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细胞应激伴侣。2005年3月；10(1): 46–58.
数字对象标识：10.1379/CSC-44R.1
预防性维修识别码：项目经理1074571
PMID：15832947

热休克蛋白和热休克蛋白信使核糖核酸在前列腺癌组织中的表达

丹丹,1 Abdul Khaleque女士,2 埃伦·琼斯,1 吉米·塞里奥（Jimmy R.Theriault）,2 程莉,三 王永雄,三 玛丽·安·史蒂文森,2和斯图亚特·卡尔德伍德1,2,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

热休克蛋白（HSPs）被认为在癌症的发展中发挥作用，并调节肿瘤对细胞毒治疗的反应。在这项研究中，我们检查了hsf（高速）和热休克蛋白正常人前列腺上皮细胞和一系列源自人类肿瘤的前列腺癌细胞系中的基因。我们观察到HSF1、HSP60和HSP70在恶性肿瘤细胞PC-3、DU-145和CA-HPV-10中的表达升高。基因芯片微阵列研究表明，癌细胞系中HSP的高表达似乎在信使后核糖核酸（mRNA）水平上受到调节，这表明正常和恶性前列腺细胞系之间的热休克因子（HSF）或HSP mRNA表达几乎没有差异。当我们比较体外单层生长的PC-3前列腺癌细胞和体内裸鼠体内生长的肿瘤异种移植物之间组成性热休克蛋白基因的表达模式时，我们发现PC-3肿瘤中广泛的热休克蛋白表达显著降低。肿瘤中HSP表达模式的降低可能是PC-3肿瘤对热休克敏感性增加的基础。然而，热休克对HSP基因的诱导并没有因肿瘤微环境中的生长而显著改变，在各种生长条件下的应激后，HSP40、HSP70和HSP110都大量表达。因此，我们的实验表明，HSF和HSP水平在恶性程度较高的前列腺癌细胞中升高，并且也显示了热休克诱导基因表达的主导性质，从而在体内外诱导了大量HSP。

简介

热休克蛋白（HSPs）是首次发现的一组蛋白质，是由热休克和其他化学和物理应激在许多物种中共同诱导的(林奎斯特和克雷格1988;Georgopolis和Welch 1993年). HSP(表1)随后被描述为分子伴侣，即具有改变其他蛋白质结构和相互作用的共同特性的蛋白质(林奎斯特和克雷格1988;Beckmann等人1990;Gething and Sambrook 1992年;乔治奥波利斯和韦尔奇1993;Netzer和Hartl 1998). 分子伴侣的功能决定了热休克蛋白通常以化学计量的一对一方式与其底物相互作用，这就需要高浓度的细胞内蛋白质(林奎斯特和克雷格1988;乔治奥波利斯和韦尔奇1993). 当蛋白质结构被热休克、氧化应激或其他蛋白质损伤事件破坏时，热休克蛋白作为从变性、聚集蛋白质构象向有序、功能构象转变的分子尤其需要(林奎斯特和克雷格1988;Gething and Sambrook 1992年;乔治奥波利斯和韦尔奇1993). 这个热休克蛋白27,热休克蛋白40,热休克蛋白70，以及热休克蛋白110因此，基因在应激过程中进化出一种高效的大规模合成机制，具有强大的转录激活、高效的信使核糖核酸（mRNA）稳定和选择性mRNA翻译(Voellmy 1994年). 应激后HSP27、HSP70、HSP90和HSP110增加，成为主要表达蛋白(希基和韦伯1982;Landry等人1982年;Li和Werb 1982;Subjeck等人1982年;Henics等人，1999年) (Zhao等人2002). 热休克因子（HSF）蛋白已被证明与许多HSP基因的启动子相互作用，并确保在应激状态下迅速转录激活，在恢复后也能迅速关闭(Sorger和Pelham 1988年;吴1995). 这个hsf（高速）基因家族包括HSF1(热休克因子1)，热休克反应的分子协调器，以及2个表征较差的基因，hsf2（高速f2）和hsf4型(Rabindran等人1991年;Schuetz等人1991年) (Nakai等人1997年). 除了热诱导的热休克蛋白外，细胞还含有大量组成性表达的热休克肽同系物，这些同系物也列于表1组成性热休克蛋白存在于多种包含热休克蛋白和辅因子的多蛋白复合物中(Buchner 1999年). 其中包括介导蛋白质折叠的HSP10-HSP60复合物，以及参与一般蛋白质折叠途径和与细胞内调节蛋白特异性结合的含有HSP70和HSP90的复合物(Netzer和Hartl 1998). HSP90在细胞调节中发挥着特别多功能的作用，与大量细胞激酶、转录因子和其他分子形成复合物(Buchner 1999年;Grammatikakis等人，2002年).

表1

 芯片阵列分析法研究热休克蛋白家族基因

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为i1466-1268-10-1-46-t01.jpg

与邻近的正常组织相比，许多肿瘤类型包含HSP28、HSP70和HSP90家族的高浓度HSP(Ciocca等人1993年;Yano等人1999年;Cornford等人2000;Strik等人2000;Ricaniadis等人2001;Ciocca和Vargas Roig，2002年). 我们在此集中研究前列腺癌中HSP基因的表达。前列腺上皮细胞向完全恶性转移表型的发展是一个复杂的过程，涉及癌基因的表达以及逃避雄激素依赖性生长和生存(Cornford等人2000). HSP56、HSP70和HSP90调节雄激素受体（AR）的功能，因此在前列腺癌中HSP表达与肿瘤进展之间存在分子联系(Froesch等人1998年;Grossmann等人，2001年). 肿瘤发生过程中逃避AR依赖可能涉及HSP-AR相互作用的改变(Grossmann等人，2001年). 热休克蛋白在肿瘤发展中的作用也可能与其在应激耐受性发展中的功能有关(李和哈恩1981). 轻度应激与高HSP水平的表达协同作用诱导细胞产生热耐受(Landry等人1982年;Li和Werb 1982;Subjeck等人1982年). HSP表达升高似乎是肿瘤发病的一个因素，除其他机制外，这可能涉及单个HSP阻断凋亡途径的能力，并允许恶性细胞出现，尽管在转化过程中触发了凋亡信号(Volloch和Sherman 1999年). 从头开始的HSP表达也可以通过阻止这些方式的促凋亡影响，保护癌细胞免受化疗和热疗等治疗的影响(Gabai等人1998年;Hansen等人1999年;Blagosklonny 2001年;Asea等人2001年;Van Molle等人2002). 肿瘤细胞中HSP诱导的机制尚不清楚，但可能反映了伴随恶性肿瘤的遗传改变或肿瘤微环境的紊乱状态，这可能会导致细胞应激。

在这里，我们检查了hsf（高速）和热休克蛋白永生化正常人前列腺上皮细胞和从人类肿瘤中获得的一系列前列腺癌细胞中的mRNA和蛋白质水平的基因。我们的目的是确定hsf-HSP表达谱在表达不同程度恶性肿瘤的细胞中，在静息状态下以及在加热和电离辐射后是否保持不变。此外，我们比较了在单层培养或裸鼠肿瘤异种移植中生长的转移性前列腺癌细胞系的HSP表达谱。这些研究是由我们实验室的发现推动的，与体外组织培养中生长的类似细胞相比，体内生长的前列腺癌细胞对热诱导的凋亡更为敏感。我们的研究表明，尽管hsf-HSP在正常和恶性前列腺衍生细胞中的表达谱在mRNA水平上相似，但在蛋白质水平上的表达却截然不同。HSF1和HSP蛋白在3种转移性前列腺癌细胞系（PC-3、DU-145和CA-HPV-10）中表达最高。尽管构成性热休克蛋白的基因表达模式在体外PC-3细胞和体内异种移植物中存在巨大差异，但热休克蛋白基因的应激诱导并没有因肿瘤微环境的暴露而显著改变，这表明应激反应的层级性，使其能够超越其他形式的调节。

