Pds1/securin）(Funabiki等人，1996年)每个包含与ORC1 O形盒匹配的6/11(图6A). 除此序列外，Asp还包含一个KEN-box，Cut2包含两个D-box，删除这些D-box可以稳定蛋白质(Funabiki等人，1997年).

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其他细胞周期调节器中的功能性O型盒。(A类)来自的O形盒的顺序D.m.公司。ORC1和Asp，以及S.p.公司。切割2(B类)天冬氨酸（野生型残基1-400）和Cut2（野生型残留物1-301）的各种片段的依赖于Cdh1的泛素化。为了生成突变O-box（mob）衍生物A类被丙氨酸取代。为了生成天冬氨酸的突变KEN-box（mkb）衍生物，将KEN残基229-231替换为AAA。未反应基板位于左边每对的车道。

如所示图6B在存在或不存在KEN基序的情况下，天冬氨酸中O盒的消融对Cdh1驱动的泛素化程度有显著影响。类似地，从Cut2中删除D-box会减少但不会消除泛素化；烧蚀剩余的O形盒基本上消除了反应性。因此，其他两种蛋白质中的O基序的行为与ORC1中的O盒相似，在体外指导Cdh1依赖性修饰。

讨论

O-box是介导APC依赖性降解的基序家族的一个新成员。与D-box一样，O-box也是一种短的便携式基序，足以指导体外的多泛素化和体内的细胞周期依赖性降解。O-盒和D-盒信号在泛素化反应中以某种目前未知的水平竞争，这表明，尽管它们在结构和功能上不同，但这两个基序都集中在降解机制的至少一个共同成分上。我们在另外两种蛋白质中鉴定了功能性O-box；考虑到基序的低序列复杂性和目前仅通过丙氨酸扫描对必需残基的定义(图2D)，似乎O盒存在于其他蛋白质中。

最近的两份报告(Burton等人，2005年;卡夫等人，2005年)大大扩展了早期的观察(Pfleger和Kirschner 2000;伯顿和所罗门2001;Hilioti等人，2001年)，证明了Cdh1与KEN和D-box肽之间的直接相互作用。鉴于各种破坏基序之间的功能同源性，我们询问是否可以在GST下拉、共免疫沉淀（co-IP）和酵母双杂交实验中检测到O-盒肽和Fzr之间的相互作用。我们无法检测到O型盒与Fzr/Cdh1的特异性结合；也许使用纯化成分进行更敏感的分析(Burton等人，2005年)或可交联的肽底物(卡夫等人，2005年)将有必要检测固有的微弱和瞬态相互作用。

ORC1的N端554氨基酸包含三个降解基序：一个O-box、一个KEN-box和三个D-box。它们扮演什么角色？O型盒主要负责调节全长ORC1的细胞周期耦合降解。我们的结果也清楚地表明，KEN-和D-盒在体外指导泛素化和体内降解方面充其量只起到很小的作用。最有可能的解释是，这些图案处于不利的环境中（正如在其他情况下观察到的那样-Zur和Brandeis 2002). 当替代ORC1 291-301位置处的O盒时，D-和KEN基序都在体外指导非常有效的多泛素化（图。​（图4B，第4页,​，5摄氏度5摄氏度).

我们假设ORC1的退化是S期开始后重置复制起源过程中不可或缺的一部分。在人类细胞中，ORC1在S期被SCF降解(Mendez等人，2002年). 前RC形成的负调节因子，如杰米宁和细胞周期蛋白B，在G2/M转变时被APC降解，然后在ORC1被重新合成后，前RC可以在G1中重组。在果蝇属、ORC1、细胞周期蛋白B(Sigrist等人，1995年)大概还有杰米宁(Quinn等人，2001年)均被APC降级；因此，尚不清楚何时重新建立前RC。一种可能是ORC1在G2/M转变期间在Fzy激活（导致细胞周期蛋白B和Geminin的破坏）和Fzr（导致ORC1的破坏）之间的狭窄窗口中起作用。另一种可能性是果蝇属在G1后期Fzr活性下降，ORC1在E2F的指导下重新合成时，才会发生前RC形成(Asano和Wharton 1999).

