黄病毒E糖蛋白是诱导保护性免疫的主要抗原,对膜融合至关重要,并介导与细胞受体的结合。因此,该蛋白直接影响宿主范围、细胞向性以及这些病毒的部分毒力(17,18). 蜱传脑炎(TBE)病毒E-糖蛋白同源二聚体外结构域的晶体结构最近得到了高分辨率的解析(16). 多种证据表明,这种E-糖蛋白结构在黄病毒科(16). 这种蛋白质包含三个结构域。中心结构域I(DI)主要包含类型特异的非中和表位,理论上是参与低氢触发构象变化的分子枢纽区域(19). 二聚体结构域II(DII)在同型二聚体中与自身有重要联系,参与病毒介导的膜融合,并包含许多引发中和和非中和单克隆抗体(MAb)的交叉反应表位(16,19). 结构域III(DIII)的特征是免疫球蛋白样结构,包含病毒表面最远端的投射环。它包含多个类型和亚型特异性表位,仅诱导病毒中和单克隆抗体,并被假设包含宿主细胞结合抗受体(16,18,19). 作为我们正在进行的阐明登革热(DEN)病毒E糖蛋白结构-功能关系的研究的一部分,我们评估了一组特征明确的E糖蛋白特异性单克隆抗体阻断病毒对Vero细胞吸附的能力。这些结果首次提供了E糖蛋白DIII编码受体结合基序的直接证据。
1964年从泰国曼谷一名登革出血热患者的血清中分离出登革2型(DEN-2)病毒株16681。病毒种子生长于白纹伊蚊C6/36蚊子细胞,含1.5×107PFU/ml,通过Vero细胞上的菌斑滴定测定(19). 所有分析均使用同一种子的等分样品。本研究中使用的所有MAb已在前面描述过(19). 这些单克隆抗体所定义的表位的化学和生物学特性以及空间排列和位置已经预先确定(19).
为了评估抗体-病毒相互作用对病毒吸附的影响,首先在六孔培养皿中生长的Vero细胞单层中建立了病毒附着曲线,该细胞单层含有含有青霉素、链霉素和5%胎牛血清的最低必需培养基(20). 我们选择Vero细胞是因为它们对DEN病毒感染具有高度的耐受性,并且不包含Fc受体(2). 因此,它们是研究DEN病毒在哺乳动物细胞上吸附的理想工具,而不会受到潜在病毒-MAb-Fc受体相互作用的混淆影响。此外,这些细胞被用于之前的一项研究,这项研究表明阻断病毒附着是中和人类登革病毒感染的重要机制——免疫血清(7). 附着曲线(50至100 PFU/次)表明,约90%的病毒粒子在4°C下1小时内吸附到细胞上(数据未显示)。
为了区分通过阻断病毒吸附中和病毒的单克隆抗体和中和病毒后吸附的单克隆疫苗,我们进行了吸附前和吸附后分析(11). 对于预吸附分析,0.5 ml含有2.5×10的病毒稀释液2将PFU/ml(50至100 PFU/孔,最终病毒浓度)与0.5 ml 10倍MAb稀释液混合,并在4°C下培养1 h。然后将病毒与MAb的混合物添加到细胞中(80%至90%的融合液),并在4°C的温度下继续培养一小时,该温度仅允许病毒吸附。阴性对照组接受0.5 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替MAb。用2 ml PBS在4°C下清洗细胞板三次,从细胞中吸取液体,并用4 ml 1%琼脂糖-培养基混合物覆盖细胞(12). 在37°C下孵育5天后,再次用1%琼脂糖(含有0.01%中性红的培养基)覆盖平板,并在接下来的30到50小时内对斑块进行计数。在该试验中,在病毒吸附到细胞之前、期间和之后都存在MAbs。因此,预吸附试验测量了感染周期早期任何机制的潜在中和作用,包括直接阻断吸附。
对于吸附后分析,将前吸附分析中的0.5 ml病毒种子稀释液与0.5 ml PBS混合并直接添加到细胞中,然后在4°C下培养1 h。未吸附的病毒在4°C下用PBS清洗三次后被清除。然后将10倍MAb稀释液直接添加到含有吸附病毒的洗涤细胞中,然后在4°C下培养1 h。在孵育过程中,阴性对照在4°C下接受0.5 ml PBS,而不是MAb稀释液。在MAb结合后,用PBS在4°C下清洗细胞三次,用琼脂糖覆盖,然后培养,PFU按预吸附分析计算。在本试验中,MAb只有在病毒吸附到细胞后才存在。因此,单克隆抗体阻断吸附的能力表现为其在吸附后和吸附前分析中中和病毒感染性的能力不同。该值使用以下公式计算:%blocking=100×[(吸附后分析中MAb处理后的PFU/吸附后分析的阴性对照处理时的PFU)−(预吸附分析中MAb处理后的PFU/吸附前分析中阴性对照处理前的PFU 预吸附分析)]
代表性阻断MAb 9D12的吸附前和吸附后中和活性的例子如图所示。.
