纤维结合蛋白在细胞基质纤维中的延伸和展开由细胞骨架张力控制

摘要

细胞外基质（ECM）是控制细胞信号和行为。虽然许多ECM蛋白已被鉴定，但很少有了解矩阵组装如何改变其结构并赋予单个蛋白质中不存在的功能。人们对其了解较少细胞收缩力作用于蛋白质的机制组装物调节蛋白质功能。许多ECM蛋白质，例如纤维连接蛋白（Fn）、层粘连蛋白和血小板反应蛋白较大（>100 kDa），由重复的、结构明确的多功能蛋白质组成每个模块通常小于100 aa。多模态结构可以作为将多个功能集成在一起的便捷方式分子。例如，一些模块携带细胞粘附位点，而另一些携带用于结合其他蛋白质和自我组装的位点。功能场所的暴露可由以下组织控制细胞外基质中的这种位点，以及通过施加力按单元格(1——三)。然而，调控ECM的分子机制蛋白质组装和结合位点的暴露尚不清楚。

Fn是一种ECM蛋白，通过细胞介导组装成不溶的弹性纤维。在血液中以及由细胞分泌时，如成纤维细胞Fn以可溶性二聚体的形式存在。二聚体的两条链由三种类型的重复球状模块（FnI、FnII、，和FnIII）通过可变柔度的短链线性连接，在C末端由一对二硫键连接(4,5).虽然Fn的可溶性形式是相对无活性的，但组装成纤维导致Fn大部分生物活性的表达。这些活动包括调节细胞粘附，增殖和分化，以及胚胎发生和伤口治愈(6)。Fn的纤维蛋白网络将细胞与他们的环境。研究表明，细胞收缩性Fn组装成纤维所需(7——11)还有伸展运动暴露嵌入蛋白质中的隐秘位点(12,13)。此外，Fn纤维具有很高的弹性，受到细胞生成的张力(14).因此，Fn是研究蛋白质功能由矩阵装配和拉伸控制。

需要实验技术来确定细胞如何改变纤维基质中蛋白质的结构及其变化与功能变化相关。我们最近演示了荧光共振能量转移（FRET）在Fn上附着的多个供体和受体荧光团用于检测细胞培养中Fn的不同构象(15)。Fn展开时，捐赠者和捐赠者之间的平均距离增加了纳米级受体导致FRET降低，观察到供体减少发射和受主发射的增加。Fn分子展开到细胞培养中的不同程度可以通过荧光显微镜中的发射颜色，以及使用显微镜附光谱仪。在细胞实验之前，我们将FRET与溶液中已知Fn展开行为关联用氯化胍变性Fn。然后，我们将标记为Fn的NIH 3T3成纤维细胞培养基，并使细胞将其并入基质纤维。基于分子内FRET，我们之前已经表明细胞原纤维中的Fn高度延伸相对于扩散结合到细胞膜的Fn。在这里，我们证明细胞骨架张力由表面粘附物产生成纤维细胞拉伸原纤维内的Fn分子，使FnIII模块细胞骨架张力的破坏细胞松弛素D允许重折叠。这些结果可以深入了解Fn基质结构和弹性的分子基础。

材料和方法

结果

Fn用供体和受体荧光团标记反应：胺残基被随机标记为俄勒冈州绿供体荧光团和模块中的游离半胱氨酸FnIII公司₇和FnIII₁₅是用受体四甲基罗丹明进行定点标记。我们通过展开测试FRET对构象变化的敏感性Fn-D/A溶液中使用Gdn●HCl。图。​图11以Fn-D/A表示FRET的减少在公共广播系统(15)。能量转移涉及受体发射的增加伴随着施主排放量的减少；然而，我们有归一化光谱到施主峰，从而改变能量传递只有受主峰的变化才能反映出来。减少FRET从0到2 M Gdn●HCl（图。​（图1）1)指示Fn展开，以及很可能是由于Fn的两股分离引起的破坏稳定球状状态的离子相互作用(16)。FRET在>200万加仑HCl时进一步下降进一步Fn展开。在这些较强的变性条件下显示Fn模块逐渐展开(17)。因此，减少在FRET中，大于200万Gdn的HCl可能是供体-受体的结果模块展开导致的分离。在8 M Gdn·HCl中的Fn-D/A显示出与游离混合物无法区分的光谱溶液中的供体和受体荧光团，表示完全丢失FRET公司。在完全失去FRET由供体发射的光谱尾部和受体的直接激发。