与GFP融合的ORC1稳定O-box突变衍生物的表达没有引起显著的细胞凋亡(图3)或使用各种GAL4驱动因子的生物体表型（数据未显示）。然而，使用相同的GAL4驱动子星座表达标记或未标记野生型ORC1都无法对与ORC1低水平组成表达相关的有机体和细胞表型进行现象复制(Asano和Wharton 1999). 我们假设，正如许多其他细胞周期调节因子（例如APC）的情况一样(Rudner和Murray 2000)ORC1活性可能由冗余机制调节。如果是这样的话，对ORC1降解作用的更敏感测试将是询问该蛋白的稳定O-box突变形式是否可以替代野生型蛋白的所有已知或可疑作用，包括复制控制和异染色质相关转录沉默(Pak等人，1997年)，染色体凝集(Loupart等人，2000年)以及突触可塑性的控制(Pinto等人，1999年;Rohrbough等人，1999年). 这样的实验等待分离和表征ORC1（ORC1）-突变体。

材料和方法

GMR-GAL4、en-GAL4、，和肌动蛋白5C-GAL4行以及无人机-GFP-NLS线路是从布卢明顿库存中心获得的。其他转基因苍蝇是通过微量注射w个1118用标准方法进行胚胎移植。解剖了三龄幼虫的视像盘，将其安装在PBS（130 mM NaCl，7 mM Na）中2高性能操作4和3 mM NaH2人事军官4)不固定，立即在荧光显微镜下观察。按照Neufeld等人的描述，对影像盘细胞进行分离和FACS分析(1998). 胚胎染色和构建ORC1-GFP融合基因和转基因果蝇如前所述(Araki等人，2003年). 通过将PCR片段插入SP6启动子下游BglII位点的pSP73（Promega）中，构建体外APC检测质粒（详细信息可根据要求提供）。体外泛素化试验基本上如所述进行(Tang和Yu 2004).D.m.asp公司和S.p.切割2分别用RT-PCR从poly（A）+mRNA和PCR扩增基因组DNA中分离cDNA。对于中所示的竞争实验图5在添加底物之前，将肽（由Sigma-Genosys合成）以最终浓度（33μM至3.3 mM）与Cdh1激活的APC预孵育1分钟。

致谢

我们感谢詹云堂在制备体外试验材料方面的帮助；Mike J.Cook和Lynn M.Martinek负责FACS分析；Tammy Lee、Laura Mitchell、Cary D.Gardner和Mami Kawaguchi寻求技术帮助；Glenda Johnson和Jian Chen负责媒体准备；和Sandy Curlee寻求行政帮助。我们感谢罗宾·沃顿（Robin P.Wharton）和约瑟夫·内文斯（Joseph R.Nevins）在这项工作中给予的慷慨支持和鼓励。这项工作得到了NIH向M.Asano（GM64348）和H.Y.（GM61534）提供的拨款的支持。荒木先生由上原纪念基金会的博士后奖学金资助。