材料和方法

细胞系和组织培养

正常前列腺上皮细胞系PZ-HPV-7和人前列腺癌细胞系PC-3、DU-145、LNCap和CA-HPV-10来自美国型培养物收集(美国标准菌库，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）。如前所述，细胞系PZ-HPV-7来源于正常前列腺组织，而CA-HPV-10来源于原发性前列腺癌组织，在裸鼠体内生长形成远处转移。两种细胞系均通过HPV转化建立(Weijerman等人1994年). PC-3来自人类前列腺癌骨转移，DU-145来自前列腺癌脑转移(Stone等人1978年;Kaighn等人1979年). PC-3是p53缺失细胞系，DU-145是p53突变细胞(Carroll等人1993年). 由于HPV-18蛋白E6和E7的表达，PZ-HPV-7和PZ-HPV-10细胞具有失活p53（以及Rb抑制）(Wang和Lu 2004). 细胞系LNCap也来源于前列腺癌患者锁骨上淋巴结的转移灶。它表达高亲和力特异性AR和野生型p53，并且其生长依赖于雄激素(Horoszewicz等人1983年). 我们发现，PC-3、DU-145、LNCap和CA-HPV-10细胞在裸鼠体内异种移植时均能导致肿瘤形成，而PZ-HPV-7细胞没有形成肿瘤。PC-3、DU-145和CA-HPV-10肿瘤生长导致小鼠形成远处转移，而LNCap细胞具有弱转移性。细胞在37°C的细胞培养基中培养，血清浓度由美国标准菌库分别在循环水浴中进行热休克（43°C，1小时）处理，然后在37°C的培养箱中进行2小时恢复，再进行10 Gy照射，恢复2小时，或热休克和照射联合进行，恢复2个小时。对照细胞未经处理，在37°C下培养。

PC-3细胞作为肿瘤异种移植和热休克放射治疗的生长

雄性裸鼠（8至10周龄）购自Taconic Farms（Germantown，NY，USA），并在交替的黑暗和光明周期下被安置在Dana Farber癌症研究所的动物饲养室的层流隔离单元中。动物以食物和水为食随意。PC-3细胞作为异种移植物生长在雄性裸鼠的侧翼。电池（5×106)将其植入一只雄性裸鼠的后腿皮下。当肿瘤直径至少达到10毫米时，进行热疗和放射治疗。通过将带瘤肢体浸入受控循环水浴中进行热疗实验，以产生43°C的肿瘤内温度，持续1小时，通过插入肿瘤的热电偶探头测量。一些荷瘤小鼠在Gammacell 40（加拿大安大略省多伦多市放射化学公司加拿大有限公司）接受了10 Gy的γ辐射照射。在高温或辐射治疗（或两者）两小时后，杀死小鼠，然后在无菌条件下切除肿瘤，并立即储存在液氮中进行RNA分离。

RNA提取和杂交准备

使用TRIZOL试剂（美国马里兰州罗克维尔市生命技术公司）从细胞中提取总RNA。采用上标选择系统（Life Technologies）合成了第一和第二链互补脱氧核糖核酸（cDNA）；通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀纯化双链cDNA。使用酶转录标签法（Enzo Diagnostics，Farmingdale，NY，USA）对RNA进行体外转录和生物素标记。互补核糖核酸（cRNA）在亲和树脂（Rneasy，Qiagen，Valencia，CA，USA）上纯化。通过分光光度分析进行量化后，通过在94°C下40 mM三醋酸（pH 8.1）、100 mM醋酸钾和30 mM醋酸镁中孵育35分钟，随机破碎20μg cRNA。

阵列杂交和扫描

基因芯片探针阵列HuGeneFL（Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，USA），其中包含询问Unigene（Build 18）、GenBank和TIGR数据库中约5600个全长人类基因的探针，用于杂交。如前所述，根据Affymetrix基因芯片表达分析技术手册（Affymetix）进行阵列杂交、清洗、染色和扫描(Wodica等人1997年).

数据分析

使用DNA芯片分析仪（dChip）进行阵列归一化和表达值计算(李和王2001)，可根据要求免费提供。不变集规范化(李和王2001)在探针单元级别，使用了基于模型的方法使阵列具有可比性(李和王2001)用于探针选择和表达式级别计算(Eisen等人1998年). 这些表达水平附有标准误差作为测量精度，随后用于计算折叠变化的90%置信区间(李和王2001). 通过两两比较得出的褶皱变化的置信下限被视为实际褶皱变化的保守估计。

免疫印迹分析和抗体

将前列腺细胞胰蛋白酶化，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并在改良的放射免疫沉淀缓冲液中溶解（Tris-HCL[50 mM，pH 7.4]，NaCl[150 mM]，NP-40[1%]，脱氧胆酸钠[0.5%]，十二烷基硫酸钠[SDS，0.1%]和乙二胺四乙酸[5 mM]）含有蛋白酶抑制剂混合物（德国Boehringer Mannheim有限公司）。14000×离心后克取上清液作为细胞提取物，持续10min。然后对细胞提取物进行SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用湿转移设备（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA，USA）将HSF1、HSF2、Hsp70、Hsp60、Hsp90和β-肌动蛋白转移到硝化纤维膜（Schleicher&Schuell，Mannheim，Germany）上。抗体来自以下来源：抗HSF1的多克隆抗体，来自Stressgen Biotechnologies Corp（加拿大维多利亚州）的抗Hsp70、Hsp60和Hsp90的单克隆抗体，以及来自Santa Cruz Biotechologies Corp的抗HSF2的多克隆疫苗（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）以及来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）的抗β-肌动蛋白单克隆抗体。

TUNEL染色和凋亡指数测定

ApoDirect™试剂盒（Phoenix Flow Systems，San Diego，CA，USA）用于单细胞悬浮液的末端转移酶（TUNEL）染色。在单层培养中生长的凋亡PC-3细胞在发生凋亡时往往会从培养皿上脱落。因此，在500×克5分钟后用单层胰蛋白酶分离细胞。细胞在pH7.4（PBS）的PBS中洗涤，并固定在1%w/v的PBS多聚甲醛中。细胞固定后，用TdT酶标记凋亡片段的游离3′端，该酶将DNA片段与荧光素-脱氧尿苷三磷酸标记结合，用碘化丙啶复染DNA含量，并使用双通道流式细胞仪（Becton Dickson FACScan，Mountain View，CA，USA）进行分析。每个实验都包括阴性和阳性对照细胞。凋亡指数是TUNEL阳性细胞（即凋亡细胞）的数量除以培养皿中的细胞总数（培养基中的细胞和单层细胞）。我们还使用制造商（Phoenix Flow Systems）描述的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤切片的TUNEL染色检查了肿瘤切片中细胞的凋亡。

