简介
利什曼病，由利什曼原虫属，是一种在世界热带和亚热带地区遇到的感染。利什曼原虫寄生虫是由不同种类的白蛉媒介（属静脉瘤或Lutzomya属)，具体取决于地区。旧大陆物种利什曼原虫，例如多诺瓦尼乳杆菌和L.主要导致从南欧到非洲、中东和整个南亚的病理变化，而新世界物种（例如。，墨西哥乳杆菌,亚马逊乳杆菌、和查加西乳杆菌)分布于南美洲和中美洲，北至美国南部各州。临床表现差异很大，取决于利什曼原虫物种。大多数死亡原因是内脏型利什曼病，由多诺瓦尼乳杆菌或查加西乳杆菌; 孟加拉国、巴西、印度、尼泊尔和苏丹报告了90%的年度病例。最常见的表现是皮肤损伤；90%的皮肤利什曼病新病例发生在阿富汗、巴西、伊朗、秘鲁、沙特阿拉伯和叙利亚，其主要原因是L.主要和墨西哥乳杆菌亚属(64,164). Viannia亚属仅见于美洲，是皮肤粘膜利什曼病的临床类型，其特征是面部畸形。据估计，2000年有1200多万人感染了利什曼原虫88个国家的物种，估计有150万至200万临床病例(164).
两个不同的发展阶段利什曼原虫已被识别。在白蛉体内发现前鞭毛虫，具有细长的形状和长的鞭毛。前鞭毛虫可进一步分类为在白蛉肠道中繁殖的前循环前鞭毛虫类，或感染性的后循环前鞭毛虫类，它们存在于口腔部位和前肠中，不会分裂。这些细胞分化为圆形或椭圆形无鞭毛无鞭毛体，一旦进入宿主体内，就没有鞭毛。
在其哺乳动物宿主中利什曼原虫是一种专性细胞内病原体，感染单核细胞/巨噬细胞系的造血细胞，通过吞噬作用进入。由于这种细胞类型专门用于破坏入侵病原体和启动宿主免疫反应，利什曼原虫不得不进化出一系列复杂的机制来破坏正常的巨噬细胞功能。这包括阻止致命抗菌剂（如一氧化氮（NO））的激活，以及抑制许多细胞因子诱导的巨噬细胞功能，这些功能是形成有效免疫反应所必需的。这使寄生虫能够逃避先天免疫反应，并在受感染巨噬细胞的吞噬小体内分裂，从而在宿主内传播和传播疾病。在这篇综述中，我们将重点放在以下分子机制上：利什曼原虫可以通过改变巨噬细胞的信号转导机制来破坏宿主的监视，从而调节有利于自身的巨噬细胞环境。应该注意的是，研究通常只使用一种或有时两种利什曼原虫这给人的印象是，所揭示的机制适用于所有物种。然而，鉴于利什曼原虫spp.，宿主细胞操纵机制不可避免地存在显著差异。这些差异可能是本审查中描述的一些冲突结果的原因；我们现在的理解是，更多直接比较不同物种对巨噬细胞影响的研究将非常有用。
寄生虫表面和分泌分子
除了通过形态和位置区分外利什曼原虫寄生虫可以通过其表面分子组成来区分。原环前鞭毛虫被7纳米厚的糖萼覆盖。异环前鞭毛虫的糖萼更厚，至少17纳米，但无鞭毛虫几乎完全没有糖萼(123). 该护套由糖蛋白和其他糖基化物种组成，通过独特的糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接固定在表面膜上（参考文献中详细综述45). 前鞭毛虫的主要表面分子是脂磷聚糖（LPG）。其结构不同于利什曼原虫物种，但它主要由由双糖和磷酸盐组成的重复单元组成，通过GPI锚连接到膜上。利什曼原虫物种因聚糖侧链的存在以及其组成和在液化石油气核心结构上的位置而显著不同。液化石油气L.主要例如，是高度分支的，而多诺瓦尼乳杆菌不是(102). 此外，LPG的结构在原环前鞭毛虫和亚环前鞭毛虫之间有所不同，后者的结构明显更长，无鞭毛虫几乎完全没有LPG(103,123). 如下文所述，使用液化石油气生产中存在缺陷的纯化液化石油气或突变寄生虫菌株进行的研究表明，液化石油气在寄生虫生存和免疫反应调节中发挥着许多重要作用，液化石油气构形和分布的差异对于不同发育阶段的不同特性至关重要利什曼原虫.
另一个重要的表面分子是糖蛋白gp63（前鞭毛体表面蛋白酶）。这是一种锌依赖性金属蛋白酶，具有多种底物，包括酪蛋白、明胶、白蛋白、血红蛋白和纤维蛋白原(104). 虽然gp63的含量约为液化石油气的10倍，但在前鞭毛虫表面仍然存在gp63(100,123). 然而，其较短的长度意味着它基本上埋在液化石油气海洋中。与液化石油气一样，gp63以无鞭毛体形式下调(141). 这种减少的表达可能被无鞭毛体表面缺乏液化石油气所抵消，这意味着gp63不再被掩盖，因此可能在无鞭毛细胞存活和调节宿主反应中发挥重要作用(102,123).
最丰富的前鞭毛体表面分子是糖基肌醇磷脂（GIPL），这是一类GPI连接的糖脂。这些分子的含量是液化石油气的10倍，但它们的小尺寸使它们靠近寄生虫膜，因此尚不清楚它们在与宿主的相互作用中起什么作用(45,101). 与不断脱落的液化石油气不同，GIPL具有较长的半衰期，因此被认为在前鞭毛虫表面起到保护作用(127).
