多细胞生物通过有丝分裂从单个细胞起源，产生不同的细胞类型。不对称细胞分裂产生两个命运不同的子细胞，是产生细胞类型多样性的途径之一。果蝇属感觉器官的发育非常适合研究不对称细胞分裂(10,32,41). 这些感觉器官是通过感觉器官前体（SOP）细胞的几轮不对称细胞分裂产生的。例如，在外部感觉器官谱系中（见图。H和I），单个SOP细胞分裂产生两个不同的子细胞，即a和B细胞。A细胞分裂产生毛细胞和眼窝细胞，而B细胞产生神经元和鞘细胞。这三个分裂都是不对称的，每个分裂都产生两个命运不同的子细胞。
nota上外部感觉器官中的细胞命运转变。（A） 来自野生型苍蝇；（B） 来自Nak过表达苍蝇；（E） 来自Numb过度表达的苍蝇；（G） 来自Nak和Numb过度表达的苍蝇；（C和F）分别来自面板B和E的入口。在面板C中，箭头表示2头发2插孔鬃毛，箭头表示1头发3插孔鬃毛。在面板D中，填充箭头表示2插座表型，而空箭头表示Nak过度表达导致的4插座表型。在图F中，由Numb过表达引起的2-空气-无插座表型用两个箭头标记。（H） 成人外部感觉器官示意图；（一） 外部感觉器官谱系，实心箭头表示Nak过度表达导致的细胞命运转变的方向，而下方的空箭头表示Numb过度表达引起的方向。n、 神经元；sh，鞘细胞；h、 毛细胞，所以是窝细胞。
细胞不对称分裂可能是由于细胞内决定簇分布不均，导致其优先分离为两个子细胞之一（有关综述，请参阅参考文献29). 膜相关Numb蛋白是感觉器官谱系不对称细胞分裂的决定因素(42). Numb蛋白在前期定位于SOP中的一个皮层新月体，并优先于末期的两个子细胞之一分离(35). 遗传分析揭示了麻木的在不对称细胞分裂中(42,49). 损失麻木的功能可以在不同的发育阶段诱导，并导致正常不对称细胞分裂的两个子细胞采用相同的命运；SOP分裂产生两个A细胞（B细胞到A细胞的转化；见图。I表示外部感觉器官谱系）。A细胞分裂产生两个毛细胞（袜子到毛细胞的转化），B细胞分裂生成两个鞘细胞（神经细胞到鞘细胞的转换）。相比之下，Numb的过度表达导致与这三个分裂中每一个分裂中的功能丧失突变体中观察到的转化相反的转化，这表明Numb蛋白水平影响细胞命运规范。Numb在中枢神经系统成神经细胞有丝分裂期间也定位(35,42)是中枢神经系统中MP2前体不对称分裂所必需的(47).
除了细胞内的决定因素外，细胞外的线索，如信号分子或细胞间的相互作用，也会影响细胞的命运规范并导致不对称的细胞分裂(31). 由膜Notch受体介导的细胞间相互作用是外部线索影响不对称细胞分裂的一种机制。缺口可能被Delta或其他配体激活以调节下游靶点，例如无毛抑制因子[Su（H）](2,36)和有轨电车(19)，这是感官器官谱系中细胞命运规范所必需的。损失或收益槽口感觉器官和MP2神经元形成过程中的功能会导致细胞命运的转变，这与麻木的函数，分别(19,25,46). 上位分析表明槽口作用于下游麻木的(19,46). Numb和Notch以及Numb与Notch的哺乳动物同源物之间已观察到直接的蛋白质相互作用(19,53). 此外，Numb抑制培养细胞中的Delta依赖性Notch信号黑腹果蝇S2细胞，如Su（H）无法转位到细胞核中所示，以及外源性表达的Numb在翅膀发育期间抑制Notch功能(17). 因此，细胞内因子Numb和Notch介导的细胞外影响对不对称分裂期间正确的细胞命运规范都很重要，Numb至少部分通过拮抗Notch活性发挥作用。
Numb蛋白含有磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域（也称为磷酸酪氨酸相互作用结构域）(7). Numb（mNumb）小鼠同源物的PTB结构域(53)和鼠核样蛋白（rNbl）的大鼠同源物(54)与PTB结构域的氨基酸同源性分别为71.5%和75.2%果蝇属数字（dNumb）。与dNumb一样，mNumb在神经前体细胞分裂过程中是非对称定位的，mNumber或rNbl的过度表达会导致细胞命运在果蝇属感觉器官谱系，表明Numb蛋白的功能在进化过程中保持不变。dNumb的PTB域对其不对称定位不是必需的，但对其功能是必需的(17). PTB结构域缺失的dNumb的过度表达不会导致体内细胞的命运转变，也不会抑制培养的S2细胞中Notch信号介导的Su（H）核转位，即使在有丝分裂期间仍形成新月形。