结果

由于HSP的表达与患者生存率和恶性细胞对一系列方式治疗的敏感性降低的不良预后呈正相关，我们检测了HSP在一系列不同恶性程度的前列腺癌细胞系中的表达。对于正常对照组，我们使用永生化正常前列腺上皮（PZ-HPV-7）。恶性细胞系包括激素应答、p53高效、低转移性LnCap细胞系以及完全转移性雄激素抵抗和p53无效细胞系（DU-145、PC-3和CA-HPV-10）。每个细胞系要么进行假处理，要么在43°C下热休克1小时，要么在10 Gy下照射，要么进行联合处理。然后提取RNA和细胞蛋白，并通过微阵列和免疫印迹分析进行分析。

热休克蛋白在5种前列腺癌细胞株中的表达

我们首先分析了表1在5个前列腺衍生细胞系中。研究中检测的基因包括泛素、HSP10、4个HSP27家族成员、2个HSP40家族成员、HSP47、HSP60、11个HSP70家族成员、两个HSP90家族成员和HSP105（也称为HSP110）(表1). 当我们比较未经治疗前列腺细胞系中这些基因的相对表达水平时，我们发现HSP基因的表达主要由HSP90α和HSP90β、泛素、HSP28、HSP60和HSP70-8控制(图1). 虽然这些mRNA的水平在细胞系之间有一定程度的波动，但任何HSP mRNA的表达与细胞系的相对恶性度之间没有明显的相关性(图1). 尽管CA-HPV-10细胞系的HSP60、HSP70-4、HSP70-8、HSP90和HSP105低于其他细胞系，但细胞系之间没有一致的差异(图1). PZ-HPV-7细胞在泛素HSP28、HSP70-1B和HSP90家族中含量较低，但在HSP701A中含量较高(图1). 之前进行的西方分析表明，与许多正常细胞相比，PC-3细胞在基础条件下在蛋白质水平表达HSP70（HSP72）(Jones等人2004). 如图所示图1HSP70-1A和HSP70-1 B基因在这些条件下表达，这些基因的产物可能是从前列腺衍生细胞系提取的蛋白质的Western分析中检测到的“HSP72”(Jones等人2004). 严格HSF1诱导的HSP70B′基因的表达(Schiller等人1988年)在非应激条件下几乎无法在任何细胞系中检测到HSF1的转录激活水平，这表明HSF1在这些非应激细胞中的转录激活程度最低，其他HSPs的基础表达可能是由于其他因子的活性(图1). 其他HSP70家族基因，包括HSP70-4（HSP70RY）、HSP70-5（grp78或BiP）、HSP40-8和hsc70(表1)在37°C时表现得相当丰富(图1). 这些密切同源的HSP家族基因在细胞内伴侣活性和细胞调节中的确切相对重要性尚不全面，并且尚不清楚哪些基因产物可被可用的“抗HSP70”抗体检测到（除了更为不同的HSP70-5和HSP70-8）。其中一些问题由Tavaria等人（1996年）.

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 在组织培养中生长的5个前列腺衍生细胞系中，27个HSP基因在37°C下的组成性表达。细胞在37°C下生长汇合，并在TRIzol试剂中收获，用于总RNA分离，然后按照材料和方法进行微阵列分析。热休克蛋白基因的表达水平表1已由dChip标准化，以便相互比较。PC，PC-3；DU，DU-145；LN、LNCap；CA，CA-HPV-10；PZ、PZ-HPV-7。星号表示必须打破一些表达级别栏以适应Y轴刻度。实验重复两次，结果可重复

当5个前列腺细胞系再次受到热休克时，在热恢复的细胞中观察到不同的相对HSP基因表达模式，HSP40-1、HSP70-1A、HSP70-1B、HSP70%B和HSP105是最强烈的诱导基因(图2A). 我们检测到LnCap与其他细胞系之间的主要差异，HSP诱导相对减少。在LnCap细胞中，HSP诱导率低，HSP40-1、HSP47、HSP70-1A和HSP70-6的诱导率较低，而HSP70B和HSP105的表达未检测到(图2A). 由于LNCap细胞系已被证明表达AR并且生长依赖雄激素，与其他失去AR表达的细胞相比，AR表达可能成为应激时HSP表达的一个潜在修饰因子(图2B). 当在2小时点进行分析时，电离辐射单独或与热结合对任何HSP基因的表达几乎没有影响，因此分析中未包含结果。

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 （A） 体外热休克2小时后测定5个前列腺细胞系中27个HSP家族基因的折叠表达。细胞在37°C下培养，然后通过热休克（43°C，1小时）处理，然后在37℃下恢复2小时。对照细胞未经处理，在37°C培养箱中培养。在进行上述基因表达分析之前，在TRIzol试剂中采集细胞。热休克蛋白基因表达水平已通过dChip标准化，以相互比较。热休克后HSP基因的相对基因表达谱显示为其相应的非热休克对照的表达水平的倍数。星号表示折叠表达式的一些条被打破，以适应Y轴刻度。实验重复两次，结果可重复。（B） 雄激素受体信使核糖核酸（mRNA）在PC-3、DU-145、LNCap、CA-HPV-10和PZ-HPV-7细胞中的表达如上所述（A）。（C） 雌激素受体相关基因在PC-3、DU-145、LNCap、CA-HPV-10和PZ-HPV-7细胞中的表达如（A）所示

Hsf公司前列腺细胞系中家族基因的表达

由于许多热休克蛋白含有热休克因子（HSE），即HSF激活的结合位点，我们接下来研究了HSP的相对表达hsf（高速）基因(hsf1、hsf2，以及hsf4型)从5个细胞系中提取的RNA(图3). 可以看出，个人的相对水平hsf（高速）mRNA种类在5种细胞类型中都非常相似(图3). HSF1是hsf（高速）基因在mRNA水平，约为HSF4水平的3倍和HSF2 mRNA水平的4倍(图3). 热休克或电离辐射处理均未显著改变HSF1、HSF2和HSF4 mRNA水平，尽管热休克确实导致某些细胞类型中HSF4的轻微下降。

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 热休克、电离辐射或热与辐射联合作用后前列腺癌细胞中hsf1、hsf2和hsf4基因的表达谱。用热休克（H；43°C，1小时）处理细胞，用10 Gy（R）的γ辐射照射细胞，或用热休克和辐射联合处理细胞（HR）。然后让热休克或辐射处理（或两者）后的细胞在37°C下恢复2小时。对照细胞（C），在37°C下未经处理。然后在TRIzol试剂中收集对照细胞和处理细胞。总核糖核酸（RNA）的分离、互补RNA（cRNA）的制备、阵列杂交、洗涤、染色和扫描均按照材料和方法进行。基因表达水平已通过dChip标准化，以相互比较。实验重复两次，结果可重复