完成L.主要数据库显示了65种半胱氨酸肽酶；其中一些显然在促进寄生虫生存和疾病进展方面发挥了作用，尤其是在墨西哥乳杆菌感染（有关最新综述，请参阅参考109). 至少50%的半胱氨酸肽酶活性位于寄生虫的溶酶体中，因此不太可能在调节巨噬细胞信号传导中发挥直接作用(69). 然而，同样清楚的是，在无鞭毛虫死亡后，由于其异常的细胞内转运途径，大量半胱氨酸肽酶被释放出来(17,69). 如下文所述，这些释放的蛋白酶可以通过直接作用于宿主细胞表面或在吞噬体进入巨噬细胞内质网后调节巨噬细胞活性。
这一列表远未穷尽，很可能其他表面分子在调节宿主免疫反应的特定方面发挥重要作用。特别是，无鞭毛菌表达一些特征较差的β-巯基乙醇活化金属蛋白酶(141)它们甚至能够结合宿主细胞的膜脂(100). 此外，其他分泌分子，如蛋白磷酸多糖和酸性磷酸酶，与寄生虫的生存和致病性直接相关(89). 本综述将讨论其中一些分子在破坏宿主防御反应中的作用。
初始相互作用和吞噬作用
在一只雌性白蛉的血腥过程中进入哺乳动物宿主，利什曼原虫前鞭毛虫必须首先逃避补体介导的溶解，直到被巨噬细胞吞噬。L.主要前环前鞭毛虫不能抵抗补体作用，而专为传播到宿主的亚环形式可以完全避免补体驱动的裂解(128). 补体抗性的这种差异已被证明取决于寄生虫表面的分支LPG。LPG在亚环前鞭毛虫表面上的作用时间较长，似乎可以阻止补体复合物C5b-C9亚基的附着，而补体复合体是用于细胞裂解的。多诺瓦尼乳杆菌然而，前鞭毛虫通过在其表面固定不活跃的C3bi亚基来阻止C5转化酶的形成(128). 据报道，蛋白酶表面糖蛋白gp63具有保护作用亚马逊乳杆菌和L.主要通过将C3b转化为C3bi来阻止细胞裂解，从而有利于寄生虫调理和内化(16). 还提出了一种表面蛋白激酶L.主要可能磷酸化补体系统的成员，从而使级联反应失活(63).
寄生虫表面分子在粘附巨噬细胞的过程中也起着重要作用。体内调理利什曼原虫C3b和C3bi的异环前鞭毛虫允许分别与巨噬细胞补体受体1（CR1）和CR3相互作用。然而，由于C3b通过gp63快速转化为C3bi，CR3似乎是更重要的受体，与CR1的相互作用只是暂时的(73). 通过CR3而不是CR1附着对寄生虫有利，因为它不会在吞噬过程中触发氧化爆发(108). 前鞭毛虫也可以通过甘露糖-岩藻糖受体附着到巨噬细胞上，甘露糖受体与液化石油气的甘露聚糖残基结合(10). LPG还可以与早期炎症产物C反应蛋白（CRP）相互作用，从而通过CRP受体触发吞噬作用(31)而不会导致巨噬细胞激活，这通常是在CRP受体介导的吞噬作用后出现的(12). 此外，gp63和LPG分别与纤维连接蛋白受体和CR4相互作用(15,155)，尽管液化石油气在依恋和内化过程中似乎只起到次要作用（参考文献中进行了回顾38). 最近，一些利什曼原虫在初始阶段起作用的表面分子利什曼原虫-虽然巨噬细胞对这些分子的受体尚不清楚，但巨噬细胞相互作用已被确定。例如，蒋介石和塞夫顿(27)已鉴定出一种ICAM相关分子，ICAM-L，这可能是寄生虫与小鼠巨噬细胞系J774之间相互作用所必需的。最近的一项研究报告称，亚环前鞭毛虫感染性更强的部分原因是其表面磷脂酰丝氨酸升高(157)在阻断针对另一种寄生虫表面分子GIPL的抗体的同时，已经证明可以抑制L.主要(154). 在用特异性抗体进行调理后，Amastigotes也可以以Fc受体依赖的方式内化(57). 所涉及的大量受体表明，寄生-巨噬细胞相互作用之间存在一定程度的冗余，尽管似乎有几种相互作用是内化所必需的(15).
在粘附巨噬细胞后，利什曼原虫前鞭毛虫内化到内体相对良性的环境中，在那里开始分化为无鞭毛虫。与无鞭毛虫不同，前鞭毛虫容易被吞噬体的酸性和水解环境降解。因此，它们必须延缓内体成熟和吞噬体内体融合，这是一个依赖液化石油气的过程(39). 这种迟缓表现为晚期内体标记物（如rab7和LAMP-1）的缺失或延迟到达(142)并且可能与F-肌动蛋白的LPG依赖性积累有关(67). 其机制尚不完全清楚，但已证明其取决于钙的存在(156)和蛋白激酶C（PKC）抑制(66). 此外，液化石油气似乎改变了膜的形状，导致吞噬体和内体之间的空间排斥(107). 吞噬体成熟的延迟提供了一个窗口，在这个窗口中，前鞭毛虫可以分化为更具抗性的无鞭毛虫。这与我们早期的观察一致，即不同品系小鼠的寄生虫存活率和感染性与巨噬细胞吞噬活性相关(120). 有趣的是，虽然液化石油气在摄入的早期阶段对前鞭毛虫的存活很重要，但无鞭毛虫并不表达液化石油气，这表明液化石油气的作用是暂时的，仅限于感染的早期阶段。
使用的另一种生存策略利什曼原虫寄生虫是对分泌到吞噬体内的水解酶和其他破坏性分子的抑制。两个新发现利什曼原虫分子，命名为过氧化物毒素LcPxn1和-2(4)和超氧化物歧化酶(54)亚硝酸盐衍生物和活性氧中间体（ROI）被认为是最重要的杀菌小分子。此外，有证据表明，液化石油气本身可以通过中和液泡ROI提高前鞭毛虫存活率(25). 液化石油气也可能通过其强大的负电荷和半乳糖甘露糖重复单元来抵御溶酶体酶(41). 表面分子gp63的蛋白水解活性在吞噬小体中发现的酸性pH条件下是最佳的，这支持了它以溶酶体酶为目标的说法(143). 然而，其作用值得怀疑，因为六个gp63基因突变的寄生虫仍然能够在巨噬细胞内生存、分化和复制(70).