PTB结构域也存在于诸如Shc等信号分子中(5,34)和胰岛素受体底物（IRS）家族(27). 作为衔接蛋白，Shc与活化受体（如表皮生长因子、神经生长因子和抗原受体）结合，IRS与活化胰岛素受体结合，从而将信号传递给下游效应蛋白（参考文献综述37). 当被激活时，这些受体在酪氨酸残基处自动磷酸化，导致磷酸化酪氨酸与适配蛋白的Src同源性2（SH2）或PTB结构域结合。尽管Shc和IRS PTB结构域之间缺乏强烈的序列相似性，但两个PTB结构区与NPXpY基序（其中酪氨酸残基被磷酸化）的相互作用已被证明(22,27,33). 然而，Shc PTB结构域和IRS-1 PTB结构区的识别取决于NPXpY基序的序列上下文(28,52)表明不同PTB结构域的结合特异性不同。结构分析进一步表明，两个PTB结构域的拓扑结构类似于pleckstrin同源结构域（PH）的拓扑结构(15,37,55)β-三明治由两个几乎相反的β-薄片形成，一端由C端α-螺旋覆盖。在PTB结构域和含磷酸肽的NPXpY基序的复合物中，肽与PTB结构区的两个β片断之一形成β链反平行，磷酸酪氨酸融入一个很大程度上疏水的囊中。Shc-PTB域和IRS-PTB域表现出类似的配体结合机制，但使用不同的残基来识别磷酸酪氨酸。虽然PH域的拓扑结构与PTB域相似，但PH域识别配体的机制不同于PTB域；磷脂酶Cδ的PH结构域的表面被其配体1，4，5-三磷酸肌醇识别(16)与NPXpY基序识别的PTB域表面不同。
Numb蛋白参与不对称细胞分裂引发了许多问题。Numb蛋白如何在有丝分裂期间不对称定位？Numb和Notch之间的物理相互作用如何导致Notch信号的抑制？Numb的PTB域的功能是什么？Numb除了抑制Notch信号外还有其他功能吗？鉴于Numb的定位或功能可能涉及与Numb结合的蛋白质，我们使用酵母双杂交系统搜索Numb相互作用蛋白质(12)作为回答这些问题的第一步。我们分离出一种新的基因产物，Numb-associated kinase（Nak），在生化分析中与Numb表现出强烈的相互作用。删除分析表明，相互作用涉及Numb的PTB域。虽然Shc和IRS的PTB域与NPXpY序列基序结合，但Numb PTB域和Nak的相互作用不需要该基序或酪氨酸。Nak与Numb相互作用的特异性通过测试其与Shc PTB结构域的结合来检测。在过度表达Nak的转基因果蝇中，研究了Nak在不对称细胞分裂中的可能活性。
材料和方法
酵母双杂交筛选和分析。
酵母双杂交筛选中使用的GAL4激活域（GAD）库是S.Elledge（贝勒医学院）赠送的。它是由三英寸幼虫cDNA制成的。酵母双杂交筛选的方法如参考文献所述三简而言之，文库cDNA与pBHA-Numb（编码LexA-Numb融合蛋白）共转化为L40菌株(30)，并为他的+.他的+使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β进行蓝色分析时，菌落被过滤-d日-吡喃半乳糖苷（X-Gal）作为LacZ活性的底物。在对LexA-Lamin进行二次筛选后(三)代替LexA-Numb，获得了5个阳性克隆；两个阳性克隆编码Nak，如图所示。答：。
（A） 开放阅读框示意图无，编码1490 aa。带阴影的框表示丝氨酸/苏氨酸激酶催化域。还显示了两个阳性克隆13-1和7-2的起始点，这两个克隆来自双杂交屏幕。（B） Nak、两种酵母蛋白（GenBank登录号p38080和p40494）和一种酵母蛋白的激酶催化域的比较秀丽线虫（z46242）。只有这四种蛋白质中相同的残基才会装箱。其中一些残基是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的特征，并用黑点标记。催化结构域的子域用I到XI标记。（C） Nak的完整预测氨基酸序列。突出显示了C末端附近结合Numb PTB结构域的11-aa肽。
图中给出的LacZ（β-半乳糖苷酶）活性。到是六个独立样本的平均值和标准偏差。β-半乳糖苷酶活性的测试和活性如参考文献所述4，进行了以下修改。在含有2%半乳糖、2%甘油和2%乙醇作为碳源的标准酵母培养基中培养的4毫升对数相酵母培养物与0.4毫升Z缓冲液混合。在加入50μl氯仿和50μl 0.1%十二烷基硫酸钠后，将酵母培养物涡旋30 s，并在30°C下预培养5分钟，然后加入160μl底物，哦-硝基苯-β-d日-吡喃半乳糖苷（4 mg/ml）。试管在30°C下进一步培养，直到形成黄色。
Nak绑定到Numb的PTB域。（A） 利用酵母双杂交系统绘制Numb的相互作用域。将不同的Numb片段与LexA融合，并单独使用GAD（−−）或编码GAD与Nak（13-1）的aa 1088-1490融合的13-1克隆进行测试。关于β-半乳糖苷酶（LacZ）活性的测定和计算，请参阅材料和方法。给出了六个独立样本的平均值和标准偏差。（B） Numb-PTB结构域与Nak C末端的体外结合。GST-Nak（1385-1490）（第2车道），但不限于GST（第1车道）或GST-Nag（1385-1428）（第3车道）35S标记的Numb-PTB域。GST和GST-Nak（1385-1490）均不与荧光素酶相互作用（通道4和5）。Numb-PTB和荧光素酶的装载控制如第6和第7车道所示。