HSF和HSP在蛋白质水平的表达

mRNA表达研究让我们感到困惑，尤其是因为之前的大多数研究表明癌症中HSF和HSP蛋白上调，热休克基因表达的激活与更具侵袭性的恶性表型相关。因此，我们接下来通过免疫印迹分析检测HSF和HSP蛋白的相对表达水平(图4A). 与微阵列研究相比(图1-3)，HSP在蛋白水平的表达存在显著差异(图4A). HSF1水平在3种转移细胞系PC-3、DU-145和CA-HPV-10中最高(图4A). HSF1在PZ-HPV-7中可检测到，但我们无法通过免疫印迹分析在LnCap细胞中检测到HSF1(图4A). HSF2的表达也有类似的趋势，但在LnCap中也检测不到(图4A). 奇怪的是，大多数细胞系在热休克后HSF2水平似乎升高，与早期的建议相反(Mathew等人1998年). 由于HSF1和HSF2在HSP诱导中协同作用，其水平的协同变化可能对HSP转录产生显著影响，特别是在热休克后(He等人2003年). mRNA和蛋白质表达水平之间的二分法表明，HSF水平在这些细胞的mRNA后水平上受到调节(图1-4). 差异翻译的作用hsf（高速）mRNA或HSF蛋白周转的动态调节（或两者）。HSP蛋白表达多少与HSF1水平相关(图4A). HSP60在具有最低HSF1蛋白水平的PZ-HPV-7和LnCap细胞中尤其最低(图4A). HSP70水平在一定程度上与HSF1相关，HSP70在HSF1升高的PC-3中表达最高，在HSF1表达最低的LnCap中表达最低(图4B). 然而，HSP90水平与HSF1并不密切相关(图4A). 这里的一个显著发现是，尽管HSF1和HSF2蛋白浓度很低，但LnCap细胞在热休克后确实大量表达HSP70(图4A). 然而，LnCap细胞确实合成HSF1和HSF2 mRNA，可能发生低水平蛋白表达(图3). 也有可能其他因素可以补偿低HSF1，或者可能发生转录后事件，如热信使核糖核酸稳定(Henics等人，1999年;Zhao等人2002). 例如，STAT1因子已被证明参与HSP70和HSP90转录(Stephanou和Latchman 1999年;Madamanchi等人2001)，和HSP mRNA已被证明包含被热休克灭活的3′失稳序列(Zhao等人2002). 尽管HSF1在HSP表达中的重要性毋庸置疑，但我们的实验确实表明其他因素在热休克前后都起作用。

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 （A） 前列腺癌细胞中HSF1、HSF2和分子伴侣HSPs的表达。细胞在37℃下生长或在43℃下热休克60分钟，并在37℃恢复6小时。然后在改良放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液中溶解对照细胞和热休克细胞，并对10μg蛋白质进行HSF1、HSF2、Hsp70、Hsp90、Hsp60和β-actin的免疫印迹分析。实验重复两次，结果可重复。（B） HSP70水平通过（A）的放射自显影的密度分析进行定量

HSP、HSF mRNA和蛋白表达动力学

接下来，我们对其中1个细胞系PC-3细胞中热休克蛋白mRNA的表达进行了动力学分析，这些细胞系从热休克恢复过来(图5). 我们绘制了热休克蛋白基因组的表达图，这些基因在(图5). 表达最丰富的HSP基因是HSP28，它具有较高的基础水平，也受到热的强烈诱导（5倍），有效地控制了热休克恢复细胞中HSP mRNA的表达。对于HSP28和大多数其他HSP基因，mRNA水平在治疗后3小时和6小时显著增加，并在24小时下降到基线值，尽管一个显著的例外是热休克蛋白70B该基因在加热后3小时被强烈诱导，但在6小时后迅速衰退。热处理后各种HSP70 mRNA的水平也很高，HSP70-1A、HSP70-1 B和HSP70B′被强烈诱导(图5). 因此，这些基因中HSP70 mRNA的组合水平预计在加热后比HSP28更丰富(图5). HSP40-1和HSP90-1也在这个高表达的HSP组中。尽管热强烈诱导HSP60、HSP47和HSP105，但其含量低于HSP28、HSP70或HSP90基因(图5).

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 热休克后PC-3细胞HSP信使核糖核酸（mRNA）表达的动态变化。细胞在43°C下热休克1小时，并在热休克后立即裂解，或在37°C下恢复3、6和24小时后裂解。在如上所述的基因表达分析之前，在TRIzol试剂中收获mRNA。利用热休克后3、6或24小时表达最丰富的热休克蛋白基因的数据绘制图形。实验重复两次，结果可重复

我们还检测了应激后24小时PC-3细胞中HSF mRNA的表达水平(图6). 在24小时内，HSF2和HSF4水平变化最小，尽管在此期间HSF1 mRNA水平确实下降了约25%。这些发现与早期研究一致，表明应激对HSF的调节发生在转录后水平(吴1995).

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 热休克后PC-3细胞hsf基因表达的动态变化。在43°C热休克1小时后，在37°C恢复之前，对PC-3细胞进行动力学研究。在TRIzol试剂中收获热休克后立即裂解或在37°C下回收3、6和24小时后裂解的细胞，并分离总核糖核酸（RNA）。补体RNA（cRNA）的制备、阵列杂交、洗涤、染色和扫描按上述方法进行。Hsf1、hsf2、，和hsf4型表达水平已经通过dChip标准化以彼此可比较。实验重复两次，结果可重复

接下来，我们用免疫印迹法检测了HSP基因在蛋白质水平上的表达(图7A). 必须注意的是，我们在这里测量的是HSP70和HSP90蛋白的聚集水平，因为可用的抗体无法区分所有HSP70基因产物或HSP90α和HSP90-β。与微阵列数据一致，热休克后HSF1和HSF2的水平保持不变，尽管我们确实观察到热休克后0和3小时HSF1的电泳迁移率下降，这是由于热诱导过度磷酸化所致(图7A). HSP70和HSP90在受热后逐渐累积，直到24小时，这与文献中以前的报道再次一致(Landry等人1982年;Li和Werb 1982;Subjeck等人1982年). 有趣的是，因为HSP mRNA水平在6小时左右开始下降(图5)这些实验表明热休克细胞中HSP70和HSP90蛋白可能稳定在蛋白质水平(图7A). 事实上，热休克72小时后HSP水平显著升高，这与热休克细胞中的蛋白质非常稳定一致(Landry等人1982年;Li和Werb 1982;Subjeck等人1982年). 有趣的是，尽管热休克后HSP60 mRNA增加，但在热休克后1至24小时内，HSP60蛋白没有增加，在许多条件下，再次显示mRNA和蛋白质水平不协调(图7A). 由于热休克被设想为与电离辐射结合使用的一种方式，我们研究了这两种方式对DU-145和PC-3细胞24小时点HSP70表达的影响(图7B). 热休克后24小时，HSP70在两种细胞系中均被大量诱导，与电离辐射联合使用对HSP70表达无明显影响(图7B). 这些数据与文献中的大量数据以及我们研究中积累的mRNA表达数据一致，这表明电离辐射并不是HSP表达的强大诱导剂，至少在目前研究的条件下是如此。

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 蛋白质水平上hsf和hsp基因表达的动态变化。（A） 热休克前后PC-3细胞中热休克因子和分子伴侣蛋白的表达。PC-3细胞在37℃下生长或在43℃下热休克60分钟，并在37℃条件下恢复0、3、6和24小时。在改良的放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液中溶解对照细胞和热休克细胞，并对15μg蛋白质进行热休克因子和伴侣蛋白的免疫印迹分析。β-肌动蛋白水平作为负荷控制进行了探讨。（B） HSP70在DU-145和PC-3细胞中的表达，无论是未处理的（c）还是单独电离辐射、单独热休克或热休克加辐射后24小时，如材料和方法中所述

热处理前后裸鼠体内前列腺癌细胞HSP的表达

接下来，我们检测了HSP基因在裸鼠大腿上作为肿瘤异种移植生长的PC-3细胞中的表达。细胞在这个位置生长为一个固体块，用抗人抗体对生长中的PC-3肿瘤切片进行染色，表明肿瘤中97%以上的细胞在0.5毫升的体积下是人类来源的。因此，我们确信，在我们的分析中，大多数mRNAs来源于PC-3，尽管也可能受到小鼠来源的浸润性正常细胞的轻微污染。我们的发现是，与组织培养中的相同细胞系相比，热休克前体内肿瘤中大多数热休克蛋白的相对表达水平显著降低(图8). 这在泛素、HSP28、HSP60和HSP70-4、HSP70-8、HSP105和HSP90的高表达基因中最为明显(图8). HSP表达的这些有趣变化与HSF1、HSF2或HSF4的变化无关，当细胞从体外生长转移到作为肿瘤异种移植物的生长时，这些变化在水平上没有显著变化(图9). HSPs基础水平的改变可能是HSF1翻译后改变或其他因素对肿瘤内部环境作出反应的结果(图9).