巨噬细胞功能的抑制
将自身固定在宿主细胞内可以利什曼原虫逃避许多可能针对它的免疫反应。然而，也有必要在蛋白质或基因表达水平上抑制许多巨噬细胞功能，尤其是那些参与免疫监视和巨噬细胞激活的功能。一项对245个巨噬细胞基因的研究表明，37%的巨噬细胞在体外感染无鞭毛虫后被抑制至少两倍(18)尽管大规模的微阵列研究表明，前鞭毛虫诱导和抑制的程度相似(26,136). 然而，这些研究以及我们在体内感染后未发表的观察结果都表明，许多基因的表达减少，在各种免疫、细胞生理和信号传递功能中发挥着重要作用。我们描述了其中一些功能，以及它们是如何受到利什曼原虫，详见下文。
微生物自由基产生
两种类型的杀微生物分子因其对利什曼原虫：否(86)和投资回报率(110). NO对寄生虫清除至关重要，因为缺乏诱导型一氧化氮合酶（iNOS）（也称为NOS2）的小鼠无法控制感染，而这些小鼠产生的巨噬细胞无法清除培养物中的前鞭毛虫(162). 感染的巨噬细胞或与纯化LPG或GIPL孵育的巨噬细胞利什曼原虫表面分子对γ-干扰素（IFN-γ）和/或脂多糖（LPS）失去诱导iNOS或生成NO的能力(126,127). 然而，当同时给予幼稚巨噬细胞时，IFN-γ和LPG似乎可以协同产生NO(126,127). 这表明寄生虫和巨噬细胞之间的接触阻止了巨噬细胞对随后暴露于淋巴细胞产生的IFN-γ的反应。抑制NO生成可能是由于产生白细胞介素-10（IL-10）和/或转化生长因子β（TGF-β）、JAK/STAT途径失活、磷酸酪氨酸磷酸酶激活和/或神经酰胺生成，如下所述。
与NO生成不足的小鼠相比，在敏感性增加的最初阶段，ROI生成不足的鼠最终可以控制感染(111)表明ROI在寄生虫清除中的作用较小。然而，ROI生成也受到以下因素的抑制多诺瓦尼乳杆菌感染(19,117,118). 抑制作用似乎依赖于表面分子LPG和gp63(38,148)并被证明与异常PKC活性有关(118).
抗原呈递
除了抑制宿主巨噬细胞的杀微生物活性外，利什曼原虫抑制宿主细胞向免疫系统其他成分显示寄生虫抗原的能力(134). 这似乎与寄生虫的传染性有关：感染昆虫适应的前环前鞭毛虫培养物的巨噬细胞最初能够呈现寄生虫LACK抗原，但随着寄生虫开始分化，它们失去了这种能力(30). 此外，感染感染性亚环型前鞭毛虫的巨噬细胞几乎不存在LACK抗原，无鞭毛虫感染的细胞也不存在(30).
一些研究表明多诺瓦尼乳杆菌通过抑制主要组织相容性复合体（MHC）II类基因的表达来抑制抗原提呈，包括基础表达和IFN-γ刺激后的表达(35,133,134). 相反，巨噬细胞感染亚马逊乳杆菌已证明表达MHC II类的正常水平(84,124). 在这种情况下，通过干扰抗原加载到MHC II类分子上，可以抑制抗原提呈(50,124)或通过在吞噬体内隔离MHC II类分子和/或抗原(79,85). De Souza Leao和同事证明了第三级抑制，至少在亚马逊乳杆菌当他们观察到无鞭毛菌自身直接内吞MHC II类分子，然后半胱氨酸肽酶依赖性降解(40). 与噬菌体的位置一致利什曼原虫MHC等级II在抵抗力方面似乎比等级I更重要，尽管等级I确实发挥了作用，至少在某些情况下是这样(158). MHC I类表现缺陷的小鼠具有抗感染性L.少校，但MHC II级−/−小鼠易感(68,88).
抗原提呈依赖于通过共刺激分子如B7/CD28和CD40/CD40L进行的细胞通讯。已经证明多诺瓦尼乳杆菌-受感染的巨噬细胞不能在LPS刺激下进一步表达(75)这种失活过程依赖于前列腺素(137). 似乎抑制CD40/CD40L连接是iNOS和巨噬细胞杀菌活性缺失的原因(72,147)以及治疗L.主要感染依赖于积极的CD40/CD40L结扎(23,62). 最近的研究表明，CD40相互作用触发的p38依赖性信号在感染巨噬细胞中发生改变，这可能导致iNOS表达减少(2). 相反，MHC II类基因表达的抑制似乎涉及环状AMP非依赖性机制(83).
