国际癌症杂志。2023年5月；62(5): 59.
YY1/miR-HCC2/BAMBI轴对肝癌细胞干细胞的调节作用
天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津300070
通讯作者。2022年10月5日收到；2023年2月28日验收。
摘要
肿瘤干细胞在肝癌复发和转移中起着关键作用。因此，本研究评估了干细胞因子表达的新调节因子，以确定可以靶向肝癌干细胞的新治疗策略。进行深度测序以确定肝癌组织中特异性改变的新microRNA（miRNAs）。通过逆转录定量PCR和western blotting检测干细胞标记的表达水平。球体形成分析和流式细胞术用于评估肿瘤球体形成能力和评估分化簇90的人群+细胞。肿瘤异种移植物分析用于评估致瘤性、转移性和干性体内进行生物信息学分析和增强型绿色荧光蛋白报告分析或荧光素酶报告分析，以确定miR-HCC2及其上游转录因子的直接靶点。MiR-HCC2强烈促进肝癌细胞的癌干细胞样特性在体外; 它也有助于致瘤性、转移和干细胞体内骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物是miR-HCC2的直接靶点，激活Wnt/β-catenin信号通路以促进肝癌细胞的干细胞生成。转录因子YY1与miR-HCC2的启动子结合并激活其转录。本研究证明了miR-HCC2在肝癌干细胞诱导中的重要性，为肝癌转移和复发提供了新的见解。
关键词：肝癌、miR-HCC2、干细胞、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物YY1
介绍
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一；由于化疗耐药和经常复发，其死亡率（~8.3%）很高(1,2). 越来越多的证据表明，肝癌的发生和发展是由肿瘤源性肿瘤干细胞（CSC）或肿瘤起始细胞的一小部分异质性群体驱动的(三,4). 原发肿瘤中的CSC具有自我更新和生成特定分化细胞的能力；因此，CSC在肿瘤发生、复发和转移中起着关键作用(5-7). 肝CSC的特征是表达特异性细胞表面标记物，如分化簇（CD）13、CD24、CD90、CD133、上皮细胞粘附分子（EpCAM）、CD44和醛脱氢酶，以及与干细胞相关的转录因子，如纳米同源盒（nanog）、性别决定区Y-box 2（Sox2）、，c-Myc和八聚体结合转录因子4（Oct4）(8-14). 然而，肝脏CSC形成的分子机制，包括关键基因的调控，尚未阐明。有必要评估干细胞相关因子的新调节因子，以确定针对肝CSC的新治疗策略。MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，在转录后水平调节基因表达模式；这种调节通常涉及与靶mRNA的3′-非翻译区（UTR）结合(15). 此前有报道称，miRNAs在肝癌中起重要作用(16)尤其是在肝癌细胞干细胞的调节方面(17-19). 因此，肝脏CSC特异性miRNA可能是肝癌治疗中有用的靶点。
骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（BAMBI）是一种跨膜蛋白，与转化生长因子-β家族I型受体的胞外结构域具有高度相似性(20,21). BAMBI被认为是细胞增殖和分化的重要调节因子，可增强某些细胞类型中Wnt/β-catenin信号传导(22-25). Wnt/β-catenin信号通路的激活在CSC的初始生长和维持中起重要作用；在这个过程之后，原发肿瘤区域持续生长，上皮细胞向间充质细胞转化，CSC再激活，从而导致肿瘤生长和转移(11,26-28).
材料和方法
人类肝癌组织标本采集
从中山大学肿瘤中心采集了13例肝癌标本。所有癌症均经先前的病理分析证实。在样本分析之前，每个患者都获得了书面知情同意书，天津医科大学伦理委员会批准了本研究的伦理批准（批准号：TMUhMEC2014004）。有关样本的信息见表SI.
基于Solexa的深度测序和数据分析
根据制造商的协议，使用mirVana miRNA分离试剂盒（目录号AM1560；Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从六个肝癌标本中提取小RNA（<200 bp）。将样品送往华大基因（中国深圳）进行深度测序，并使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司）和StepOnePlus实时PCR系统（应用生物系统公司，赛默飞世尔科学公司）进行定量和鉴定。总共1个µg RNA（≥30 ng/µl） 根据制造商的协议，使用TruSeq small RNA Sample Prep Kit版本2（目录号RS-122-2001和RS-122-2002；Illumina，Inc.）生成小RNA测序库。使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司）对文库进行验证，以检查其大小和纯度，并使用EvaGreen进行定量PCR®染料（Jena Bioscience GmbH）验证浓度。最终文库的加载浓度为2 pM。使用Illumina HiSeq 2000（Illumiana，Inc.）和TruSeq V3-SBS-HS试剂盒（200个循环；目录号FC-401-3001；Illuminia Inc.）进行测序，以产生50 bp的单端读数。Bowtie2（版本2.2.9；http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)，miRBase（版本22；http://mirbase.org/)、和miRDeep2（版本2.0.0.8；https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2)用于分析数据(29). 有关样本的详细信息见表SI.