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 比较裸鼠大腿中组织培养或体内肿瘤异种移植生长的PC-3细胞中27个组成性热休克蛋白基因的信使核糖核酸（mRNA）水平。如上所述，在TRIzol试剂中采集组织培养细胞中的核糖核酸（RNA），从处死的小鼠中切除肿瘤，在液氮中快速冷冻，切碎，并按照材料和方法中所述准备RNA分离。如上所述进行总RNA分离、互补RNA（cRNA）制备、阵列杂交、洗涤、染色和扫描。HSP基因的表达水平已经如上所述被标准化。实验重复两次，结果可重复

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 无论是在组织培养中生长的PC-3细胞还是在裸鼠大腿体内作为肿瘤异种移植生长的PC-2细胞中的Hsf信使核糖核酸（mRNA）水平。如上所述，在TRIzol试剂中收集组织培养细胞，并从处死的小鼠中切除肿瘤，在液氮中快速冷冻，切碎，并按照材料和方法中的描述准备RNA分离。按照材料和方法进行热休克和辐射治疗。如上所述进行总RNA分离、互补RNA（cRNA）制备、阵列杂交、洗涤、染色和扫描。HSP基因的表达水平如上所述进行了标准化。实验重复两次，结果可重复

然而，当细胞或肿瘤在37°C恢复前暴露于相同的热休克条件下时，当PC-3细胞以单层或裸鼠移植瘤的形式生长时，HSP的诱导模式非常相似(图10). 在体外和体内生长的细胞中观察到HSP40-1、HSP70-1A、HSP70-1B、HSP70%B′和HSP105的大量诱导(图10). 由于HSP28蛋白的基础水平较高，因此在本实验中HSP28的相对增加较低。因此，体内生长似乎抑制了许多HSP家族成员的组成性表达，但并没有阻止细胞产生强烈热休克反应的能力(图10). 热休克并未引起组织培养或肿瘤中HSF mRNA水平的任何显著变化，这与文献中大多数数据一致，这些数据表明热休克对HSF的翻译后调节(图9). 同样，无论是在单层还是在体内肿瘤中生长的PC-3细胞中，HSF1蛋白水平都是相似的，在体外或体内热休克恢复期（24小时后）的细胞中没有明显变化(图11). 与微阵列研究一致，肿瘤中生长的PC-3细胞中HSP70和HSP90蛋白水平降低(图8). 然而，热休克恢复后的PC-3肿瘤细胞中HSP70和HSP90水平均被诱导(图11)，再次与mRNA数据一致(图10).

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 组织培养的PC-3细胞与裸鼠腿部移植瘤体内生长的等基因PC-3细胞热休克后HSP信使核糖核酸（mRNA）表达的比较。按照材料和方法中的描述，在循环水浴中对体外生长或作为肿瘤异种移植的PC-3细胞进行热休克（43°C，1小时）处理，然后进行2小时恢复。对照细胞在37°C培养箱中培养，对照肿瘤未经治疗。如上所述，在TRIzol试剂中收集组织培养细胞，并从处死的小鼠中切除肿瘤，在液氮中快速冷冻，切碎，并按照材料和方法中的描述准备RNA分离。基因表达水平已通过dChip标准化，以相互比较。热休克后HSP基因的相对基因表达谱显示为其对应的非热休克对照的表达水平的倍数。实验重复两次，结果可重复

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 HSF1和HSP蛋白在组织培养中生长的PC-3细胞或裸鼠异种移植中的表达。然后，将体外生长或作为肿瘤异种移植的PC-3细胞保持在非应激条件下作为对照（c），或在循环水浴中进行热休克（43°c，1小时）处理，然后恢复24小时，以允许HSP蛋白表达。然后提取蛋白质，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并用HSP90、HSP70和HSF1抗体进行免疫印迹分析。将抗人β-肌动蛋白作为均匀加载的对照。实验重复两次，结果可重复

最后，为了检测组织培养或人类异种移植物中前列腺癌细胞对热休克的相对敏感性，我们在类似剂量的热休克（43°C下1小时）后通过TUNEL染色检测凋亡。如我们早期的研究所示，热休克导致细胞凋亡缓慢发展，在热后48小时达到约5%的人群(图12). 对PC-3肿瘤进行相同剂量的热休克会导致细胞凋亡率大幅增加，到48小时时达到约80-90%(图12). 尽管细胞凋亡的程度不同，但在体外生长和热休克后的肿瘤中，细胞凋亡发展的时间过程是相似的(图12).

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 体外和肿瘤中暴露于高温的PC-3细胞的凋亡指数。将小鼠的细胞和肿瘤暴露于43°C的高温下60分钟，并在治疗后0-96小时通过TUNEL测定法测定细胞凋亡指数，如材料和方法中所述。肿瘤石蜡切片TUNEL分析测定肿瘤细胞凋亡指数。各部分得分为“盲”和两份。每个时间点总共至少有200个细胞被评分。实验重复两次，结果一致

讨论

这里描述的实验在很大程度上支持了HSP基因表达和HSF活性及表达在癌症晚期增加的观点(图4). 研究中最引人注目的发现是在恶性前列腺癌细胞系中HSF1和HSP水平升高(图4). 重要的是，HSF和HSP水平的这些变化无法从HSF的微阵列研究中预测(图3)和HSP(图1)mRNA水平。转移性前列腺癌细胞系中观察到的HSF水平升高，尤其可能是由于mRNA翻译或蛋白质周转（或两者）的调节改变所致(图3和​和4）。4). 虽然我们目前尚不清楚其机制，但有一个候选因素可能是转移细胞系中蛋白质体的差异活性：HSF1和HSF2都是蛋白质体降解的靶点(Mathew等人1998年). 尽管生长条件下不同程度恶性肿瘤细胞之间的HSP表达存在差异，但应激导致所有细胞中HSP40-1、HSP70-1A、HSP70-1B、HSP7-6（HSP70B）、DNA-J2样和HSP105的表达和激活发生重大变化(图2). 即使在HSF1和HSF2表达最低的LnCap细胞中，也可以观察到热诱导HSP70蛋白的表达(图4). 有趣的是，我们观察到最小诱导热休克蛋白70BLnCap细胞中的基因：因为热休克蛋白70B众所周知，启动子几乎完全是由应激通过其启动子中的HSE诱导的，研究结果可能表明HSP70诱导替代HSF1激活的机制可能在LnCap细胞中起作用(Schiller等人1988年). 研究表明，癌症患者HSP表达增加表明，多种治疗方式对治疗的反应较差，表明HSP表达除了参与恶性进展的机制外，还与治疗耐药性的形成有关(Ciocca等人1993年,Cornford等人，2000年;山本等人2001;Ciocca和Vargas Roig，2002年;梅斯等人2002年). 此外，与非选择性对照组相比，为增强转移能力而选择的LnCap-derived细胞亚群显示HSF1、HSP70和HSP27表达水平升高(Hoang等人2000). 这可能是非常重要的，因为我们的研究表明，转移不良的亲代LnCap细胞中HSF1和HSP水平最低(图1和​和4）。4). 先前的研究也表明，HSP70表达升高发生在胚胎干细胞永生化的早期阶段(Ravagnan等人2001). 我们不得不使用永生化前列腺上皮细胞作为正常对照，并且可能错过了永生化过程中HSP表达的早期变化。