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图1

变性过程中能量转移对Fn-D/A去折叠的敏感性解决方案。Fn-D/A发射光谱使用带有光谱仪的外荧光显微镜。光谱为归一化为施主峰，因此能量传递的变化由受体峰的变化表示。Fn-D/A进行性在0 M到8 M的Gdn●HCl浓度范围内变性。Fn-D/A在0 M Gdn？HCl中显示为红色，0.5 M为橙色，1 M为黄色、2 M浅绿色、3 M深绿色、4 M紫色和8 M黑色。Fn-D/A在8M Gdn●HCl中的发射光谱为与自由供体和受体的混合物无法区分PBS中的荧光团。在8 M Gdn●HCl下570 nm处的小肩部不是由能量传递引起的，而是由施主荧光尾和直接激发荧光受体。(插入)FRET（受体峰除以供体峰值）作为Gdn●HCl浓度的函数。

图。​图22 A类——C类显示NIH间拉伸基质纤维Fn-D/A的荧光图像3T3成纤维细胞粘附在Fn-涂层玻璃上。出现纤维以绿色为主，细胞表面呈红色，表明纤维蛋白的能量转移水平。这个颜色差异，由从单个纤维（图。​（图22E类)，表示纤维Fn-D/A比Fn-D/A扩散结合到细胞表面。FRET与细胞表面Fn-D/A相关相对均匀，与PBS中的Fn-D/A相当无变性剂。纤维Fn中的FRET与Fn-D/A相当在0.5M至4M的Gdn·HCl溶液中。进一步光谱分析原纤维的FRET显示出沿个体的显著变化原纤维和原纤维之间。一些原纤维沿整个纤维（<5%变化），而其他纤维变化很大（高达25%）（图。​（图22D类).

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图2

成纤维细胞基质中Fn-D/A的荧光图像和光谱纤维。(A类——C类)Fn-D/A添加到NIH 3T3成纤维细胞的培养基并纳入其纤维基质。添加多余的未标记Fn以防止分子间能量传递。纤维明显与其他分离对纤维和细胞进行分析。箭头表示开始和结束沿着纤维收集的一系列光谱的点。光谱为由间距约为1μm的0.5μm原纤段整合而成。（比例尺，10μm）(D类)纤维间FRET不同沿着单个纤维。标记为A、B和C的光谱对应于图像中的纤维。其他被分析的原纤维由小写字母，d–l。阴影区域表示FRET的范围用细胞松弛素D处理的细胞的纤维中观察到Fn-D/A，破坏细胞骨架张力的试剂(n个=78，8个纤维）。底部的虚线表示FRET来自PBS中800万加仑HCl的Fn-D/A。

为了破坏作用于纤维的细胞骨架张力，我们处理了细胞与Fn-D/A孵育24小时后，用cytoD孵育1小时荧光图像中，我们观察到主要纤维发生了移位颜色从绿色到黄色（图。​（图3三A类)。此换档指示FRET增加，表明经细胞D处理的原纤维中的Fn-D/A与未经处理的样本相比，细胞的展开程度更低。FRET的增加经光谱分析证实。相关的平均FRET用cytoD治疗后纤维中的Fn-D/A为62%±3.3%(n个=78，8个纤维），显著高于未处理样品，54%±10%(n个=115，11根纤维）(P（P）<0.001，两个样本t吨测试）。范围细胞D处理样品中FRET的含量（15%）比未经处理的样品（45%）。

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图3

细胞松弛素D对基质纤维中Fn-D/A构象的影响。(A类)治疗后纤维的荧光图像加入Fn-D/A后，10μM cytoD细胞持续1小时变成纤维。用cytoD处理的细胞样本中出现纤维主要为黄色，表明FRET水平高于主要是未处理样品的绿色纤维。FRET的增加表明cytoD允许Fn-D/A在相对纤维中的重折叠未经处理的样品。（比例尺，10μm）(B类)平均值纤维FRET水平（受体峰除以供体峰）未处理样品，54%±10%(n个= 115, 11纤维），显著低于用cytoD处理的样品，62 ± 3.3% (n个=78,8根纤维）(P（P）<0.001，两个样本t吨测试）。这个细胞D处理的细胞原纤维中的FRET范围（15%）也是比未处理细胞窄（45%）。