Nak和PTB结构域之间相互作用的特异性测试。（A） mNumb、rNbl、dShc和mShc的PTB结构域与GAD或GAD-Nak（aa 1088至1490，13-1克隆）共转化到用于LacZ活性测定的酵母双杂交报告菌株中。（B） 在体外结合试验中，dShc和mShc的PTB结构域与Nak的c1片段（氨基酸1422-1490）没有相互作用。控制如图所示。B。
pBHA载体由pBTM116修改而来(4)在多个克隆位点的开头插入血凝素标记（YPYDVPDYA），用于克隆Numb和Shc的不同片段。血凝素标签用于检测酵母中融合蛋白的表达（数据未显示）。
pGAD-生长激素(23)用于克隆Nak的C末端片段，如图所示。B.图中所示Nak的各种删除。A是在原始pACT中完成的(14)用于构建库的向量。
绘制Nak的相互作用区域。（A） 如LacZ活性所示，13-1结构的各种缺失在不同程度上影响与LexA-Numb-PTB的相互作用。（B） 根据His上酵母菌落的生长情况，测试了不同Nak C末端区域与LexA-Numb-PTB的相互作用−平板和滤过液X-Gal分析中蓝色外观。服用His两天后的生长−对平板进行评分，+的数字表示相对大小。−，没有增长。对于滤过提升X-Gal分析，+++++表示菌落在15分钟内变蓝，在300分钟内变深蓝色，++++代表菌落在30分钟内变蓝色，300分钟内变成深蓝色，++代表菌群在60分钟内变为蓝色，300 min内变为中蓝色，−代表菌落300分钟内没有蓝色（C）体外结合试验，测试Nak C末端片段与Numb-PTB之间的相互作用。面板B（D）中与Numb-PTB相互作用的Nak最小区域的氨基酸序列的最右边一栏总结了该分析的结果。
mNumb和rNbl的LexA和PTB结构域融合蛋白的DNA构建由W.Zhong提供果蝇属Shc（dShc）和小鼠Shc（mShc）通过PCR从果蝇属和一个小鼠cDNA文库（来自旧金山加利福尼亚大学Y.-W.Chen的礼物）。PTB结构域的连接如参考文献所示55.
分子克隆。
通过筛选两者，获得了编码Nak的全长cDNA果蝇属λ-ZAP幼虫和蛹cDNA文库（犹他大学C.S.Thummel赠送）。
体外结合试验。
将各种Nak C末端片段克隆到框架内pGEX载体（Pharmacia Co.）中，用于在大肠杆菌DH5α作为谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合蛋白。将100μM异丙基硫代吡喃半乳糖苷添加到对数相细菌中，诱导融合蛋白表达2至3小时。在磷酸盐缓冲盐水中对细菌进行超声处理后，在离心前添加0.1%Triton X-100以去除不溶性颗粒。上清液保存在−80°C的10%甘油中。
将含有Numb和Shc PTB结构域编码序列的DNA片段克隆到pNAC载体（宾夕法尼亚大学J.P.O'Connor赠送）中35S标记蛋白在TnT偶联裂解物系统（Promega Co.）中表达。对于体外结合试验，将2至5μg GST融合蛋白与5至10μl含有35S标记蛋白质。添加20μl GST-琼脂糖珠（Sigma Co.）后，将试管在室温下孵育2分钟。用磷酸盐缓冲盐–100 mM NaCl–0.1%Triton X-100清洗这些珠四次，然后与蛋白负载缓冲液混合以避开结合蛋白。
为了估计GST-c1蛋白融合物与Numb PTB结构域结合的解离常数，我们使用几种浓度的GST-c1protein沉淀体外翻译的Numb PT B。沉淀50%标记Numb PTB所需的Gst-c1浓度约为1μM。
免疫沉淀。
隔夜从一个无人机(上游激活序列)-myc-nak（我的名字）男性和粗糙的GAL4雌性（如下所述）。根据参考文献制备胚胎提取物13.使用抗c-Myc抗体-大蒜糖结合物（圣克鲁斯生物技术公司）进行联合免疫沉淀，沉淀在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上运行，以与抗c-Myc或抗Numb抗体进行Western印迹。
苍蝇遗传学。
全长DNA片段纳克和麻木的基因是不是我-Xba公司来自pBS-13-1F的I片段和千磅来自hs-numb#2的I片段(42)分别是。将每个DNA片段亚克隆到pUAST载体的相应限制性位点。将pUAST nak和pUAST麻木DNA注射到w个−苍蝇创造转基因苍蝇(43). 这些转基因苍蝇被杂交到Sca-GAL4(29)或109-68苍蝇(17); 这些GAL4增强子陷阱线可能在粗糙的轨迹。将这些杂交的幼虫后代保存在25或30°C（通常在30°C时获得比25°C时更强的表型），并检查其在感觉器官中的过度表达表型。约三分之一（33人中的10人）无人机导航和大多数（18个中的15个）UAS编号独立的转化子表现出相似的表型，尽管表型的强度因转化株系而异。第15个转化子无人机导航和第14页，共页UAS编号给出了强而一致的表型，并在本报告中用于定量分析。