动力学研究表明(图5-7)，HSPs除了转录激活外，还被应激在许多调节水平上激活，这些调节水平可能包括应激诱导的mRNA稳定、差异翻译和蛋白质稳定(希基和韦伯1982;Zhao等人2002). 在正常温度下，HSF1活性和HSP表达似乎受到许多途径的差异调节，但当暴露于热休克时，这些调节在很大程度上独立于此类调节，这超越了构成调节，并允许迅速诱导这种紧急反应。

体内PC-3细胞作为肿瘤异种移植物的生长伴随着组成性HSP表达的显著降低(图8和​和11）。11). HSP表达降低是伴随PC-3细胞从组织培养中的单层生长转变为体内肿瘤生长的基因表达全局转换的一部分（D.Tang和S.K.Calderwood，正在准备中）。许多报告表明，随着细胞作为肿瘤生长，细胞特性发生了广泛的变化，这些特性可能反映了基因表达模式的重塑。这些变化可能反映了对肿瘤微环境的化学性质的适应以及体内肿瘤生长过程中细胞间相互作用的改变。我们的研究还表明，尽管上述其他基因表达发生了全球重排，但体内生长的PC-3细胞中仍保持完整的热休克反应的显著稳定性(图10和​和1111).

我们的研究和其他研究表明，癌症中HSF1和HSP水平的升高及其与预后不良和治疗反应不良的关系表明，在癌症治疗中以HSP为靶点的策略。例如，用HSP70反义寡核苷酸治疗，可以单独引起肿瘤细胞凋亡，并可以与热休克协同杀伤细胞(Jones等人2004). 事实上，已有研究表明，用槲皮素（一种抑制HSF1激活的生物类黄酮药物）或用针对HSP70 mRNA的反义寡核苷酸拮抗热诱导HSP的表达，可以进一步提高PC-3细胞体外热诱导凋亡的敏感性，并在体内导致肿瘤退行(Asea等人2001年,Lepchammer等人2002;Jones等人2004)（A.Asea等人，个人通信）。因此，针对癌细胞中HSP表达或功能的策略可能被指出。这种策略可能被证明特别有效，因为组成性HSP在肿瘤中的表达降低，这可能与热量增加对PC-3肿瘤细胞的杀伤有关(图12).

致谢

我们感谢波士顿热疗项目的成员：欧文·卡普兰、马克·赫尔维茨、迈克尔·谢尔曼和库列夫·海宁，感谢他们的道义支持和批判性投入。我们感谢哈佛JCRT基金会的大力支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院CA47407、CA31303、CA50642和CA77465的资助。