笔记

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.101/1361905。

参考文献

  • Araki M.、Wharton R.P.、Tang Z.、Yu H.和Asano M.，2003年。果蝇中的后发复合体降解起源识别复合体大亚基。EMBO J。 22:6115-6126.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Asano M.和Wharton，R.P.，1999年。E2F介导果蝇ORC1的发育和细胞周期调节。EMBO J。 18:2435-2448页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 贝尔S.P.2002。起源识别复合体：从简单的起源到复杂的功能。基因与发育。 16:659-672. [公共医学][谷歌学者]
  • Bell S.P.和Dutta，A.，2002年。真核细胞中的DNA复制。每年。生物化学评论。 71:333-374. [公共医学][谷歌学者]
  • Brandeis M.和Hunt，T.，1996年。哺乳动物细胞中有丝分裂周期蛋白的蛋白水解从有丝分裂结束一直持续到S期开始。EMBO J。 15:5280-5289.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Burton J.L.和Solomon，M.J.，2001年。芽殖酵母Hsl1p中的D盒和KEN盒基序是APC介导的降解和与Cdc20p和Cdh1p直接结合所必需的。基因与发育。 15:2381-2395.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Burton J.L.，Tsakraklides，V.和Solomon，M.J.，2005年。APC-Cdh1基底复合物的组装通过破坏盒的接合来刺激。分子电池 18:533-542. [公共医学][谷歌学者]
  • Castro A.、Vigneron S.、Bernis C.、Labbe J.C.和Lorca T.，2003年。Xkid在D-box、KEN-box和a-box依赖途径中降解。分子细胞。生物。 23:4126-4138.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ciechanover A.1994年。泛素蛋白酶体蛋白水解途径。单元格 79:13-21. [公共医学][谷歌学者]
  • DePamphilis M.L.2003年。“ORC循环”：调节真核生物DNA复制的新途径。基因 310:1-15. [公共医学][谷歌学者]
  • Diffley J.F.2004年。染色体复制早期事件的调控。货币。生物。 14:R778-R786。[公共医学][谷歌学者]
  • 做Carmo Avides M.和Glover，D.M.1999。异常纺锤体蛋白、天冬氨酸和有丝分裂中心体微管组织中心的完整性。科学类 283:1733-1735. [公共医学][谷歌学者]
  • Ferreira M.F.、Santocanale，C.、Drury，L.S.和Diffley，J.F.，2000年。Dbf4p是一种重要的S相传递因子，是后发复合体降解的靶点。分子细胞。生物。 20:242-248.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Funabiki H.、Yamano H.、Kumada K.、Nagao K.、Hunt T.和Yanagida M.，1996年。裂变酵母中姐妹染色单体分离所需的Cut2蛋白水解。自然 381:438-441中。[公共医学][谷歌学者]
  • Funabiki H.、Yamano H.、Nagao K.、Tanaka H.、Gusuda H.、Hunt T.和Yanagida M.，1997年。后期所需的裂变酵母Cut2有两个销毁盒。EMBO J。 16:5977-5987.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Glotzer M.、Murray，A.W.和Kirschner，M.W.，1991年。细胞周期蛋白通过泛素途径降解。自然 349:132-138之间。[公共医学][谷歌学者]
  • Harper J.W.、Burton J.L.和Solomon M.J.，2002年。后期复合体：它不再仅仅用于有丝分裂。基因与发育。 16:2179-2206. [公共医学][谷歌学者]
  • Hilioti Z.、Chung，Y.S.、Mochizuki，Y.、Hardy，C.F.和Cohen-Fix，O.，2001年。后期抑制剂Pds1以破坏盒依赖的方式与APC/C相关蛋白Cdc20结合。货币。生物。 11:1347-1352. [公共医学][谷歌学者]
  • Hochstrasser M.1996年。泛素依赖性蛋白质降解。每年。修订版Genet。 30:405-439. [公共医学][谷歌学者]
  • Kearsey S.E.和Cotterill，S.2003。神秘的变异：调节真核生物DNA复制的不同模式。分子电池 12:1067-1075. [公共医学][谷歌学者]
  • 卡夫C.、沃德迈耶H.C.、莫雷尔·斯特罗S.、艾森哈伯F.和彼得斯J.M.，2005年。Cdh1的WD40螺旋桨域作为APC/C基质的破坏盒受体发挥作用。分子电池 18:543-553. [公共医学][谷歌学者]
  • Littlepage L.E.和Ruderman，J.V.，2002年。鉴定一个新的APC/C识别域a盒，它是有丝分裂退出期间Cdh1依赖性激酶Aurora-a破坏所必需的。基因与发育。 16:2274-2285.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Loupart M.L.，Krause，S.A.和Heck，M.S.2000。异常的复制时间导致染色体在果蝇属ORC2突变体。货币。生物。 10:1547-1556. [公共医学][谷歌学者]