细胞因子产生抑制
利什曼原虫通过抑制多种细胞因子的产生，尤其是与炎症反应（IL-1和肿瘤坏死因子α[TNF-α]）或T淋巴细胞活化（IL-12）有关的细胞因子的生成，阻止有效免疫反应的激活。据报道，LPS诱导的IL-1β分泌在多诺瓦尼乳杆菌-受感染的(134,135)和LPG暴露(47)巨噬细胞。LPG似乎通过启动子抑制序列抑制IL-1β转录(60). 相反，IL-1α转录是由L.少校，但这并没有反映在分泌增加上，这表明下游抑制机制抵消了诱导(61). 有趣的是，IL-1α的诱导似乎是Myd88依赖性的，提示Toll样受体的作用。LPS治疗的感染巨噬细胞中TNF-α的生成也受到抑制(36). 最近的研究表明，这与IL-10和PKC抑制有关(8).
的容量利什曼原虫感染巨噬细胞而不诱导促炎细胞因子，然后抑制其对各种激动剂的诱导，这可能代表了一种生存机制，寄生虫可以通过这种机制抑制有害的炎症反应。然而，这些研究主要是在体外进行的。最近在体内进行的研究清楚地表明，促炎性细胞因子（IL-1、IL-6和TNF-α）以及各种趋化因子（一类负责将炎性细胞募集到感染部位的细胞因子）在感染早期被诱导多诺瓦尼乳杆菌和L.主要感染(98). 有趣的是L.主要前鞭毛虫被证明是比前鞭毛虫病更好的促炎事件激活剂多诺瓦尼乳杆菌如炎症细胞的大量短暂募集所示。这可能反映了两种菌株引起的不同病理。此外，这两个物种都招募了异质的宿主炎性细胞群，包括中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞(98). 从宿主防御的角度来看，这尤其令人感兴趣，因为中性粒细胞最近被证明对控制L.主要感染(46,87).
细胞因子IL-12在细胞免疫反应的调节中起着关键作用。它对T淋巴细胞活化和随后的IFN-γ分泌至关重要，从而激活巨噬细胞并产生杀微生物分子。因此，毫不奇怪利什曼原虫已开发出抑制IL-12生成的能力。这已显示为的前鞭毛虫多诺瓦尼乳杆菌和L.主要(24),墨西哥乳杆菌无鞭毛菌(163)和液化石油气的磷酸多糖部分(122)在体外。据报道，IL-12抑制也发生在L.主要-受感染的小鼠(5). 细胞内机制尚不清楚。巨噬细胞补体受体和Fcγ受体，已知与利什曼原虫在吞噬过程中，已显示抑制IL-12(93,152). 此外，Piedrafita等人表明L.主要LPG介导的IL-12抑制与NF-κB转录因子家族无关，尽管IL-12对NF-κB有反应(122). 相反，抑制可能是ERK1/2磷酸化增加所致(44); 然而，该报告存在问题，因为它与感染期间ERK的去磷酸化形成鲜明对比（下文讨论）。最近的一份报告表明墨西哥乳杆菌无鞭毛菌降解NF-κB和抑制IL-12都依赖于半胱氨酸肽酶B的活性(22). 虽然这是完全相关的，但没有理由认为旧大陆物种和新大陆无鞭毛虫的前鞭毛虫采用相同的机制，特别是考虑到物种和发育阶段在半胱氨酸蛋白酶和液化石油气类型和表达方面存在显著差异。
免疫抑制分子的诱导利什曼原虫感染
除了抑制宿主巨噬细胞的功能外，利什曼原虫寄生虫可以诱导各种免疫抑制信号分子的产生和/或分泌，例如花生四烯酸代谢物和细胞因子TGF-β和IL-10。这些直接或间接影响多种不同的细胞类型，从而扭曲正常的免疫反应，有利于寄生虫的生存。
TGF-β的产生是由以下几种因素引起的利什曼原虫体内外物种（参考文献综述13). TGF-β分泌增加与淋巴结iNOS表达迟缓和NK细胞活性降低相关(140,151). 这与TGF-β抑制巨噬细胞杀微生物作用和NK细胞产生IFN-γ的想法一致，尽管NK细胞在利什曼病中的确切作用存在争议(74,80,90,138,139,161). 最近的一项研究表明查加西乳杆菌在受感染的人类巨噬细胞的直接环境中诱导TGF-β的产生，这可能允许局部抑制免疫反应(51). 有趣的是，至少对于查加西乳杆菌增加的产量似乎不是由于基因表达增加，而是由于无鞭毛半胱氨酸蛋白酶裂解前TGF-β以产生活性TGF-(51,145). 巨噬细胞和无鞭毛体表面磷脂酰丝氨酸基序之间的相互作用也被认为触发了这种诱导(49).
IL-10是另一种由利什曼原虫-体外感染巨噬细胞，显然是通过与Fcγ受体的相互作用(153). 其产生可能是抑制巨噬细胞杀微生物活性的原因，包括NO、几种细胞因子（IL-1、IL-12和TNF）的产生以及共刺激分子如B7-1/2的表达（综述于参考文献32). 通过观察组成性表达IL-10的转基因小鼠无法控制IL-10的表达，说明了IL-10在体内的重要性利什曼原虫感染(73). 对于TGF-β，巨噬细胞识别无鞭毛虫表面磷脂酰丝氨酸残基后明显诱导IL-10(49).