细胞培养和转染
肝癌HepG2、Hep3B和Huh7细胞系购自中国科学院类型培养库，并通过短串联重复序列分析鉴定。Huh7细胞保存在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中，HepG2和Hep3B细胞保存在含有10%胎牛血清（Gibco；Thermo-Fisher科学，Inc.）、20 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸、，100单位/ml青霉素和100 g/ml链霉素。细胞在37°C和5%CO的增湿大气中培养2根据制造商的方案，本研究中的所有转染均使用Lipofectamine™2000试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。
向量构造
使用Taq DNA聚合酶（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）通过PCR扩增含有miR-HCC2或加扰miRNA（包括miR-HCC2的前体序列或加扰序列）的质粒，并将其插入BamHI和EcoRI位点之间的pcDNA3载体（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中。此后，miR-HCC2-过表达质粒和负干扰miRNA控制质粒被称为miR-HCC2和干扰miRNA。使用的热循环条件如下：在95°C下预先纯化3分钟，然后在94°C下进行32个变性周期30秒，在58°C下退火45秒，在72°C下伸长60秒，并在72°C下保持5分钟，以使所有产品DNA完全伸长。引物序列如下：初级转录物（pri）-miR-HCC2意义：5′-CGG-GAT CCG GGT TTG-GAG AAT AG-3′和反义：5′-GGA ATT CGC CCC TCT ACC ACC-3；干扰miRNA意义：TGA TTC TAA GTA TAG CAG ACG TAG GCA GAT GGA GCT T和反义：AAG CTC CAT CTG CCT ACG TCT ATA CTT AGA ATC A。为了击倒miR-HCC2，合成了miR-HCC2[反义寡核苷酸（ASO）-miR-HCC2]特异的2′-O-甲基修饰反义寡核苷酸，以及干扰控制寡核苷酸（ASO-NC），从上海基因制药有限公司购买。
通过将寡核苷酸在95°C下退火5 min，在室温下退火1 h，并将其克隆到位于BamHI和EcoRI位点之间的pcDNA3-EGFP载体（天津赛尔生物科技有限公司）中，构建了含有miR-HCC2或其突变体靶点的BAMBI野生型3′UTR。
根据制造商的协议，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.）从Huh7细胞中提取总RNA。RNA（2µg） 根据制造商的协议，使用RevertAid RT逆转录试剂盒（目录号K1691；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将其逆转录成互补DNA（cDNA）。为了构建BAMBI和YY1的过表达载体，通过PCR从Huh7细胞的cDNA中扩增出它们各自的编码序列，并插入到BamHI和XhoI位点之间的pcDNA3载体中。为了构建沉默（shR）载体，对合成的寡核苷酸进行退火，并将其连接到BamHI和HindIII位点之间的pSilencer2.1/neo载体（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。
为了产生miR-HCC2启动子报告子构建体，扩增Huh7细胞基因组DNA中相应的miR-HCC2-溴代1、miR-HCC2-溴代2和miR-HCC2-溴代3序列，然后将产物插入pGL3碱性载体（Promega Corporation）的KpnI和BglII位点之间。将miR-HCC2启动子（miR-HCC2promoter2-mut1和miR-HCCO2 promotor2-mut2）中YY1结合位点突变的片段克隆到pGL3-Basic载体中。所有结构均由Genewiz，Inc.使用Sanger测序进行确认。引物和寡核苷酸由安徽通用生物有限公司合成，其序列显示在表SII和SIII.
稳定转染细胞系的建立
1×106Huh7和Hep3B细胞转染4µg表达miR-HCC2的控制载体或质粒，并在37°C下培养48小时，然后使用800µg/ml G418和2 mM/l谷氨酰胺持续4周。随后，使用200µg/ml G418和2 mM/l谷氨酰胺。所有培养物均在37°C下，在含5%CO的湿润环境中培养2.