  • McGarry T.J.和Kirschner，M.W.，1998年。双核蛋白是一种DNA复制抑制剂，在有丝分裂期间被降解。单元格 93:1043-1053. [公共医学][谷歌学者]
  • Mendez J.、Zou-Yang、X.H.、Kim、S.Y.、Hidaka、M.、Tansey、W.P.和Stillman，B.，2002年。人类起源识别复合体大亚单位在DNA复制启动后通过泛素介导的蛋白水解降解。分子电池 9:481-491. [公共医学][谷歌学者]
  • Neufeld T.P.、de la Cruz，A.F.、Johnston，L.A.和Edgar，B.A.，1998年。体内生长和细胞分裂的协调果蝇属机翼。单元格 93:1183-1193. [公共医学][谷歌学者]
  • Pak D.T.、Pflum，M.、Chesnokov，I.、Huang，D.W.、Kellum，R.、Marr，J.、Romanowski，P.和Botchan，M.R.1997年。高等真核生物中来源识别复合物与异染色质和HP1的关联。单元格 91:311-323. [公共医学][谷歌学者]
  • Peters J.M.，2002年。后期合成物：有丝分裂及以后的蛋白质水解。分子电池 9:931-943. [公共医学][谷歌学者]
  • Petersen B.O.、Wagener C.、Marinoni F.、Kramer E.R.、Melixetian M.、Denchi E.L.、Gieffers C.、Matteucci C.、Peters J.M.和Helin K.，2000年。哺乳动物CDC6的细胞周期和细胞生长调节蛋白水解依赖于APC-CDH1。基因与发育。 14:2330-2343.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pfleger C.M.和Kirschner，M.W.2000。KEN盒：与Cdh1瞄准的D盒不同的APC识别信号。基因与发育。 14:655-665.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pinto S.、Quintana D.G.、Smith P.、Mihalek R.M.、Hou Z.H.、Boynton S.、Jones C.J.、Hendricks M.、Velinzon K.、Wohlschlegel J.A.等人，1999年。latheo编码起源识别复合体的一个亚单位，并在突变时破坏神经元增殖和成人嗅觉记忆。神经元 23:45-54. [公共医学][谷歌学者]
  • Quinn L.M.、Herr，A.、McGarry，T.J.和Richardson，H.，2001年。这个果蝇属双核蛋白同源物：双核蛋白在限制DNA复制、后期和神经发生中的作用。基因与发育。 15:2741-2754.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rohrbough J.、Pinto S.、Mihalek R.M.、Tully T.和Broadie K.，1999年。拉西奥，a果蝇属参与学习的基因调节功能性突触可塑性。神经元 23:55-70. [公共医学][谷歌学者]
  • Rudner A.D.和Murray，A.W.2000。Cdc28的磷酸化激活后发复合体的Cdc20依赖性活性。细胞生物学杂志。 149:1377-1390.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sigrist S.、Jacobs H.、Stratmann R.和Lehner，C.F.，1995年。有丝分裂的退出受以下因素调节果蝇属泡沫和周期蛋白A、B和B3的相继破坏。EMBO J。 14:4827-4838.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 斯蒂尔曼B.2005。起源识别和染色体周期。FEBS信函。 579:877-884. [公共医学][谷歌学者]
  • 唐忠，余宏，2004。使用体外泛素化测定法对纺锤体检查点蛋白进行功能分析。方法分子生物学。 281:227-242. [公共医学][谷歌学者]
  • Thrower J.S.、Hoffman，L.、Rechsteiner，M.和Pickart，C.M.，2000年。多泛素蛋白水解酶信号的识别。EMBO J。 19:94-102.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamano H.、Tsurumi，C.、Gannon，J.和Hunt，T.1998年。细胞周期蛋白B中破坏盒及其邻近赖氨酸残基在分裂酵母中后期泛素依赖性蛋白水解中的作用：定义D-box受体。EMBO J。 17:5670-5678.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamano H.、Gannon J.、Mahbubani H.和Hunt T.，2004年。细胞周期调控APC/C对细胞周期蛋白B破坏盒的识别爪蟾鸡蛋提取物。分子电池 13:137-147. [公共医学][谷歌学者]
  • Zachariae W.和Nasmysy，K.1999。其最终目的是毁灭：细胞分裂和后发复合体。基因与发育。 13:2039-2058. [公共医学][谷歌学者]
  • Zur A.和Brandeis，M.，2002年。APC/C底物降解的时间由破坏盒的fzy/fzr特异性决定。EMBO J。 21:4500-4510.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社