前列腺素E2（PGE2）似乎由利什曼原虫-感染巨噬细胞并有利于寄生虫生存和发展(43,98,131,132). 据报道，花生四烯酸代谢物可抑制巨噬细胞增殖并抑制TNF-α、IL-1和活性氧中间体的生成(6). 最近的一项研究报道，PGE2诱导多诺瓦尼乳杆菌-感染的巨噬细胞依赖于PKC激活和环氧合酶-2表达(98). 有趣的是，一项研究表明多诺瓦尼乳杆菌淋巴结中PGE2生成增加的营养不良小鼠(1).
因此，很明显利什曼原虫寄生虫能够调节许多巨噬细胞功能，以促进宿主内的生存。虽然我们已经看到寄生虫的表层是触发许多这些效应的原因，但我们还没有直接探讨信号传递的细胞内机制。一些细胞内信号通路由利什曼原虫将在下一节中讨论。
利什曼尼亚-诱导宿主细胞信号的改变
细胞通过细胞内信号通路将质膜外部的刺激转化为细胞生理程序的变化。这些通常由外部配体的连接触发，例如细胞因子或利什曼原虫表面分子，连接到细胞表面的受体。这种连接导致受体激活，通常通过磷酸化和/或构象变化，导致胞浆内第二信使的激活。这些第二信使通常是蛋白激酶，然后磷酸化其他激酶以继续级联，最终导致效应分子的激活，如转录因子或肌动蛋白丝，并导致细胞行为的改变。应该强调的是，细胞内途径的活性通常由正调控和负调控的平衡决定。在一个典型的负反馈例子中，特定激酶级联的激活通常会导致其相反的磷酸酶的激活。许多原核和真核病原体，包括利什曼原虫，已经发展出各种策略，通过扭曲积极和消极影响之间的平衡来利用宿主细胞的信号调节机制。在以下段落中，我们描述了迄今为止关于通过以下方式调节宿主细胞信号的一些最重要的观察结果利什曼原虫感染（总结如图。).
诱导或抑制巨噬细胞功能的信号事件利什曼原虫感染。利什曼原虫巨噬细胞内的内化是一种受体介导的事件，这种最初的宿主-帕金森相互作用负责快速激活和失活几种导致巨噬细胞功能的信号通路（例如吞噬、趋化因子分泌和前列腺素分泌）。SHP-1对JAK2、Erk1/Erk2 MAP激酶、NF-κB、IRF-1和AP-1产生负面影响，从而抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞功能（例如一氧化氮、IL-12生成和免疫蛋白酶体形成）。蛋白酶体降解STAT1α依赖于PKCα。其他磷酸酶（例如IP三磷酸酶和钙调神经磷酸酶）和表面寄生虫分子（例如LPG）在各种第二信使（例如PKC、Ca2+肌醇脂质和肌醇磷酸盐），调节重要的吞噬细胞功能（例如NO和超氧物生成）。Mφ，巨噬细胞；二酰甘油；PLC、磷脂酶C；fMLPR，甲酰肽受体；PIP2，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸。
钙2+-和PKC依赖路径
第一个第二个信使之一，据报道被利什曼原虫寄生虫是钙（Ca2+).利什曼原虫感染可增加细胞内钙2+吞噬细胞浓度(41,117). 表面分子LPG似乎螯合Ca2+(41)并有助于细胞内钙的快速升高2+浓度(91); 然而，这两个属性之间的因果关系尚未建立。细胞内钙浓度增加似乎是钙增加的结果2+感染细胞对细胞内钙耗竭的吸收2+商店(91). 当细胞感染多诺瓦尼乳杆菌或墨西哥乳杆菌显示Ca发生变化2+-依赖性反应，如趋化性和ROI的产生(14,117)，很难建立一个明确的事件序列将两者联系起来。例如，抑制ROI生成也可能是由于肌醇-1,4,5-三磷酸（IP三) (117). 这可能是由于利什曼原虫负责IP去磷酸化的酸性磷酸酶三(33)或升高的Ca2+浓度本身可以激活主机IP三磷酸酶作为钙依赖级联反应的一部分(116).
许多下游调节酶需要Ca2+为了充分发挥活性（例如，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调磷酸酶[也称为PP-2B或PPP3]）。细胞内Ca升高2+因此，浓度与钙调神经磷酸酶活性的增加相一致(91). PKC的一些亚型也是Ca2+依赖性，所以PKC活性降低可能令人惊讶多诺瓦尼-感染巨噬细胞，这有助于寄生虫存活(37,106,118). 已证明Promastigote LPG会导致这种抑制(37); 然而，缺乏液化石油气的无鞭毛菌也能抑制受感染的人类单核细胞中的PKC，这表明存在替代机制(118). LPG介导的抑制可以通过观察到它干扰调节因子的结合来解释，包括Ca2+和二酰甘油，也可以阻断PKC膜插入（参考文献综述38). 有趣的是，PKC对二酰基甘油的敏感性降低首次在感染了多诺瓦尼乳杆菌无鞭毛菌，它与氧自由基生成减少有关(118). 各种各样的利什曼原虫据报道，纯化的gp63可以抑制MARCKs相关蛋白，这是一种与细胞骨架相关并参与液泡扩散的PKC底物(28,29). GIPL，另一个利什曼原虫表面糖脂也可能使PKC失活，但这一过程需要进一步研究(105).