RNA提取和逆转录定量PCR（RT-qPCR）
根据制造商的协议，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.）从组织样品和细胞中提取总RNA。RNA（2µg） 使用Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶（Promega公司）在42°C下逆转录60分钟，70°C下15分钟，然后在冰上逆转录成互补DNA。随后使用SYBR Premix Ex Taq™试剂盒（Promega Corporation）进行qPCR扩增，如下所示：95℃下3分钟，然后在95℃下40个周期变性10秒，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸30秒。使用U6小核RNA和β-肌动蛋白作为内部对照。相对mRNA表达使用2-ΔΔCq方法(30). 所有引物的详细序列见表SIII.
增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告分析
为了验证miR-HCC2对BAMBI 3′UTR的靶向作用，使用Lipofectamine™2000（Invitrogen；赛默飞世保科学的的，根据制造商的协议。然后将转染细胞在37°C的湿度为5%CO的环境中培养48小时2共转染红色荧光蛋白（RFP）表达载体pDsRed2-N1（20ng；Takara Bio USA，Inc.）进行正常化。转染后48小时，用F-4500荧光分光光度计（日立有限公司）测量EGFP和RFP的荧光强度。
荧光素酶报告分析
生物信息学分析用于使用promoter 2.0（2.0版；丹麦科技大学卫生技术系）预测miR-HCC2启动子，以及使用hTF靶点预测潜在转录因子结合位点(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTF目标#!/). 然后将细胞接种到48周的平板中，并根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.）转染带有/不带有突变YY1结合位点的miR-HCC2启动子报告载体。根据制造商的协议，使用双荧光素酶检测试剂盒（目录号E1910，Promega Corporation）在转染后48小时测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚每个孔中的荧光素酶活性。pGL3-Basic载体用作阴性对照。pGL3-control vector（阳性对照）包含SV40启动子和增强子序列，据报道，这些序列可在多种哺乳动物细胞中导致luc+的强表达，并在双核糖核酸酶检测中作为阳性对照（Promega Corporation）(31).
细胞分馏分析
根据制造商的协议，使用NE-PER™核质提取试剂盒（产品目录号78833；Thermo Fisher Scientific，Inc.）进行细胞分馏分析。简单地说，采集Huh7和HepG2细胞并用磷酸盐缓冲液清洗，然后在4°C下用冰镇CER I试剂培养15分钟。随后，向反应混合物中再添加CER II萃取试剂1 min；然后将裂解产物在16000×g下在4°C下离心5分钟。每一上清液（细胞质提取物）都被小心地转移到一个新鲜的微型离心管中并储存在冰上。将每个颗粒重悬于NER提取试剂中，并在冰上孵育40分钟；将所得悬浮液在16000×g、4°C下离心10分钟，将上清液（核提取物）转移到新鲜的微型离心管中并保存在冰上。用western blotting分析所有提取物。
球体形成分析
将单细胞（5000个细胞/孔）一式三份接种到DMEM/F12无血清培养基（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中的超低附着六孔板（Corning，Inc.）上，该培养基含有1%青霉素/链霉素、20ng/ml上皮生长因子（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和10 ng/ml成纤维细胞生长因子-2（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。在37°C下培养10天后，对球体进行成像，并形成球体数量（直径>100µm） 使用倒置光学显微镜手动计数（奥林巴斯公司）。
流式细胞仪分析