讨论

titan和tenascin等蛋白质通过使用原子力显微镜和光学镊子(18,19)，但是细胞是否在以下条件下展开蛋白质或蛋白质模块的问题生理条件仍未得到回答(14,20)。通过测量FRET在与Fn偶联的供体和受体荧光团之间，我们能够研究细胞生成张力对细胞结构的影响纤维基质中的Fn。循环生物化学实验二向色性和荧光偏振表明变性剂PBS中高达200万加仑HCl的浓度会破坏静电在紧凑构象中保持Fn的相互作用(21)。这些条件导致Fn在离开时打开成扩展构象单个模块的二级结构完好无损(16)。暴露于Fn-D/A至2 M Gdn●HCl导致FRET下降（受体峰除以供体峰）从0 M时的85%到60%（图。​（图1）1)因为Fn的两股之间的能量传递损失彼此分离。FRET保持在200万加仑HCl将然后主要发生在供体和受体之间股线。FnIII模块的高分辨率结构已显示不同的模块在结构上是同源的，尺寸为3.2nm从N到C终点(22——25)。因为FRET仅限于捐赠者和位于彼此10 nm范围内的受体(26)，仅捐赠者模块FnIII内_5–9和FnIII公司_13–15与接受者足够接近位于FnIII内₇和FnIII型₁₅以允许能量传递。从2 M到4M Gdn·HCl，FnIII模块依次展开，从最不稳定模块(16,27)。FRET从2M时的60%下降因此，4M时Gdn●HCl达到42%是由FnIII的展开引起的位于受体标记半胱氨酸10nm范围内的模块。这个FRET对使用Gdn●HCl展开范围的敏感性证明FRET对一系列Fn构象敏感，从相对紧凑到扩展，FnIII模块展开。

从细胞荧光图像中最直接的观察结果是基质纤维中的Fn-D/A主要为绿色，而细胞表面呈红色（图。​（图22 A类——C类)。采集的光谱从0.5μm区域开始，沿着纤维间隔1μm显示FRET沿整个纤维变化小至3%，高达25%（图。​（图22D类)。大多数纤维中的FRET与Fn-D/A用于100万至400万Gdn●HCl溶液。FRET的范围表明Fn-D/A在一些但不是所有纤维中延伸在受体位点附近展开的FnIII模块FnIII公司₇和FnIII₁₅。我们使用术语“超延伸”用于描述Fn的这些构象：展开至少一个模块。第二个观察结果是不同的Fn纤维表现出不同的FRET平均水平。电池通过机械连接ECM来在ECM上建立张力具有跨膜整合素的可收缩细胞骨架。要确定不同水平的细胞骨架张力是否与纤维Fn去折叠的差异，我们破坏了细胞收缩细胞D的作用，通过覆盖肌动蛋白丝的快速生长末端。相关FRET的平均水平经细胞D处理的样品中有纤维，62%±3.3%显著高于未处理样品中的原纤维，54%±10%(P（P）<0.001，两个样本t吨测试）（图。​（图3）。FRET公司三).经细胞D处理的样品的原纤维中的FRET与Fn-D/A在0.5 M至2 M Gdn●HCl溶液中，对应于与FnIII模块的一致性完好无损。因此，细胞释放收缩性似乎允许Fn通过FnIII的折叠而松弛模块。

这些结果为深入了解Fn的分子基础提供了线索纤维弹性。通过使用表达Fn–绿色荧光的细胞蛋白质嵌合体等。(14)显示Fn纤维手术切除后收缩四倍。两种型号有被提议解释Fn原纤维的弹性。第一个该模型提出纤维内的Fn二聚体的结构如下它们的N末端区域与纤维轴对齐，并且C末端区域垂直于纤维轴折叠。机械张力将分子拉向纤维轴，导致原纤维拉伸(14,17)。根据这个模型，张力下纤维Fn-D/A中的FRET水平应更高或等于Fn-D/A及其FnIII模块的扩展完整-FRET在50万至200万加仑HCl中的水平，60%至75%（图。​（图1）。1)。因为张力下纤维的FRET主要较低与这些值相比，我们的结果不支持第一个模型。这个第二个模型提出Fn纤维的弹性来源于Fn模的解折叠(12——14)。因为FRET纤维数量几乎与用8M变性的Fn-D/A一样低Gdn●HCl，我们的结果表明一些FnIII模块是展开的纤维内Fn。治疗后能量转移增加cytoD提示FnIII模块在释放张力时会重新折叠。原子力显微镜和操纵分子动力学模拟已经显示了强制展开单个FnIII模块会导致延伸肽约为天然模块长度的10倍(13,28)。FnIII模块缺乏内部二硫键机械稳定性低于FnI或FnII模块。力引起的FnIII模块的展开为一种提议的机制提供了基础Fn自组装成纤维。当相邻Fn分子折叠时张力释放后，它们可以通过在FnIII模块之间进行β链或β片交换(29).