pUAS-myc-nak是通过插入无打开读取帧序列到pBS-βG向量（来自I.Clark），其中包括爪蟾珠蛋白基因和amyc公司标签序列。这个myc-nak公司将融合序列亚克隆到pUAST载体中进行胚胎注射。
表型检查。
用于检查胚胎神经元/鞘细胞转化，纯合子无人机nak和UAS编号转基因果蝇与纯合果蝇杂交Sca-GAL4苍蝇。在室温下收集胚胎4小时，再将其移至30°C下9.5小时。固定和染色程序如参考文献所述16.单克隆抗体22C10(56)和兔抗Prospero(50)分别以1:250和1:1000稀释液对神经元和鞘细胞进行染色。使用蔡司显微镜和Bio-Read MRC-600共焦显微镜对图像进行分析。
在80%异丙醇中从苍蝇身上解剖成虫，并将其置于Hoyer培养基中(1).
结果
的标识无基因。
为了鉴定编码与Numb蛋白物理相互作用的蛋白质的基因，我们使用酵母双杂交系统筛选与GAD编码序列融合的第三代幼虫cDNA文库（参见材料和方法）。从200万个菌落中，我们分离出两个独立的克隆（13-1和7-2[图。A] ）与新基因相对应，无，具有1490个氨基酸（aa）的开放阅读框（图。C） ●●●●。Nak蛋白在N末端包含假定的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（图。A） ，与由来自秀丽隐杆线虫和两个来自酿酒酵母（图。B） ●●●●。这些基因的功能尚不清楚。Nak和三种相关的假定激酶包含保守在已知激酶亚结构域中的特征残基，但域I除外：Nak和相关激酶不包含大多数激酶域I中的GXGXXG核苷酸结合基序，而是包含GGFA基序。GGFA基序也存在于polo激酶家族plo1中+属于葡萄裂殖酵母，CDC5，共酿酒酵母，马球D.黑腹果蝇和哺乳动物的polo样激酶(39)这表明这些蛋白可能代表一类新的激酶。
要确定无，我们进行了Northern分析，结果表明，5.5-kb mRNA在发育的所有阶段（胚胎、幼虫、蛹和成虫）都有表达，4.5kb mRNA至少在0到12小时的胚胎中有表达，3-kb mDNA在0到3小时的胚胎（而非3到12小时）中有表达。所有三条信息都与包含激酶结构域编码序列的探针杂交，但只有5.5-kb mRNA与对应于Nak C末端的探针杂交（aa 1088至1490）。在整座胚胎中观察到普遍存在的表达模式（数据未显示）。
Nak与Numb的PTB结构域的结合。
利用酵母双杂交系统绘制了Numb的Nak相互作用域。N端部件（图。A、 第2行）或PTB结构域（图。A、 Numb的第5行）与13-1克隆相互作用，其中包括Nak C末端区域（aa 1088至1490）。在双杂交试验中，Numb PTB结构域两端的片段没有显示出与13-1的任何相互作用（图。A、 第3行和第4行）。因此，Numb的PTB结构域对于与Nak的C末端片段的相互作用是必要的和充分的。
在体外结合试验中，Numb PTB结构域和Nak C末端之间的相互作用也很明显，即细菌融合蛋白GST-Nak（aa 1385至1490）的共沉淀，其中包括Nak的Numb相互作用区域（见下文），以及Numb的体外翻译PTB结构区（图。B、 泳道6）通过谷胱甘肽琼脂糖珠（图。B、 车道2）。GST或GST-Nak（aa 1385至1428）均未观察到这种共沉淀，其缺乏Nak的Numb-相互作用区域（见下文）。在另一个对照组中，GST和GST-Nak（aa 1385至1490）未能与体外翻译的荧光素酶蛋白共沉淀（图。B、 车道4和5）。因此，Numb的PTB域与Nak C末端特异性相互作用。
Nak与Numb PTB结构域的新型相互作用。
含有磷酸酪氨酸的NPXpY基序被Shc和IRS-1的PTB结构域识别(22,27,33)也可能是Numb PTB域(51). 相反，Nak的Numb-interacting区域（aa 1088至1490）不包括任何NPXY基序，这表明Numb的PTB结构域与Nak的结合在力学上不同于PTB结构区与NPXY模序的相互作用。为了测试这种可能性，我们检测了Numb PTB结构域中的点突变的影响，这些点突变对应于已知破坏Shc和酪氨酸磷酸化p145之间相互作用的Shc PTB结构区的点突变(55). Numb-PTB结构域的S148A突变对应于Shc-PTB结构域中的一个突变，该突变将Shc和酪氨酸磷酸化p145之间的相互作用减少了60%，但它不影响Numb-PTB-结构域和Nak C末端之间的相互影响（aa 1385-1490）（图。A、 车道8）。Numb-PTB结构域的另一个点突变R171N对应于Shc-PTB结构域的突变，该突变完全消除了Shc和酪氨酸磷酸化p145之间的相互作用。与S148A一样，R171N突变并没有消除Numb PTB结构域和Nak C末端之间的相互作用（图。A、 车道5）。此外，在双杂交试验中，这两个突变体在与13-1克隆编码的Nak C末端片段的相互作用中与野生型Numb没有区别（图。B、 第2、4和6行）。综上所述，这些观察结果表明Nak与Numb PTB域的相互作用方式不同于涉及Shc PTB域和NPXY基序的相互作用。