细胞在含有2%胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中37°C孵育30分钟，然后用异硫氰酸荧光素结合CD90抗体（1µg/试验；猫。编号FC01818；Boster Biological Technology）在室温黑暗中放置30分钟。小鼠IgG1κ同工酶控制（P3.6.2.8.1）（1µg/试验；猫。编号11-4714-42；赛默飞世尔科技公司）作为控制方。使用BD FACS Calibur流式细胞仪（BD Biosciences）对样品进行分析，并使用FlowJo 7.6（FlowJo-LLC）对结果进行分析。
体内肿瘤异种移植分析
总计1×106稳定转染miR-HCC2、对照载体或干扰miRNA的Huh7或Hep3B细胞悬浮于100µl无血清DMEM培养基，并皮下注射到6只6周龄雌性BALB/c裸鼠（北京维他河实验动物技术有限公司；查尔斯河实验室有限公司）的皮下的）的生活于18个。、，为；12小时光/暗循环），可获得食物和水随意每天监测小鼠的健康和行为。每个肿瘤的体积在第一周评估一次，然后每周评估两次，如下所示：长度x宽度2× 1/2. 植入后49天，通过颈椎脱位处死小鼠并收集肿瘤。收集肿瘤后，记录每个肿瘤的重量。此外，1×105稳定转染miR-HCC2或对照载体的Huh7细胞悬浮于100µl磷酸盐缓冲盐水，并注射到6只5周龄雌性BALB/c裸鼠的尾静脉中，平均体重为16 g（北京维塔尔河实验动物技术有限公司；查尔斯河实验室有限公司）。将小鼠保存在标准实验室条件下（温度22±2°C；相对湿度50±10%；12小时光/暗循环），可以获得食物和水随意每天监测小鼠的健康和行为。在注射后11周，通过颈椎脱位处死小鼠，并收集它们的肺和肝脏。肿瘤和组织在室温下用10%福尔马林固定72小时，并包埋在石蜡中。章节（4µm） 在室温下用苏木精染色5分钟，用伊红染色2分钟，用于组织学检查和形态计量分析。对肿瘤解剖和病理进行评估，以确定原发肿瘤生长和转移病灶形成。在光学显微镜下（10倍放大；奥林巴斯公司），在小鼠肺和肝脏的组织切片中对显微镜下的肿瘤结节进行计数。采用免疫组织化学染色法评估干细胞标记物Sox2的蛋白表达水平。石蜡包埋切片首先脱蜡并在柠檬酸盐缓冲液中加热，以便在沸水浴中提取抗原15分钟，然后冷却至室温30分钟，然后在37°C的PBS中与3%过氧化氢孵育5分钟，并在37℃的PBS中将3%牛血清白蛋白封闭1小时。将载玻片与抗Sox2的一级抗体（1:200；类别编号WL03767；Wanleibio Co.，Ltd.）在4°C下孵育过夜，然后在室温下与生物素化二级抗体（1:500；类别编号ab207995；Abcam）孵育1小时。切片图像在光学显微镜（40倍放大；奥林巴斯公司）下拍摄，并使用Caseviewer 2.4（3DHISTECH，Ltd.）进行分析。症状包括食欲不振、体重减轻≥20%、虚弱、疼痛、呼吸困难或肿瘤体积达到2000毫米三被设定为本研究的人道终点。然而，由于出现任何这些症状，在肿瘤异种移植实验结束之前没有处死小鼠。所有研究均经天津医科大学动物伦理委员会批准（批准号：TMULA-201954）。
统计分析
GraphPad Prism 5（GraphPad-Software；Dotmatics）用于统计分析。每个实验重复三次。所有数值均表示为平均值±标准偏差。使用双尾Student t检验评估两组之间的差异。使用单向方差分析和Tukey的事后检验评估三个或更多组之间的统计显著性。使用皮尔逊相关系数评估基因表达关系。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
肝癌组织中miR-HCC2的鉴定
为了鉴定与肝癌相关的miRNAs，使用深度测序分析从六个肝癌组织样本中分离出的miRNA(表SI). 总共分离出949个miRNA，其中包括5个新的miRNA(). 在本研究中，miR-HCC2是重点研究对象，其序列为“UCU GUU UGU CGU AGG CAG AUG G”，在肝癌组织中的新miRNA中显示出第二高丰度，位于智人5号染色体，GRCh38.p12初级装配（国家生物技术信息参考序列中心，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NC_00005”，“term_id”：“568815593”，“term_text”：“NC _ 000005”}}NC_ 000005) (32). 其他miRNA候选基因由其他小组成员在正在进行的研究中进行评估。为了证实深度测序的结果，使用RT-qPCR量化肝癌组织和邻近非肿瘤组织中miR-HCC2的RNA表达水平，并且肝癌组织中miR-HCC2的RNA表达水平显著高于邻近非肿瘤组织(). 这些结果与深测序数据一致，表明miR-HCC2在肝癌组织中的表达上调。