有趣的是，钙的抑制2+-PKC的依赖性亚型，特别是PKCβ，伴随着钙非依赖性PKCξ的诱导(9). 抑制和激活显然是感染后神经酰胺合成增加的结果(52). 这种神经酰胺还被认为有助于激活磷酸酪氨酸磷酸酶（PTP）和抑制有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶（下文讨论）。
一项研究还表明，添加重组IL-10有助于抑制巨噬细胞PKC多诺瓦尼乳杆菌感染以及感染前添加抗IL-10抗体阻止了PKC的抑制(8). 这是令人惊讶的，因为PKC的调节先前被证明是巨噬细胞和寄生虫相互作用的直接结果(9,49,98). 然而，受感染巨噬细胞分泌的IL-10很可能抑制邻近的原始巨噬细胞的PKC活性，从而削弱其参与免疫激活的能力，可能使其更容易受到后续感染。
JAK2/STAT1-和IFN-γ介导的信号
一些巨噬细胞功能被利什曼原虫感染（例如NO和MHC II类）是IFN-γ诱导的。因此，毫不奇怪利什曼原虫可以抑制JAK2/STAT1信号传导，这是IFN-γ受体下游的主要途径。受感染的巨噬细胞在IFN-γ刺激后磷酸化JAK1、JAK2和STAT1的能力有缺陷(11,114). 在以下情况下多诺瓦尼乳杆菌前鞭毛虫，这种失活过程被证明依赖于PTP的激活，尤其是PTP SHP-1的激活(11)（图。). 一项研究还表明，IFN-γ受体的负调控有助于JAK2/STAT1途径在多诺瓦尼乳杆菌-受感染的细胞(130). 然而，情况似乎并非如此墨西哥乳杆菌无鞭毛虫感染，MHC I类的IFN-γ依赖性调节不受感染影响，表明主要信号损伤位于IFN-γ受体下游(78).
MAP激酶家族
MAP激酶的抑制利什曼原虫在用脂多糖或肉豆蔻酸佛波酯刺激后，两项独立研究报告了感染(94,113). 在第一项研究中亚马逊乳杆菌无鞭毛菌能快速改变ERK1 MAP激酶磷酸化，以响应LPS(94). 在第二部分中，作者使用了多诺瓦尼乳杆菌证明ERK1/2 MAP激酶失活伴随着转录因子Elk-1和c的抑制-福斯表达式(113). 在这两项研究中，都表明PTP负责ERK1/2 MAP激酶的去磷酸化。然而，Martiny等人发现，所讨论的PTP来自寄生虫(94)而Nandan等人提出内源性巨噬细胞PTP(113). 我们最近的数据支持了后一项研究，表明巨噬细胞PTP SHP-1去磷酸化并灭活ERK1/2，因为缺乏SHP-1的巨噬细胞表现出正常的JAK2和ERK1/2 MAP激酶活性以及IFN-γ依赖性NO生成（G.Forget等人，提交发表）。Ghosh等人报告巨噬细胞感染多诺瓦尼乳杆菌导致神经酰胺的合成增加(52). 这似乎导致ERK1/2磷酸化降低，明显是通过激活内源性磷酸酶，从而抑制NF-κB和AP1，减少NO生成，提高寄生虫存活率(52,53).
似乎其他MAP激酶家族成员也在下列情况下失活利什曼原虫感染。例如，p38 MAP激酶在L.主要-模拟吞噬细胞T淋巴细胞相互作用的特异性抗CD40抗体刺激感染细胞(2). 该研究的作者认为p38失活有助于抑制iNOS诱导和NO生成。
神经酰胺介导的ERK1/2 MAP激酶的失活以及由此产生的转录因子AP-1和NF-κB的抑制也被提出，以解释NO生成的缺失多诺瓦尼乳杆菌-受感染的细胞(53). 这些研究得到以下观察结果的支持：所有三个MAP激酶亚家族（ERK1/2、p38和JNK）在多诺瓦尼乳杆菌被原始巨噬细胞吞噬(125). 这部分是由于液化石油气，至少在ERK1/2的情况下是这样，因为LPG缺乏的前鞭毛虫确实触发ERK1/2磷酸化(125). 然而，这并不一定意味着液化石油气直接负责这些激酶的失活，但可能仅仅意味着在没有液化石油气的情况下利什曼原虫其宿主细胞被修饰。使用LPG-deficient多诺瓦尼乳杆菌前鞭毛虫，我们观察到PTP SHP-1仍然由这些寄生虫诱导，导致与JAK2和MAP激酶信号通路相关的信号和转录因子失活（M.Olivier等，未发表数据）。观察到ERK1/2在无液化石油气的情况下被激活(125)可能是其他非LPG依赖过程的副作用，如趋化因子和PGE2分泌。最后，p38激活似乎对控制利什曼原虫感染，因为在接受樟柳霉素治疗的巨噬细胞中，寄生虫的存活率降低，樟柳霉素激活p38(71). 这并不奇怪，因为任何能够增强导致巨噬细胞活化的信号通路的化合物的使用都应证明其对利什曼原虫感染。通过使用PTP抑制剂过氧钒，我们在体内外证明，通过靶向负调控分子来调节宿主细胞信号，可以对皮肤和内脏利什曼病的发展提供几乎完全的保护(99,119).