在吸附前和吸附后分析中,DIII MAb 9D12对吸附的代表性剂量依赖性阻断。
在比较单克隆抗体阻断吸附的能力时,我们发现结构域内表位的内部一致模式和结构域之间的不同阻断模式(表). DI-、DII-和DIII特异性单克隆抗体以及适当的阳性和阴性对照抗体的代表性阻断曲线如图所示。所有识别DIII表位的单克隆抗体都强烈阻断了病毒吸附(36-49%阻断)(表; 图。C) ●●●●。所有DIII特异性单克隆抗体的最大吸附量均大于或等于多克隆小鼠抗DEN-2病毒超免疫腹水(HIAF)的最大阻断能力(34%)(表; 图。C和E)。此外,在各种MAb稀释液中,所有DIII特异性MAb都显著阻断了吸附(即阻断百分比减去95%置信区间[CI]大于零)(表). 图中所示的明显低阻塞水平。C和E表明在高MAb浓度下可能存在前区。然而,这种现象实际上是由于高水平的病毒中和作用掩盖了吸附后和吸附前分析之间的差异,而不是由于过量的MAb(图。). DII-MAbs分为两种不同的吸附阻塞模式(表; 图。B和D)。中和病毒的DII-特异性单克隆抗体阻断了吸附,但强度不及(12%至32%),也不如针对DIII的单克隆抗体显著。DII-特异性MAb的阻断与DEN-1特异性阴性对照MAb 1F1的统计学上无意义的阻断(10%)更为相似(表; 图。B和F)。此外,DII-特异性中和单克隆抗体仅在相对较高的浓度下阻止吸附(表). 在高MAb浓度下,两种非中和DII-特异性MAb实际上增强了病毒吸附(表; 图。D) ●●●●。之前已经证明识别天然病毒的单一非中和DI-特异性单克隆抗体强烈阻断了吸附(46%),但仅在这种最高单克隆抗体的1:100稀释度下(表; 图。A) ●●●●。我们针对DI表位C2、C3和C4的单克隆抗体没有用于此分析,因为它们识别本地病毒的能力较差(表). 因此,它们可能无法阻止病毒吸附。
表1
表位(MAb) | E-糖蛋白结构域 | 90%PRNT一 | Fusion阻塞 | ELISA结果b条
| 最大阻塞百分比c(c) | 日志10MAb稀释显示堵塞(f) |
---|
绑定 | 捕获 |
---|
A1(6B6C-1) | 二 | ± | + | 5.2 | ≥5.3 | 18 (11) | 1 |
A1(4G2) | 二 | + | ND(无损检测)d日 | 5.3 | ≥5.3 | 32(9) | 1–2 |
A2(4E5) | 二 | + | + | 4.2 | 2.6 | 12 (12) | 5 |
A3(1A5D-1) | 二 | 负极 | 负极 | 5.3 | 3.5 | — | 纳e(电子) |
A5(1B7) | 二 | + | + | 5.3 | ≥5.3 | 23 (6) | 1–3 |
空调(10A1D-2) | 一/二 | 负极 | 负极 | 4.4 | 2.9 | — | 不适用 |
C1(1B4C-2) | 我 | 负极 | 负极 | 6.2 | ≥5.3 | 46 (15) | 2, 6 |
C2(4A5C-8) | 我 | 负极 | 负极 | 3.2 | 2 | ND(无损检测) | ND(无损检测) |
C3(2B3A-1) | 我 | 负极 | 负极 | 5.3 | 2 | ND(无损检测) | ND(无损检测) |
C4(9A4D-1) | 我 | 负极 | 负极 | 4.4 | 2.9 | ND(无损检测) | ND(无损检测) |
地下一层(3H5) | 三 | + | ND(无损检测) | 5.3 | ≥5.3 | 36 (9) | 3–5 |
B2(9A3D-8) | 三 | + | 负极 | 5.8 | ≥5.3 | 42 (6) | 2–3 |
B3(10A4D-2) | 三 | + | 负极 | 5.3 | ≥5.3 | 44(7) | 2–5 |
B4(1A1D-2) | 三 | + | 负极 | 5.3 | ≥5.3 | 49 (9) | 2–5 |
B4(9D12) | 三 | + | 负极 | ND(无损检测) | ND(无损检测) | 41 (7) | 1–5 |
DEN-2病毒HIAF | 纳 | + | + | + | + | 34 (18) | 1–5 |
DEN-1病毒(1F1) | 纳 | 负极 | 负极 | ≤1.0 | ≤1.0 | 10 (12) | 无 |
代表性单克隆抗体对三个不同E-糖蛋白结构域的吸附阻断率(±95%CI)的比较。(A) DI MAb 1B4C-2;(B) DII MAb 4E5;(C) DIII MAb 9D12;(D) DII单克隆抗体1A5D-1;(E) DEN-2病毒多克隆小鼠HIAF;(F) DEN-1特异性阴性对照MAb 1F1。图D显示了病毒吸附的增强。
这些结果表明,大多数抗DEN病毒单克隆抗体通过破坏病毒与哺乳动物细胞受体结合的能力,至少在一定程度上可以中和病毒。与中和作用一样,单克隆抗体阻断吸附的能力也与其识别和粘附天然病毒的能力相关,如捕获病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)所测(表). 此外,通过使用一组定义明确的单克隆抗体,我们暗示DIII是E糖蛋白最可能与Vero细胞上的细胞膜受体相互作用的区域。与多克隆抗DEN-2病毒HIAF相比,所有DIII特异性单克隆抗体在多个单克隆抗体稀释液中观察到的持续较高的阻断水平以及其更大的吸附阻断能力支持了这一结论。这些结果与其他结果一致,表明阻断吸附是MAb中和黄病毒的常见机制(7),鼻病毒(5,23)和流感病毒(25). 我们之前发现,大多数抗委内瑞拉马脑脊髓炎病毒单克隆抗体也阻断了病毒对Vero细胞的吸附,其中一种单克隆抗体增强了病毒的吸附(21).