MiR-HCC2在肝癌组织中上调，并在人类肝癌细胞中促进干细胞样特性。（A） 通过深度测序鉴定的五种代表性miRNAs的测序读取和统计。（B） 肝癌组织和邻近非肿瘤组织中miR-HCC2的相对水平（n=13）。U6 RNA用于归一化。分别通过RT-qPCR和western印迹分析评估瞬时转染的HepG2和Huh7细胞中干性标记物的相对（C）mRNA和（D）蛋白表达水平。箭头表示非特定条带。（E） 稳定miR-HCC2过度表达Huh7细胞中miR-HCCO2和干细胞标记物的mRNA和蛋白表达水平。样品来源于相同的实验，并并行处理印迹。（F） 肿瘤球体形成测定表明，在稳定的miR-HCC2过表达Huh7细胞中，球体形成能力增强。比例尺=100µm.（G）CD90比例评估+转染Huh7细胞中的细胞。所有实验均至少进行了三次。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01和***与相应对照组相比，P<0.001（miR-HCC2 vs.pcDNA3，ASO-miR-HCCO2 vs.ASO-NC，稳定miR-HCC2vs.pcDNA A3）。miR，microRNA；纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；反义寡核苷酸；NC，阴性对照。
MiR-HCC2参与人肝癌细胞干细胞样特性的调节
为了评估miR-HCC2是否与人类肝癌细胞中的干细胞样特性相关，将HepG2和Huh7细胞转染miR-HCC2/ASO-miR-HCC2及其各自的对照载体。在评估了miR-HCC2载体和ASO-miR-HCCO2低聚物的效率之后()，评估细胞表面标记物（CD90）和四种干细胞标记物（Oct4、Nanog、Sox2和EpCAM）的蛋白质表达水平。如所示miR-HCC2的过度表达显著增加了瞬时转染HepG2和Huh7细胞中表面标记CD90和干细胞标记的mRNA和蛋白表达水平；此外，miR-HCC2的抑制显著降低了这些标记物的mRNA和蛋白表达水平。与对照细胞相比，稳定的miR-HCC2过度表达Huh7细胞的干细胞标记物的蛋白和mRNA表达水平显著升高(). 球体形成分析显示球体数量显著增加（≥100个µm） 与对照细胞相比，稳定miR-HCC2过度表达Huh7细胞（57 vs.22，)这表明miR-HCC2显著增强了Huh7细胞的成球能力。此外，进行流式细胞术分析以评估CD90的比例+稳定miR-HCC2过度表达细胞系中的细胞。CD90的比例+与对照细胞相比，稳定的miR-HCC2过表达Huh7细胞中的细胞显著增多（平均44.3%对15.5%）().
总之，这些结果表明，miR-HCC2通过增加球体形成，提高CD90的比例，促进了人类肝癌细胞的干细胞样特性+增加干细胞相关基因的mRNA和蛋白表达水平。
MiR-HCC2增强裸鼠肝癌细胞的成瘤性、转移和干细胞
评估miR-HCC2对致瘤性和肿瘤转移的影响体内将稳定的miR-HCC2过度表达Huh7或Hep3B细胞皮下和静脉注射到裸鼠体内。采用裸鼠异种移植形成试验评估miR-HCC2过度表达对肝癌细胞致瘤性的影响。平均肿瘤重量和平均肿瘤体积()miR-HCC2组显著高于对照组。来自稳定miR-HCC2过度表达Huh7或Hep3B细胞的小鼠肿瘤中miR-HCCO2和干相关标记物的RNA表达水平显著高于来自相应对照细胞的小鼠癌症(). MiR-HCC2过度表达的肿瘤表现出低分化的癌形态和细胞有丝分裂增加，而对照肿瘤表现出高分化的癌形态学和低恶性度（上图为和上部面板图S1). 考虑到作为肝细胞损伤标志物的甲胎蛋白（AFP）在肿瘤生长和致癌中具有重要作用(33)检测AFP在小鼠肿瘤中的表达。在miR-HCC2过度表达的肿瘤中AFP mRNA表达水平显著高于对照肿瘤(). 此外，Sox2蛋白表达模式的免疫组织化学分析表明，与对照细胞相比，异种移植中miR-HCC2过度表达细胞的Sox2蛋白质表达水平显著高于对照细胞（下面板为和图S1)这表明miR-HCC2过度表达促进了细胞生长和干细胞。