预测破坏与NPXpY基序相互作用的PTB域突变数量不会影响与Nak的相互作用。（A） 突变R171N（在171位用天冬酰胺取代精氨酸）略微减少了Numb-PTB和GST-Nak之间的相互作用（1385-1490）（中间三条通道）。突变S148A（用位置148处的丙氨酸取代丝氨酸）根本不影响相互作用（最后三个通道）。前三个泳道是野生型对照，如图所示。B.（B）Numb-PTB（野生型和两个突变体）和Nak（1385-1490）之间相互作用的双杂交分析。两个突变体R171N和S148A产生的LacZ活性与野生型对照相似。
Nak中Numb-binding序列的鉴定。
Nak的C末端片段足以与Numb相互作用，从双杂交筛选中分离出13-1克隆（Nak的aa 1088-1490）和7-2克隆（Nac的aa 1193-1490）即可表明这一点。两个C末端片段均与Numb的PTB结构域相互作用（图。A、 第2行和第3行）和整个Numb蛋白（图。A和数据未显示）。13-1克隆的一个大的内部缺失使得C末端66个残基与其N末端26个残基（aa 1088到1113和1425到1490）结合在一起，并没有消除与Numb PTB结构域的相互作用（图。A、 第4行）。另一方面，删除了大多数C端子66 aa（图。A、 第5行）完全消除了交互作用。这些数据表明，Nak的C末端66 aa负责与Numb PTB域的大多数交互作用。
为了进一步确定Nak的Numb-binding区域，我们测试了Nak C末端的一系列小片段在双杂交系统和体外结合分析中与Numb-PTB结构域的相互作用（图。B） ●●●●。11 aa的肽（Nak的aa 1439至1449，c1.5CN）足以与Numb的PTB结构域相互作用。Numb PTB结构域还识别出其他三种Nak结构体，它们包含这11个aa（c1、c1.5、c1.5C和c1.5CN），但不包含没有这个序列的Nak片段（c2、c1.5N和c1.5CC）（图。B和C）。c1.5CN的11 aa序列如图所示。D、 不包含任何酪氨酸残基，尽管可以想象该肽中的两个丝氨酸残基可能被磷酸化。
Nak与Numb的PTB域相互作用的特异性。
为了检测Nak与不同蛋白质的PTB结构域相互作用的能力，我们寻找了Nak与Numb哺乳动物同源物以及小鼠和苍蝇蛋白质中Shc的PTB区域的相互作用。苍蝇和哺乳动物Numb蛋白的PTB结构域显示出约70-75%的氨基酸同源性(54). mNumb和rNbl的PTB域与13-1克隆（Nak的aa 1088至1490）的相互作用与dNumb PTB域一样强（图。A、 线1至3），表明Numb和Nak之间的相互作用在哺乳动物中也可能是保守的。相反，在双杂交试验中，dShc和mShc的PTB结构域没有显示出与该Nak片段的任何相互作用（图。A、 在体外结合试验中，我们也没有观察到dShc和mShc的PTB结构域与Nak的c1片段的结合（图。B、 车道8和9）。这些结果表明Nak与Numb的PTB结构域特异性相互作用。GST-c1与dNumb-PTB结构域结合的离解常数估计为～1μM（见材料和方法）。
Nak在体内与Numb相互作用。
为了确定Nak和Numb之间的体内相互作用，我们创造了表达Myc-tagged Nak蛋白的转基因苍蝇（见材料和方法）。从含有或不含Myc-Nak的菌株中制备胚胎提取物。使用抗c-Myc抗体，Myc-Nak被检测为200和180-kDa蛋白的双重蛋白（图。，通道2），类似于体外表达的Nak蛋白的大小（数据未显示），但不在对照通道1中。用抗c-Myc抗体进行免疫沉淀。这两种提取物含有相似数量的Numb蛋白（图。，泳道3和4）。Numb蛋白与Myc-Nak共沉淀，用抗Numb抗体检测（图。，通道6），但不是来自从不表达Myc-Nak的菌株制备的胚胎提取物（图。，通道5），表明Numb和Nak之间存在体内相互作用。