我们观察到MAb对吸附的阻断程度不超过50%。然而,我们观察到MAbs的最大阻断量等于或大于用高滴度抗DEN-2病毒多克隆抗体观察到的阻断量,这表明这些结果代表了实际的最大阻断活性(表; 图。E) ●●●●。使用同位素标记的病毒量化单克隆抗体阻断,显示出比我们观察到的更高的阻断活性(7,21). 然而,与我们的结果一致,Hung等人也使用类似于我们的分析,观察到MAb对DEN病毒吸附的最大阻断作用在20%到60%的范围内(11). 同位素结合分析的一个主要局限性是,它们只测量病毒的附着,而不是最终导致生产性感染的病毒吸附。
一些DI-和DII-反应性单克隆抗体能够阻止病毒对Vero细胞的吸附,但不如针对DIII的单克隆抗体强。此外,这些单克隆抗体仅在高浓度抗体时阻止吸附。虽然DI和DII本身并不被认为是黄病毒抗受体的一部分,但之前使用竞争性抗体结合分析对这些表位的空间排列进行的分析表明,其中两个表位与阻断单克隆抗体(A1和C1)反应并可在病毒表面接触,与DIII表位接近(19)(图。). DI-和DII-反应性单克隆抗体阻断病毒吸附能力的另一种解释可能是MAb结合后DIII内诱导远端构象变化(8). 为了支持MAb结合后诱导的构象变化,我们发现两个非中和DII-反应性MAb增强了病毒吸附。Heinz等人(8)证明对于TBE病毒,一个MAb的结合能够诱导E糖蛋白的构象变化,从而增强第二个MAb反应物与远端表位的结合。DEN-2病毒也观察到类似但特征不明显的单克隆抗体诱导的二次单克隆抗体亲和力增强(9). 最后,单克隆抗体可能干扰DII和DIII之间正常的同二聚体接触,从而间接干扰病毒吸附(16). 这可能解释了MAb 1B7介导的对表位A5特异的阻断作用,其在空间上与DIII并不接近(图。). 这些假设表明,DII通过直接阻断病毒吸附以外的机制介导中和作用。值得注意的是,针对DII表位A1、A2和A5的单克隆抗体阻断了病毒介导的细胞膜融合(1,19)以前被证明是黄病毒中和的重要机制(6).
表中列出的DEN-2病毒E糖蛋白表位的生物活性和空间排列概述这些表位诱导的单克隆抗体的生物学活性为血凝抑制(HI)和病毒中和(N)。阻断病毒吸附的最大值为:黑色,大于40%;深灰色,30-40%;浅灰色,20%至30%;白色,小于20%(A2)或未测试(A4、C2、C3和C4);交叉阴影,绑定增强。重叠的圆圈表示空间上接近的表位。表位命名:A,DII;B、 DIII;C、 DI。这些表位的HA和N活性以前曾报道过(19).
DIII内的表位诱导最强的MAb病毒吸附阻滞剂的发现与之前的研究一致,这些研究表明DIII是黄病毒抗受体的位置。这些研究包括鉴定TBE病毒E糖蛋白中DIII的免疫球蛋白样结构,该糖蛋白是许多细胞粘附蛋白共同的结构基序(16); 改变病毒进入、细胞嗜性和DIII毒力的突变的定位(10,13–16,24); DIII中假定GAG结合基序作为硫酸乙酰肝素受体的鉴定(4); Langat病毒可溶性DIII作为病毒感染性拮抗剂的能力(三); 以及使用单克隆抗体识别DIII中定义的表位,直接干扰病毒吸附和进入过程(7,11,22). 我们现在正在使用DEN-2病毒株16681的感染性cDNA克隆来产生DIII的突变。通过这种方法,我们希望能够更准确地识别与病毒吸附和MAb结合有关的DIII结构。