MiR-HCC2增强肝癌细胞的增殖、转移和干细胞体内使用裸鼠肿瘤异种移植模型评估miR-HCC2对肿瘤生长和转移的影响体内（A）从皮下注射的小鼠中分离出肿瘤。将pcDNA3载体和打乱的miRNA作为对照载体和对照miRNA。（B）从小鼠中分离肿瘤后，对肿瘤重量进行量化。（C） 注射后评估肿瘤体积。（D） 小鼠肿瘤结节中miR-HCC2、BAMBI和干细胞标记物的RNA表达水平。（E） 注射Huh7细胞的小鼠异种移植物肿瘤中Sox2的H&E染色和免疫组织化学染色。比例尺=50µm.（F）从静脉注射小鼠中分离出的肺和肝组织的大体解剖评估。计数肺组织和肝组织切片中的肿瘤结节。（G） 肺和肝脏中Sox2的H&E染色和免疫组织化学染色。比例尺=50µ肺和肝脏中miR-HCC2、BAMBI和干细胞标记物的m（H）RNA表达水平。比例尺=50µm.将所有结果与相应的对照组进行比较。数据表示为平均值±标准偏差。*P＜0.05，**P<0.01和***P<0.001。miR，miRNA；miRNA、微小RNA；纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；甲胎蛋白；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；H&E、苏木精和曙红。
通过尾静脉将稳定的miR-HCC2过度表达的Huh7细胞静脉注射到裸鼠体内，以评估miR-HCCO2对肿瘤转移的影响。注射过表达miR-HCC2的Huh7细胞导致肿瘤发病率显著增加体内与注射含有控制载体的Huh7细胞相比。注射稳定miR-HCC2-过表达Huh7细胞的六（2/6）只小鼠中，有两只发生了肺和肝转移，而对照组没有小鼠发生肺或肝转移(). 稳定miR-HCC2过度表达组的肺部和肝脏中可见多个肿瘤结节，而对照组没有可见肿瘤结节。同样，苏木精和伊红染色显示，miR-HCC2过度表达Huh7细胞导致的肺和肝转移中分化不良的癌形态和细胞有丝分裂增加。免疫组织化学显示，与对照组相比，两种miR-HCC2过度表达的转移瘤中Sox2蛋白表达均显著增加(). 与对照组相比，注射稳定的miR-HCC2过度表达Huh7细胞后，miR-HCCO2和干细胞标记物的RNA表达水平显著增加().
这些结果表明miR-HCC2增强了肝癌细胞的致瘤性、转移性和干细胞性体内.
BAMBI有助于人类肝癌细胞的干细胞样特性
据报道，miRNAs靶向多个宿主基因以发挥其功能(34). 先前的研究报道，BAMBI是miR-HCC2的直接靶点和肝CSC的标志物(32,35). BAMBI有助于增强Wnt/β-catenin信号传导，该信号传导参与CSCs初始生长和维持的调节(24,26-28). 在本研究中，使用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告系统评估miR-HCC2与BAMBI之间的直接相互作用；结果表明，miR-HCC2可以直接靶向并上调BAMBI的表达(图S2). 为了进一步评估BAMBI在人类肝癌细胞干细胞调节中的作用，构建了过表达和shR载体，然后将其转染到HepG2和Huh7细胞中。BAMBI的过度表达或抑制分别显著增强或降低了茎相关基因mRNA和蛋白质的表达水平、球体形成和CD90的比例+单元格(). 这些结果表明，BAMBI有助于人类肝癌细胞的干细胞样特性。
BAMBI促进人类肝癌细胞的干细胞样特性。分别采用逆转录定量PCR和western blotting分析评估转染肝癌细胞中BAMBI和干细胞标记物的（A和B）mRNA和（C和D）蛋白表达水平。样品来源于相同的实验，并并行处理印迹。箭头表示非特定条带。（E） 球形形成试验用于评估BAMBI对肿瘤球形形成能力的影响。比例尺=100µm.（F）CD90的比例+用流式细胞术检测肝癌细胞中的细胞。所有实验至少一式三份进行。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01和***与相应对照组相比，P<0.001（BAMBI vs.pcDNA3和shR-BAMBI vs.pSilencer-NC）。纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；短发夹RNA；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；NC，阴性对照。
敲除BAMBI消除miR-HCC2对人肝癌细胞干细胞样特性的相关影响
BAMBI和miR-HCC2对肝癌细胞中干细胞样特性的影响相似，并且BAMBI的表达受到miR-HCCO2的正调控；因此，是否miR-HCC2对肝癌细胞干细胞的影响是通过上调BAMBI表达介导的。当质粒miR-HCC2和shR-BAMBI共同转染到肝癌细胞中时，miR-HCC2-介导的干相关基因mRNA和蛋白表达水平、球体形成和CD90比例增加+BAMBI抑制使细胞明显消失(). 总之，BAMBI的敲除消除了miR-HCC2诱导的干细胞样特性，这表明BAMBI是miR-HCCO2诱导肝癌细胞干细胞生成的直接功能靶点。