参考文献

  • Asea A、Ara G、Teicher BA、Stevenson MA、Calderwood SK。黄酮类药物槲皮素对人体前列腺肿瘤体内高热反应的影响。国际热疗杂志。2001;17:347–356.0265-6736（2001）017<0347:EOTFDQ>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Baker RT，Board PG。人类泛素基因家族：一个基因的结构和来自Ub B亚家族的假基因。核酸研究。1987;15:443–463.0305-1048（1987）015<0443：THUGFS>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bhattacharyya T、Karnezis AN、Murphy SP、Hoang T、Freeman BC、Phillips B、Morimoto RI。人线粒体hsp70的克隆和亚细胞定位。生物化学杂志。1995;270:1705–1710.0021-9258（1995）270<1705：现金>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Beckmann RP、Mizzen LA、Welch WJ。hsp70与新合成蛋白质的相互作用；蛋白质折叠和组装的含义。科学。1990;248:850–854.0193-4511（1990）248<0850:IOHWNS>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Blagosklonny MV.Re：热休克反应和分子伴侣在肿瘤发生和细胞死亡中的作用。美国国家癌症研究所。2001;93:239–240.0027-8874（2001）093<0239:RROTHS>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Bonnycastle LL，Yu CE，Hunt CR，Trask BJ，Clancy KP，Weber JL，Patterson D，Schellenberg GD.人类14号染色体热休克蛋白基因（HSPA2）的克隆、测序和定位基因组学。1994;23:85–93.0888-7543（1994）023<0085:CSAMOT>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Buchner J.Hsp 90&Co.——折叠控股公司。TIBS公司。1999;24:136–142.0376-5067（1999）024<0136:HCHFF>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Carper SW，Rocheleau TA，Storm FK。人类热休克蛋白HSP27的cDNA序列。核酸研究。1990;18:6457.0305-1048（1990）018<6457:CSOAHH>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Carroll AG、Voeller HJ、Sugars L、Gelmann EP。三种人前列腺癌细胞系p53癌基因突变。前列腺。1993;23:123–134.0270-4137（1993）023<0123：波密思>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Chellaiah A、Davis A、Mohanakumar T。大肠杆菌DNAJ热休克蛋白独特人类同源物的克隆。Biochim生物物理学报。1993;1174:111–113.0006-3002（1993）1174<0111:COAUHH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Chen JJ、McNealy DJ、Dalal S、Andophy EJ。编码人伴侣蛋白10的cDNA的分离、序列分析和鉴定。Biochim生物物理学报。1994;1219:189–190.0006-3002（1994）1219＜0189：ISAACO＞2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Ciocca DR、Clark GM、Tandon AK、Fuqua SA、Welch WJ、McGuire WL。腋窝淋巴结阴性乳腺癌患者的热休克蛋白hsp70：预后意义。美国国家癌症研究所。1993;85:570–574.0027-8874（1993）085<0570:HSPHIP>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Ciocca DR，Vargas Roig LM。Hsp27作为癌症的预后和预测因子。Prog分子亚细胞生物学。2002;28:205–218.0079-6484（2002）028<0205:HAAPAP>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • 宾夕法尼亚州康福德、多德森AR和帕森斯KF。等人2000热休克蛋白表达独立预测前列腺癌的临床预后.癌症研究.60:7099–7105. [公共医学][谷歌学者]
  • Domanico SZ，DeNagel DC，Dahlseid JN，Green JM，Pierce SK。编码肽结合蛋白74的基因克隆表明它是热休克蛋白70家族的一个新成员。分子细胞生物学。1993;13:3598–3610.0270-7306（1993）013<3598：COTGEP>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Eisen MB、Spellman PT、Brown PO、Botstein D.全基因组表达模式的聚类分析和显示。美国国家科学院院刊。1998;95:14863–14868.0027-8424（1998）095<14863:CAADOG>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fathallah DM，Cherif D，Dellagi K，Arnaout MA。从B细胞系克隆新的人类hsp70并将其分配到5号染色体。免疫学杂志。1993;151:810–813.0022-1767（1993）151<0810:MCOANH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Froesch BA、Takayama S、Reed JC。BAG-1L蛋白增强雄激素受体功能。生物化学杂志。1998;273:11660–11666.0021-9258（1998）273<11660:BPEARF>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Gabai VL、Merinin AB、Yaglom JA、Volloch VZ、Sherman MY。hsp70在应激激酶JNK调节中的作用：在凋亡和衰老中的意义。FEBS信函。1998;438:1–4.0014-5793（1998）438＜0001：罗广＞2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • 乔治奥波利斯C，韦尔奇WJ。主要热休克蛋白作为分子伴侣的作用。《细胞生物学年鉴》。1993;9:601–634.0743-4634（1993）009<0601:ROTMHS>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Gething MJ，Sambrook J.细胞中的蛋白质折叠。自然。1992;355:33–45.0028-0836（1992）355<0033:PFITC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Grammatikakis N、Vulture A、Ramana CV、Siganou A、Schweinfest CW、Watson DK、Raptis L。Hsp90N是Hsp90家族的新成员，在信号转导和肿瘤转化中的作用。生物化学杂志。2002;277:8312–8320.0021-9258（2002）277<8312:TROHAN>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Grossmann ME，Huang H，Tindall DJ。雄激素难治性前列腺癌中的雄激素受体信号。JNCI公司。2001;93:1687–1697.0027-8874（2001）093<1687:ARSIAP>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Hansen RK、Parra I、Lemieux P、Oesterreich S、Hilsenbeck SG、Fuqua SA。Hsp27过度表达抑制阿霉素诱导的人类乳腺癌细胞凋亡。乳腺癌研究治疗。1999;56:187–196.0167-6806（1999）056<0187:HOIDAI>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Hata M，Okumura K，Seto M，Ohtsuka K。人类热休克蛋白40（Hsp40）基因（HSPF1）的基因组克隆及其对19p13.2的染色体定位。基因组学。1996;38:446–449.0888-7543（1996）038<0446:GCOAHH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • He H、Soncin F和Grammatikakis N.等人，2003年应激期间热休克因子2A的高表达刺激HSF1诱导的转录.生物化学杂志.278:35465–35475. [公共医学][谷歌学者]
  • Henics T、Nagy E、Oh HJ、Csermely P、von Gabain A、Subjeck JR。哺乳动物HSP70和HSP110蛋白与参与mRNA稳定性的RNA基序结合。生物化学杂志。1999;274:17318–17324.0021-9258（1999）274<17318:MHAHPB>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Hickey E，Weber LA，1982年热休克mRNA在HeLa细胞中的优先翻译。输入：热冲击；从细菌到人类，ed Schlesinger M，Ashburner M，Tissieres A.冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，199-206。[谷歌学者]
  • Hoang AT，Huang J，Rudra-Gangly N，Zheng J，Powell WC，Rabindran SK，Wu C，Roy-Burman P。人类热休克转录因子1（HSF1）与前列腺癌之间的新关联。《美国病理学杂志》。2000;156:857–864.0002-9440（2000）156<0857:ANABTH>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hoe KL、Won M和Chung KS。等人，1998年人肝脏DnaJ-like热休克蛋白40（Hsp40）新成员的分离.Biochim生物物理学报.1383:4–8. [公共医学][谷歌学者]
  • Horoszewicz JS、Leong SS、Kawinski E、Karr JP、Rosenthal H、Chu TM、Mirand EA、Murphy GP。人类前列腺癌LNCaP模型。癌症研究。1983;43:1809–1818.0008-5472（1983）043<1809:LMOHPC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Hunt C，Morimoto RI。通过与人类hsp70核苷酸序列的比较揭示的真核hsp70基因的保留特征。美国国家科学院院刊。1985;82:6455–6459.0027-8424（1985）082<6455：CFOEHG>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ikegawa S，Sudo K，Okui K，Nakamura Y。人类colligin-2基因（CBP2）的分离、鉴定和染色体分配细胞遗传学细胞遗传学。1995;71:182–186.0301-0171（1995）071<0182:ICACAO>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Iwaki A、Nagano T、Nakagawa M、Iwaki T、Fukumaki Y。编码α-晶体蛋白/小hsp家族新成员的基因的鉴定和表征，该基因与α-B-晶体蛋白基因紧密相连。基因组学。1997;45:386–394.0888-7543（1997）045<0386:IACOTG>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Iwaki T，Iwaki A，Goldman JE。氧化肌纤维中的αB-晶体蛋白及其在碎红纤维中的积累：人类骨骼肌的比较免疫组织化学和组织化学研究。神经病理学学报（柏林）1993;85:475–480.0001-6322（1993）085<0475：ABIOMF>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Jindal S、Dudani AK、Singh B、Harley CB、Gupta RS。与细菌和植物伴侣蛋白以及65千道尔顿分枝杆菌抗原同源的人类线粒体蛋白的一级结构。分子细胞生物学。1989;9:2279–2283.0270-7306（1989）009<2279:PSOAHM>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jones EL、Zhau MJ、Stevenson MA和Calderwood SK.2004年70千道尔顿热休克蛋白是前列腺癌细胞凋亡的抑制剂.国际J热疗，新闻界。[公共医学][谷歌学者]