Western blot显示Numb和Nak在胚胎提取物中共同免疫沉淀。通道1、3和5是从粗糙的GAL4菌株；车道2、4和6是从粗糙的GAL4和UAS-myc-nak公司菌株。在用抗c-Myc抗体免疫沉淀后，用抗c-Myc抗体探测通道1和2，用抗Numb抗体探测通道5和6。控制通道3和4是免疫沉淀前的胚胎提取物，并用抗Numb抗体进行探测。
Nak过度表达导致的细胞命运转变与Numb过度表达导致细胞命运转变相反。
通过对三号星幼虫唾液腺多烯染色体进行原位杂交，我们绘制了无基因定位于第二条染色体左臂的细胞学位置37B4-7。最小的染色体缺陷，直径（2L）TW3（36F7-37A1；37B2-37B7），删除位于37A和37B区域的许多基因，包括无.我们发现纯合子直径（2L）TW3胚胎是非常杂乱无章的，因此我们无法评估纳克功能会导致感觉器官细胞命运的改变。分析合子突变胚胎的另一个令人困惑的问题是，母体中的无早期胚胎中的基因活性。因此，我们无法通过分析纯合子来推断功能缺失表型直径（2L）TW3胚胎。因此，我们转向了功能增益实验。
我们使用GAL4-UAS系统(8)表达Nak蛋白并在体内测试其功能。这个无人机导航苍蝇被交叉到粗糙的GAL4增强器陷阱线(17,29)导致Nak蛋白在神经前体细胞中表达。Nak在感觉器官发育过程中的过度表达导致了一些表型，提示感觉器官谱系内的细胞命运发生了改变。在野生型胚胎中，五个脉络膜神经元和五个鞘细胞排列在外侧5区（lch5[图。A、 D、G和J]）。此外，还有一个脊索器官和三个其他感觉器官（图。J） 在同一地区。当Nak过度表达时，我们观察到脊索器官谱系中从神经元到鞘细胞的细胞命运转变（图。B、 E和F），如鞘细胞数量增加和神经元数量减少所示。这与Numb蛋白的过度表达相反，Numb蛋白质增加了神经元的数量，减少了同一谱系中鞘细胞的数量（图。C、 F和I）。
Nak或Numb的过度表达导致胚胎外侧脉络膜器官中神经元和鞘细胞之间发生相反的细胞命运转换。（A、D和E）来自野生型胚胎；（B、E和H）来自Nak过度表达的胚胎；（C、F和I）来自Numb过度表达的胚胎。（A至C）用抗体22C10染色神经元；用抗Prospero抗体（D至F）染色鞘细胞；（G至I）神经元和鞘细胞染色模式重叠；（J） lch5脊索器官及其邻近感觉器官的示意图；（K） lch5谱系(9)，实心箭头指示因Nak过度表达而导致的细胞命运转化方向，下方的空箭头指示因Numb过度表达而引起的转化方向。n、 神经元；sh，鞘细胞；帽，帽细胞；ect，外胚层细胞；lig，韧带细胞；chIII，第三脉络膜前体细胞。
与胚胎表型类似，Nak在成人感觉器官中的过度表达导致苍蝇不同部位（包括头部、窝和翼缘）鬃毛中的细胞命运发生改变。转基因果蝇的变异鬃毛有时含有两根头发和两个毛槽，而不是正常的头发和毛槽（下面有一个神经元和鞘细胞）。B和C，箭头），表示SOP单元对称地分为两个A单元（即B到A单元的转换[图。一] ），而不是一个A和一个B单元。在某些情况下，感觉刷毛包含两个插座，但没有毛发（图。D、 实心箭头），表示SOP不对称分裂产生A和B细胞，而A细胞对称分裂产生两个插座，但没有毛发（即头发到插座的转换[图。一] ）。其他表型以四个插座为特征（图。D、 空箭头）或一根头发和三个插座（图。C、 箭头所示），表明SOP细胞对称分裂，其生成的两个A细胞中至少有一个也对称分裂。除了检查外部感觉结构外，我们还使用神经元特异性抗体进行了免疫细胞化学研究，发现这些突变体鬃毛下缺少神经元（数据未显示）。神经元的缺失可能是由于SOP分裂期间B细胞向a细胞的转化，也可能是由于B细胞分裂期间神经细胞向鞘细胞的转化。Nak过度表达引起的所有细胞命运转变与Numb过度表达导致的细胞命运转变相反，Numb的过度表达导致了双毛（袜子到头发的细胞转变[图。E和F]）和秃顶（没有头发和插座；A到B细胞转换[图。E] ）。因此，在感觉器官发育过程中，Nak的过度表达和Numb的过度表达会导致所检测的感觉器官谱系的每个细胞分裂中发生相反的细胞命运转变（图。K和I）。
的对抗作用无转基因与内源性麻木的基因。
然后我们研究了无和麻木的通过检查麻木的Nak过度表达表型的拷贝数。Nak过度表达引起的表型通过减少麻木的基因从二到一（表; 比较第1行和第2行）。虽然野生型苍蝇的背中心体和盾片位置存在八种大毛类，但Nak的过度表达导致31.7%的大毛类表现出表明细胞命运转变的表型，当转基因苍蝇含有野生型的两个拷贝时麻木的基因。在Nak过表达但只有一个野生型拷贝的转基因果蝇中，具有细胞命运转化指示的突变大毛鼠的比例增加到67.1%麻木的基因(麻木的1/+); 2/4插座表型（见表，脚注b至d，用于表型的定义）从15.0%增加到30.4%，1-头发-3-绒毛和2-头发-2-绒毛表型从16.7%增加到36.7%。在没有无转基因麻木的1/+苍蝇没有鬃毛表型。因此无通过减少转基因的基因剂量，可以促进感觉器官的发育麻木的.