成纤维细胞原纤维中Fn被拉伸成扩展和部分分解，或“超扩展”构象具有功能含义。至少有三个Fn超延伸改变其功能的机制状态：(我)通过暴露被掩埋的隐秘地点处于本机状态的Fn模块之间；(ii（ii）)通过更改结合相同的两个或多个结合位点的相对距离受体；和(三)通过拉直亲水回路携带结合位点的(30)。已在上确定了秘密地点FnIII公司₁、FnIII_7–8、和FnIII公司₁₀必须暴露以启动Fn矩阵组件(31——34)。转向分子动力学模拟预测在FnIII模块解体之前，隐秘的地点被掩埋相邻模块之间可以以中间状态暴露FnIII模块的力诱导展开途径(28)。拉伸FnIII模块进入此中间状态所需的力小于分解第一条β链。拉伸分子动力学模拟还预测，拉伸FnIII型₁₀模块进入此中间状态减少α₅β₁整合素装订(35)。整合素亲和力的降低是由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸之间的距离增加（RGD）环及其协同位点，从3.2 nm到5.6 nm。协同效应站点是必需的α₅β₁绑定Fn，但其他整合素不需要。While期间α₅β₁-介导信号可能在与未拉伸Fn（其他整合素信号）结合的细胞中占主导地位当协同位点与RGD分离时，这些途径可能会相互竞争。如果施加足够的力来解开FnIII模块，露出回路含RGD序列等位点将被拉直，降低整合素亲和力(36)。此场景是如何纤维内Fn去折叠的变化可能会改变沿着纤维的生化线索。

实验表明，Fn的构象变化深刻的生物后果。例如，底层诱导吸附Fn的构象变化可以调节整合素结合和导致成肌细胞增殖和分化之间的转换(37)。Fn矩阵结构的变化影响细胞信号模式控制细胞增殖。Fn突变体缺失FnIII公司_1–7形成结构独特的矩阵阻止进展G公司₀/G公司₁进入S相，而天然Fn组装的基质刺激细胞生长(1).

保持Fn纤维处于张力下需要高昂的价格成纤维细胞可能通过付费来调节Fn识别的暴露地点。机械张力可以作为细胞改变的手段环境所呈现的生物化学信号。一旦他们粘附在表面并产生ECM，细胞可能开始调节环境通过施加力而产生的化学刺激。

我们观察到Fn内Fn展开程度的差异可收缩细胞的原纤维。个人经历的力量纤维连接蛋白分子可能取决于纤维是否自由悬浮，与其他纤维或EMC蛋白质相互连接，或附着在基板上。取决于附件数量和相邻细胞施加的力、呈现和活动的功能位点可能沿纤维变化。

Fn是一种ECM蛋白，有实验证据细胞张力导致蛋白质展开。作为更大的超分子组装，Fn与其他蛋白质机械耦合所以施加在Fn上的力可以转移到这些蛋白质上，也可能改变它们的结构。几种ECM蛋白，包括tenascin和几种类型的胶原蛋白，包含FnIII模块(38——40)这些可能与Fn的同步展开。这个FRET研究Fn构象的方法也可以应用于其他ECM蛋白质，以更好地了解它们如何集成到ECM中并受到细胞收缩力的影响。需要进一步研究了解蛋白质的功能，如细胞结合、蛋白质结合、，而自组装则受到细胞产生的机械力的影响。这些是确定ECM集成方式的初始步骤蛋白质形成超分子组装体使细胞能够机械地调节环境的生物活动。

致谢

缩写

脚注

参考文献