  • Kaighn ME、Narayan KS、Ohnuki Y、Lechner JF、Jones LW。人前列腺癌细胞系的建立和特征分析。投资Urol。1979;17:16–23.0021-0005（1979）017<0016:EACOAH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Lam WY，Wing Tsui SK，Law PT，Luk SC，Fung KP，Lee CY，Waye MM。编码小分子热休克蛋白家族新成员mHSPL27的人心脏cDNA的分离和鉴定。Biochim生物物理学报。1996;1314:120–124.0006-3002（1996）1314<0120:IACOAH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Landry J、Bernier D、Chretien P、Nicole LM、Tanguay RM、Marceau N。耐热性发展和衰退过程中热休克蛋白的合成和降解。癌症研究。1982;42:2457–2461.0008-5472（1982）042<2457:SADOHS>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Lechpammer S、Asea A、Mallick R、Zhong R、Sherman MY、Calderwood SK。高通量筛选程序中检测热疗增敏剂的XTT四氮唑盐基分析方法的开发。国际热疗杂志。2002;18:203–215.0265-6736（2002）018<0203:DOAXTS>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Leung TK、Rajendran MY、Monfries C、Hall C、Lim L.人类热休克蛋白家族。新型热诱导型hsp70（hsp70b'）的表达及其cDNA和基因组DNA的分离。生物化学杂志。1990;267:125–132.0264-6021（1990）267<0125:THHSPF>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Li C、Wong WH。寡核苷酸阵列的基于模型的分析：表达指数计算和离群值检测。美国国家科学院程序。2001;98:31–36.0027-8424（2001）098<0031:MAOOAE>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Li GC，Hahn GM。提出的耐热性操作模型。癌症研究。1981;40:4501–4508.0008-5472（1981）040<4501:APOMFT>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Li GC，Werb Z.中国仓鼠成纤维细胞热休克蛋白合成与耐热性发展的相关性。美国国家科学院程序。1982;79:3218–3222.0027-8424（1982）079<3218:CBTSOH>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lindquist S，Craig EA。热休克蛋白。《遗传学年鉴》。1988;22:631–637.0066-4197（1988）022<0631：THSP>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Madamanchi NR，Li S，Patterson C，Runge MS。凝血酶通过JAK-STAT途径调节血管平滑肌细胞生长和热休克蛋白。生物化学杂志。2001;276:18915–18924.0021-9258（2001）276<18915：TRVSMC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Mathew A，Mathur SK，Morimoto RI。热休克反应和降解：泛素蛋白酶体途径对hsf2的调节。分子细胞生物学。1998;18:5091–5098.0270-7306（1998）018<5091:HSRADR>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mese H、Sasaki A、Nakayama S、Yoshioka N、Yoshahama Y、Kishimoto K、Matsumura T。热休克蛋白27（HSP27）在口腔鳞癌患者中的预后意义。Oncol代表。2002;9:341–344.1021-335X（2002）009<0341:PSOHSP>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Milner CM，Campbell RD。三个MHC-连锁HSP70基因的结构和表达。免疫遗传学。1990;32:242–251.0093-7711（1990）032<0242:SAEOTT>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Nagase T、Seki N和Ishikawa K.等人，1996年未知人类基因编码序列的预测。六、 通过对KG-1细胞株和大脑cDNA克隆的分析推导出80个新基因（KIAA0201-KIAA0280）的编码序列.DNA研究.三:321–329. 341–354. [公共医学][谷歌学者]
  • Nakai A、Tanabe M、Kawazoe Y、Inazawa J、Morimoto RI、Nagata K.HSF4，人类热休克因子家族的新成员，缺乏转录激活物的特性。分子细胞生物学。1997;17:469–481.0270-7306（1997）017<0469:汉莫>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Netzer WF，Hartl FU。细胞溶质中的蛋白质折叠：伴侣蛋白依赖和非依赖机制。TIBS公司。1998;23:68–74.0376-5067（1998）023<0068:PFITCC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Rabindran SK，Giorgi G，Clos J，Wu C.人类热休克因子HSF1的分子克隆和表达。美国国家科学院程序。1991;88:6906–6910.0027-8424（1991）088<6906:MCAEOA>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ravagnan L、Gurbuxani S和Susin SA等人，2001年热休克蛋白70拮抗凋亡诱导因子.Nat细胞生物学.三:839–843. [公共医学][谷歌学者]
  • Rebbe NF、Hickman WS、Ley TJ、Stafford DW和Hickman S.人类90-kDa热休克蛋白基因的核苷酸序列和调控。生物化学杂志。1989;264:15006–15011.0021-9258（1989）264<15006:NSAROA>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Ricaniadis N、Kataki A、Agnantis N、Androulakis G、Karakousis CP。恶性黑色素瘤患者HSP-70、c-myc和HLS-DR表达的长期预后意义。欧洲外科肿瘤杂志。2001;27:88–93.0748-7983（2001）027<0088:LPSOHC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Schiller P、Amin J、Ananthan J、Brown ME、Scott WA、Voellmy R。Cis公司-参与调节人类HSP70基因表达的作用元件。分子生物学杂志。1988;203:97–105.0022-2836（1988）203<0097:CEIITR>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Schuetz TJ，Gallo GJ，Sheldon L，Tempst P，Kingston RE。HSF2基因cDNA的分离；人类有两种热休克因素的证据。美国国家科学院程序。1991;88:6911–6915.0027-8424（1991）088<6911:IOACFE>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Song HY、Dunbar JD、Zhang YX、Guo D、Donner DB。鉴定与hsp90同源的蛋白，该蛋白结合1型肿瘤坏死因子受体。生物化学杂志。1995;270:3574–3581.0021-9258（1995）270<3574:IOAPWH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Sorger PK，佩勒姆HRB。酵母热休克因子是一种必需的DNA结合蛋白，具有温度依赖性磷酸化作用。单元格。1988;54:855–864.0092-8674（1988）054<0855:YHSFIA>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Stephanou A，Latchman DS。STAT家族转录因子对热休克蛋白基因的转录调控。基因表达。1999;7:311–319.1052-2166（1999）007<0311:TROTHS>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stone KR、Mickey DD、Wunderli H、Mickel GH、Paulson DF。人前列腺癌细胞系（DU145）的分离国际癌症杂志。1978;21:274–281.0020-7136（1978）021<0274:IOAHPC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Strik HM、Weller M、Frank B、Hermisson M、Deininger MH、Dichgans J、Meyermann R。人脑胶质瘤中热休克蛋白的表达。抗癌研究。2000;20:4457–4462.0250-7005（2000）020<4457:HSPEIH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Subjeck JR、Sciandra JJ、Johnson RJ。热休克蛋白与耐热性；诱导动力学的比较。英国无线电杂志。1982;55:579–584.0007-1285（1982）055<0579:HSPAAC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Tavaria M，Gabriele T，Kola I，Anderson RL。人类Hsp70家族的搭便车指南。细胞应激伴侣。1996;1:23–28.1466-1268（1996）001<0023:AHGTTH>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ting J，Lee AS。编码78000道尔顿葡萄糖调节蛋白及其假基因的人类基因：结构、保护和调节。DNA。1988;7:275–286.[公共医学][谷歌学者]
  • Van Molle W、Wielockx B、Mahieu T、Takada M、Taniguchi T、Sekikawa K、Libert C.HSP70可防止TNF诱导的致命性炎症休克。免疫。2002;16:685–695.1074-7613（2002）016<0685:HPATLI>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Voellmy R.高等真核生物应激信号的转导和热休克/应激蛋白表达的转录调控机制。Crit Rev真核基因表达。1994;4:357–401.1045-4403（1994）004<0357:TOTSSA>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Volloch VZ，Sherman MY。Hsp72的致癌潜力。致癌物。1999;18:3648–3651.0950-9232（1999）018<3648:OPOH>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • 王和林、卢德伟。子宫颈小细胞肺癌中人乳头瘤病毒DNA检测及p16、Rb和p53蛋白表达。美国外科病理学杂志。2004;28:901–908.0147-5185（2004）028<0901:DOHPDA>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Weijerman PC、Konig JJ、Wong ST、Niesters HG、Peehl DM。利用人乳头瘤病毒18型DNA对正常和恶性来源的人前列腺上皮细胞进行脂质作用介导的永生化。癌症研究。1994;54:5579–5583.0008-5472（1994）054<5579:LIOHPE>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Wodica L，Dong H，Mittamann M，Ho MH，Lockhart DJ。酿酒酵母的全基因组表达监测。国家生物技术。1997;15:1359–1367.1087-0156（1997）015<1359:GEMISC>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Wu C.热休克转录因子：结构和调控。Ann Rev细胞开发生物学。1995;11:441–469.1081-0706（1995）011<0441:HSTFSA>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Yamamoto K、Okamoto A、Isonishi S、Ochiai K、Ohtak Y。热休克蛋白27在顺铂耐药的人卵巢肿瘤细胞系中上调，并与顺铂耐药相关。癌症快报。2001;168:173–181.0304-3835（2001）168<0173:HSPWUI>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Yamazaki M、Akaogi K、Miwa T、Imai T、Soeda E、Yokoyama K。人类外周血淋巴细胞90kDa热休克蛋白全长cDNA的核苷酸序列。核酸研究。1989;17:7108.0305-1048（1989）017<7108:国家自然科学基金委>2.0.CO；2[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yano M、Naito Z、Yokoyama M、Shiraki Y、Ishiwata T、Inokuchi M、Asano G。人类乳腺癌中hsp90和cyclin D1的表达。癌症快报。1999;137:45–51.0304-3835（1999）137<0045:EOHACD>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
  • Zhao M，Tang D，Lechpamer S，Hoffman A，Asea A，Stevenson MA，Calderwood SK。双链RNA依赖性蛋白激酶（pkr）在应激过程中对耐热性、HSP70的积累和含ARE的HSP70 mRNA的稳定至关重要。生物化学杂志。2002;277:44539–44547.0021-9258（2002）277<44539:DSRPKP>2.0.CO；2 [公共医学][谷歌学者]
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