最近的一项研究提出了另一种潜在机制，其中墨西哥乳杆菌无鞭毛菌引起ERK和JNK的快速半胱氨酸肽酶依赖性降解，但不引起p38(22). 乍一看，这一新报告与早期的研究形成了显著对比，早期的研究中ERK1/2磷酸化，但并不丰富，受到感染的影响。然而，这些研究都使用了L.主要或多诺瓦尼乳杆菌或是多诺瓦尼乳杆菌，也是唯一一份关于感染新世界后ERK磷酸化的报告利什曼原虫(亚马逊乳杆菌)无鞭毛菌没有解决ERK总丰度问题(94). 因此，ERK失活机制可能与利什曼原虫物种已被揭示。机制的选择可能取决于新旧世界菌株之间的不同进化，也可能取决于另一个因素。为了解决这个问题，有必要对不同地理来源和临床结果的一系列物种进行直接比较研究。
SHP-1蛋白酪氨酸磷酸酶
利什曼原虫也可以激活抑制细胞内信号级联的各种分子。一种重要的负调控分子是PTP SHP-1（Src同源性2结构域酪氨酸磷酸酶，也称为SHPTP-1、HCP和PTP1C），主要在造血细胞中表达，也在平滑肌中表达(92)和上皮细胞(三). 这种磷酸酶在其N端部分包含两个SH2结构域，一个保存在中心位置的磷酸酶结构域和一个C端尾部(167). SHP-1的SH2结构域发挥双重作用，包括底物识别和PTP自动调节。这些结构域特异性地结合酪氨酸残基上磷酸化的蛋白质，然后结合三到六个属于保守基序的特定氨基酸(121,146). 在SHP-1的情况下，其两个SH2结构域通过存在具有一致序列I/V/LxYxxL/V的免疫受体酪氨酸基抑制基序来识别目标蛋白(20).
SHP-1以多种方式作用，对所有造血细胞类型中的许多信号通路进行负调控。例如，SHP-1可以与受体结合并直接去磷酸化；它还可以与受体结合，并使受体结合复合体的其他成员去磷酸化。PTP还可以与其他细胞溶质蛋白相互作用，并使其或其相关蛋白酪氨酸去磷酸化(48). 大多数已记录的SHP-1效应是各种激酶及其信号通路去磷酸化抑制的结果。SHP-1在细胞因子受体刺激后限制JAK/STAT通路的激活中起着重要作用。JAK1/2、TYK2和STAT1α、-2、-3、-5α/β和-6的去磷酸化已被证明(34,58,81,129,166). 据报道，在SHP-1磷酸酶活性缺乏的活的蛾子小鼠中，转录因子NF-κB的核移位增加(46,76,95)这似乎会加剧炎症反应。据报道，SHP-1也被激活(82,165)或抑制(113; Forget等人，提交）MAP激酶，以及诱导Src激酶活性(144).
一些研究表明，感染后IFN-γ依赖性磷酸化级联反应的抑制是由于宿主细胞酪氨酸磷酸酶的激活所致(11,119). 向感染PTP抑制剂的小鼠注射双过氧钒化合物L.主要或多诺瓦尼乳杆菌结果控制了感染。皮肤损伤和寄生负荷在L.主要-感染小鼠，而多诺瓦尼乳杆菌-感染小鼠得到了完全保护(119). 这项体外和体内研究首次证明了寄生虫对宿主PTP的调节在感染进展中起着关键作用。此后，双过氧化钒介导的保护作用被证明取决于iNOS的诱导和NO的产生，以及增强的先天炎症反应，这在控制感染中一定发挥了重要作用(99).
在一项平行研究中，我们证明巨噬细胞PTP活性在暴露于多诺瓦尼乳杆菌前鞭毛虫，这与高分子量蛋白质的快速、一般酪氨酸去磷酸化有关(11; Forget等人提交）。SHP-1是PTP激活的最重要组成部分（图。)（Forget等人提交）。此外，SHP-1与JAK2直接关联如下多诺瓦尼乳杆菌感染，这种相互作用可以部分解释JAK2信号不能被IFN-γ刺激触发(11). 最近，使用SHP-1缺陷的永生化巨噬细胞系，我们已确定该PTP负责JAK2和ERK1/2 MAP激酶的失活。SHP-1缺陷巨噬细胞中这些激酶的保护使这些细胞能够通过产生NO对IFN-γ刺激作出反应，即使它们受到感染（Forget等人，提交）。另一组报告证实了我们的发现，SHP-1与MAP激酶在多诺瓦尼乳杆菌感染(113). 他们表明，感染的巨噬细胞对佛波酯-肉豆蔻酸醋酸酯（一种人工PKC激活剂）没有反应，这反映在抑制ERK1/2磷酸化、Elk-1失活和c-福斯mRNA表达。这两项研究之间的一个显著差异是，感染后17小时观察到ERK的抑制，而JAK2和SHP-1之间的相互作用以及随后JAK2的下调在1小时内观察到。细胞系之间的差异及其分化状态可能部分解释了这种差异。然而，寄生虫快速抑制宿主细胞功能的能力对其生存至关重要。除了我们使用前鞭毛虫的研究外亚马逊乳杆菌也被证明能快速灭活ERK1/2(94). 比较的容量婴儿多诺瓦尼乳杆菌前鞭毛虫和无鞭毛虫触发宿主PTP活性，我们发现两者都能快速且相似地诱导巨噬细胞的这种负调控活性（I.Abu-Dayyeh和M.Olivier，未发表的数据）。最近，有人提出多诺瓦尼乳杆菌感染后16小时观察到SHP-1的后期诱导(115). 然而，SHP-1的激活速度如此之快，因此在早期阶段还必须有受体介导的过程(11,94). 通过使用小干扰RNA对抗免疫球蛋白家族的不同负调控受体的策略，可以揭示涉及的特定受体。