表1
不同剂量阿司匹林对外周感觉器官表型的影响无和麻木的一
| 基因型(n个) | 温度（°C） | %显示表型的猪鬃
|
|---|
| 野生型 | 2/4插座b条（没有头发） | 1根头发–3个插座c（c）/2根头发–2个插座 | 其他d日 |
|---|
| Sca-GAL4,无人机导航(30) | 30 | 62.5 | 15 | 16.7 | 5.8 |
| Sca-GAL4,无人机nak;麻木的1/+ (30) | 30 | 25 | 30.4 | 36.7 | 7.9 |
| 109至68,UAS编号(33) | 25 | 6.4 | | | 93.6 |
| 109-68,UAS编号;无人机导航(42) | 25 | 44.3 | | | 55.7 |
| 109至68,UAS编号/TW3(32) | 25 | 0.5 | | | 99.5 |
不仅减少了麻木的基因增强了由Nak过度表达引起的细胞命运转化表型，Numb的过度表达以及Nak的过度表达抑制了大多数鬃毛表型，这是由于Numb或Nak单独的过度表达所致，包括2-socket（Nak过度表现的表型）、2-hair（Numb过度表达的表型）（图。G） 以及Nak过度表达导致的2发-2窝或1发-3窝表型。Numb过度表达引起的大毛类秃顶表型也显著降低；在过度表达Nak和Numb的果蝇中，44.3%的刚毛（或平均每只果蝇3.6个刚毛）正常，而仅在过度表达Numb果蝇中只有6.4%（或每只果树0.5个刚毛。E和G；表，第3行和第4行）。同样，在表达Numb和Nak的苍蝇中，小白鼠的大多数秃顶表型也受到抑制（图。E和G）。因此，Nak作用引起的相反细胞命运转化的表型对Numb蛋白水平的增加和减少都敏感。
为了进一步测试麻木的和无，我们使用了直径（2L）TW3缺陷，删除无以及其他几个基因，并测试Numb的过表达表型是否对无的确，杂合子直径（2L）TW3过表达Numb的胚胎表现出增强的Numb过表达表型（表; 比较第3行和第5行）。这一结果表明，Numb过表达表型对缺失区域中特定基因的基因剂量敏感Df（2L）TW3。无很可能是负责这种遗传相互作用的基因。
讨论
在本研究中，我们使用酵母双杂交系统分离出一种新的Numb-interacting蛋白，该蛋白包括N端的假定丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和C端的Numb-binding区域。Numb和Nak之间的相互作用需要Numb的PTB结构域和Nak的11-aa肽；这种相互作用是Numb-PTB结构域特有的，可能代表一种独立于酪氨酸磷酸化的新型相互作用。Nak在转基因果蝇中的过度表达会以与Numb的作用相反的方式影响不对称细胞分裂。下文讨论了Nak与Numb PTB结构域结合的特征以及Nak在体内的可能功能。
Nak绑定到dNumb、mNumb和rNbl的PTB域，但不绑定到dShc和mShc的PTB-域。
一些观察结果表明Nak与Numb的PTB结构域之间存在一种新的相互作用。首先，与Shc家族或IRS家族中涉及蛋白PTB结构域的相互作用不同(22,27,33)，Nak与Numb的PTB域的相互作用不涉及NPXpY基序（图。D） 。事实上，Nak的11-aa肽中没有足以与Numb-PTB结构域结合的酪氨酸残基。其次，Nak结合不受Numb-PTB结构域突变的影响，Numb-PTB-结构域突变对应于已知破坏Shc与酪氨酸磷酸化p145相互作用的Shc-PTB结构域突变(55)（图。). 此外，Nak相互作用对Numb的PTB域是特定的；无法检测到与Shc PTB域的交互（图。).