激活SHP-1利什曼原虫-受感染的巨噬细胞。感染了30分钟的巨噬细胞多诺瓦尼乳杆菌用碘化丙啶（PI）（红色）或SHP-1特异性抗体（绿色）染色。SHP-1在对照细胞的细胞质中均匀分布，但在感染后呈点状分布。SHP-1的病灶也可见于感染细胞的细胞核中。无，无感染；Ld、，多诺瓦尼乳杆菌感染。
在过去的几年里，我们已经坚定地证明SHP-1在利什曼原虫感染。使用SHP-1缺陷、可存活的封存小鼠，我们发现L.主要-受感染的动物没有出现足垫肿胀，寄生负荷显著降低(46). 感染足垫的组织化学和原位杂交分析表明，与野生型动物的情况相反，已知参与该表达的iNOS基因表达和各种信号分子（STAT1，NF-κB）在SHP-1缺陷小鼠中没有改变或减少。事实上，感染导致NO生成增加，这一定有助于杀死寄生虫。事实上，iNOS抑制剂氨基胍完全逆转了iNOS的保护作用L.少校SHP-1缺陷动物的感染观察(46). 此外，我们最近获得了关于SHP-1在控制内脏利什曼病中的作用的类似体内结果多诺瓦尼乳杆菌感染。有趣的是，使用病原体方法，我们发现参与体内感染后抑制的信号传递和免疫反应的大多数宿主基因都受到PTP SHP-1的负调控（Olivier等人，未发表的数据）。
SOCS系列
最近发现了一组新的负调控蛋白。细胞因子信号转导抑制因子（SOCS）家族目前被认为在抑制几种细胞因子诱导的信号转导中发挥重要作用，主要是通过其对JAK/STAT通路的作用。第一个被发现的成员是细胞因子诱导的含SH2蛋白（CIS）。CIS基因是一种对胞嘧啶受体刺激产生反应的早期基因，其过度表达被证明可以抑制IL-3介导的信号传导(42,112,150,168). 现在看来，有八个成员组成了这个负调控因子家族：CIS本身和SOCS1-7(65,96,149). 该家族的蛋白质包含两个重要的保守位点，一个中心SH2结构域和一个朝向C末端的40-氨基酸SOCS盒基序(77).
SOCS基因在原始巨噬细胞中不表达。它们的转录是根据激活JAK/STAT通路的各种细胞因子、激素和生长因子（如IFN-γ）而诱导的（参考文献综述56). 一旦转录，SOCS蛋白将抑制负反馈回路中的JAK/STAT通路。它们的作用模式各不相同，但作为这种调节器如何工作的一个例子，据报道，CIS似乎通过其SH2基序与磷酸化JAK结合。这可能会阻止STAT的结合，从而阻止STAT磷酸化(97).
一项研究表明，SOCS3在多诺瓦尼乳杆菌-感染的人类吞噬细胞(7). SOCS3 mRNA的表达是由活的或热灭活的寄生虫以一种短暂的方式诱导的，但它不是由LPG单独诱导的，也不依赖吞噬作用或促炎细胞因子（TNF-α或IL-1）的产生，这些刺激已知会触发SOCS的表达(7). 虽然数据令人信服，但我们早期的研究无法显示任何SOCS家族成员在多诺瓦尼乳杆菌-受感染的巨噬细胞（Olivier等人，未发表的数据）。此外，SOCS3诱导的功能后果尚未得到解决；进一步研究表明该抑制剂家族在通过以下途径破坏巨噬细胞功能中所起的作用利什曼原虫将引起极大的兴趣。
蛋白酶体介导的蛋白质降解
第二信使尤其是一些转录因子的调节依赖于泛素-蛋白酶体蛋白水解途径，该途径负责降解大量细胞和外源蛋白。这不仅在细胞周期、分裂和应激反应的调节中起关键作用，而且在免疫反应和炎症等方面也起关键作用（参考文献综述55). STAT1α作为JAK2/STAT1通路的靶转录因子，在许多IFN-γ诱导基因的诱导中起着重要作用，这些基因被利什曼原虫与此作用一致，STAT1α磷酸化(114)和DNA结合活性(130; Forget等人，提交）在多诺瓦尼乳杆菌-感染细胞。不同背景下的各种研究表明，蛋白酶体抑制剂的使用可以稳定STAT磷酸化水平。然而，没有人明确提出蛋白酶体作用是针对STAT的假设。一些报道称蛋白酶体影响了JAK受体的稳定性或JAK活性(21,59,159,160,169). 在最近的一项研究中，我们观察到IFN-γ不能激活STAT1α核转位利什曼原虫-受感染细胞是病原体与宿主细胞相互作用后很早就开始快速持续的STAT1α蛋白减少的结果（Forget等人，提交）。重要的是，感染多种不同的利什曼原虫物种(L.主要,多诺瓦尼乳杆菌,墨西哥乳杆菌，或巴西乳杆菌). 这种现象似乎是STAT1α特有的，因为STAT3水平没有变化。使用PTP抑制剂和SHP-1缺陷巨噬细胞，我们能够证明PTP不参与多诺瓦尼乳杆菌-介导STAT1α失活。蛋白酶体抑制剂可以挽救STAT1α蛋白的降解。我们的研究进一步揭示，蛋白激酶Cα（PKCα）依赖性信号可能与蛋白酶体介导的STAT1α失活过程有关。总之，这些结果证明蛋白酶体途径在感染STAT1α的巨噬细胞特异性蛋白水解中的直接作用利什曼原虫代表了一种新的机制，病原体可以借此破坏杀菌作用。