Nak需要一个11 aa的短肽与Numb PTB结构域结合，这表明肽-表面结合，类似于SH2结构域与酪氨酸磷酸化肽、PDZ结构域与含有Ser/Thr-X-Val基序的肽之间的相互作用，以及Shc或IRS家族的PTB结构域和包含NPXpY基序的肽（有关综述，请参阅参考文献24). 在另一个Numb相互作用蛋白的筛选中，我们发现果蝇属表皮细胞表面受体编码在秒时搁浅(萨斯) (44)绑定Numb PTB域。Sas细胞内结构域的37 aa包含NPXY基序，Asn或Tyr残基的点突变在双杂交分析中消除了Sas和Numb之间的相互作用(第11页). 这一结果表明Numb-PTB结构域能够与NPXY基序结合。此外，Numb的哺乳动物同源物被证明能结合酪氨酸磷酸化蛋白(51)尽管调节特定相互作用的基序没有定义。dNumb-PTB结构域与GPpY基序的结合进一步表明了PTB结构域结合特异性的多功能性(38)和Shc-PTB结构域到NPLH基序(11). 此外，两种神经元蛋白X11和FE65的PTB结构域能够与淀粉样前体蛋白细胞质结构域的YENPTY基序结合(6). 即使该序列包含NPXY基序，该结合也不依赖于酪氨酸磷酸化。PTB结构域与各种基序的结合表面是否彼此不同，PTB结构区是否可以利用多个结合区域同时与不同蛋白质相互作用，或者这些结合事件是相互排斥的，还有待确定。
Nak在不对称细胞分裂中的可能作用。
虽然Nak和Numb之间的特定物理相互作用表明Nak可能是Numb途径的一部分，在不对称分裂期间指定子细胞命运，但有必要通过检测细胞的功能丧失表型和功能获得表型来测试这种可能性无基因。无功能丧失突变纳克基因目前可用。然而，值得注意的是，许多已知参与不对称分裂Numb途径的基因表现出过度表达表型，这些表型与基因功能丧失引起的细胞命运转变相反。因此三角洲,槽口,电车轨道,无毛镇静剂，或分裂增强剂导致B细胞转化为A细胞，毛细胞转化为窝细胞，神经元转化为鞘细胞(18,26,40,45,48)与它们各自的功能丧失表型相反。这些基因过度表达导致的表型与麻木的null突变表型，而Numb的过度表达导致相反的细胞命运转变(42). 超表达表型无与槽口,电车轨道和其他下游基因麻木的因此高度暗示了无在不对称分割中。
Myc-Nak与Numb蛋白的体内相互作用也表明Nak在不对称细胞分裂途径中的功能。除了Numb和Myc-Nak的免疫共沉淀外，我们还观察到，外源性表达的Myc-Nak定位于Numb与Notch分布的皮层膜（数据未显示），这表明Nak可以定位于参与不对称细胞分裂的位置。由于Myc-Nak的过度表达，很难分析细胞分裂过程中Myc-Nak的分离。Nak在不对称细胞分裂过程中是否不对称定位，有待于适用于免疫细胞化学的抗体的可用性。
Nak在非对称分裂中的潜在参与果蝇属让人联想到第1部分胚胎早期发育过程中不对称分裂的基因秀丽线虫Par-1还包含一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和一个结合其他蛋白质的C末端区域；Nak的C末端与Numb结合，而Par-1的C末端结合非肌肉肌球蛋白(20,21). 事先，Numb-binding蛋白可能参与不对称分裂过程中Numb的不对称定位，或执行不对称分离Numb在指定子细胞命运中的作用。Nak似乎不太可能参与Numb的不对称本地化，原因如下。首先，Nak过表达表型可以被Numb过表达所抑制。如果Nak的过度表达消除了非对称Numb定位，则不可能恢复适当的不对称分裂。其次，Nak与PTB结构域结合，但不与Numb蛋白的其余部分结合。PTB结构域对Numb在分裂神经前体细胞中的不对称定位不是必需的，但对于Numb抑制Notch信号的能力是必需的(17). 第三，mNumb和小鼠Numblike（mNbl；rNbl的同源物）都含有PTB结构域，其在氨基酸水平上与dNumb的PTB结构域70%至75%相同，并且当在果蝇属mNumb和mNbl可以改变感觉器官谱系中的细胞命运。但只有mNumb，而不是mNbl，在转基因果蝇中不对称定位(54). 因此，Nak似乎不太可能在非对称Numb定位中发挥作用。
迄今为止对Nak活性的观察与Nak介导或调节不对称分布Numb作用的可能性一致。例如，Nak可能磷酸化Numb并负调节Numb功能。或者，Nak和Numb的相互作用可能会阻止Notch与Numb结合(19,53)从而解除了Numb对Notch的抑制。也可以想象，由于Numb与Notch和Nak的物理相互作用，Nak可能被招募到Notch附近，因此它可以磷酸化Notch或其下游效应器，从而抑制Notch信号。这些和其他可能的情况可以通过未来的基因和生物化学研究进行测试。