BAMBI表达的抑制消除了miR-HCC2对人类肝癌细胞中干细胞样特性的影响。在miR-HCC2存在下，shR-BAMBI转染HepG2和Huh7细胞后，测定干细胞标记物的（A和B）mRNA和（C和D）蛋白表达水平。样品来源于相同的实验，并并行处理印迹。箭头表示非特定条带。（E） 通过抑制BAMBI，miR-HCC2介导的肿瘤成球能力增加被消除。比例尺=100µm.（F）miR-HCC2介导的CD90比例增加+通过抑制BAMBI使细胞减少。所有实验至少进行三次。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01和***与相应的对照组相比，P<0.001（miR-HCC2+pSilencer-NC vs.pcDNA3+pSillecer-NC和miR-HCC2+shR-BAMBI vs.pcDNA A3+pSilencer-CC）。纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；shR短发夹RNA；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；NC，阴性对照；miR，microRNA；ns，不显著。
BAMBI激活Wnt/β-catenin信号，促进肝癌细胞的干细胞
以前有报道称，BAMBI通过Wnt/β-catenin信号通路发挥其功能(22,23). Wnt/β-catenin信号通路在癌症、干细胞控制和CSC生物学中非常重要(35-37). 为了阐明BAMBI促进肝癌细胞干细胞生成的机制，本研究评估了BAMBI是否影响肝癌细胞中β-catenin的表达水平和Axin2的转录。RT-qPCR和western blotting分析表明，BAMBI的过度表达显著增加了β-catenin mRNA和蛋白的表达水平，显著降低了Axin2 mRNA的表达水平，而抑制BAMBI显著降低β-catenin mRNA和蛋白表达水平，显著增加Axin2 mRNA表达水平(). 此外，BAMBI在肝癌细胞中过度表达或抑制后，β-catenin的核表达水平分别显著升高或降低；这些结果表明，BAMBI促进了β-catenin的核转位(). 此外，在小鼠肿瘤中，β-catenin的表达与BAMBI的表达有显著相关性(). 上述结果表明，BAMBI可促进β-catenin的核转位，从而激活Wnt/β-catening信号通路。
BAMBI促进β-catenin的核转位并激活Wnt/β-catening信号。BAMBI在HepG2和Huh7细胞中的过度表达或敲除显著增加或降低了β-catenin的（A和B）mRNA和（C）蛋白表达水平，降低或增加了Axin2的mRNA和表达水平。（D） 在BAMBI过度表达或敲除后评估β-catenin的核转位。样本来自相同的实验，并且杂交是并行处理的。箭头表示非特定条带。（E和F）小鼠肿瘤中β-连环蛋白和BAMBI表达水平的相关性分析。*P<0.05，**P<0.01和***与相应对照组相比，P<0.001（BAMBI vs.pcDNA3和shR-BAMBI vs.pSilencer-NC）。BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；NC，阴性对照；短发夹RNA；Axin2，轴抑制蛋白2；ns，不显著。
转录因子YY1结合miR-HCC2启动子并激活miR-HCCO2的表达
为了阐明肝癌组织中miR-HCC2异常表达的调控机制，使用生物信息学分析（启动子2.0和hTF靶点）预测miR-HCCO2启动子以及潜在的转录因子结合位点。将几个含有推测转录起始位点的片段分别克隆到pGL3-Basic载体中，包括miR-HCC2-启动子1、miR-HCC2启动子2和miR-HCCO2启动子3(). 荧光素酶报告子分析显示，转染miR-HCC2启动子2的细胞的荧光素酶活性显著增加，这表明其包含一个功能启动子区域(). 生物信息学分析表明，miR-HCC2-前体2含有两个YY1结合位点，分别位于前miR-HCC2上游2273-2288bp和2883-2898bp。与对照组相比，YY1的异位表达或敲除显著增强或降低了Huh7细胞中miR-HCC2的启动子活性，这表明YY1可以通过增强其启动子活性来调节miR-HCCO2的表达(和第3章). 当预测的结合位点1发生突变时，启动子活性不受YY1过度表达或抑制的影响；然而，预测结合位点2的突变对YY1的结合没有影响。这些发现表明，预测的结合位点1负责YY1结合和随后miR-HCC2表达的调控(). 此外，当YY1在肝癌细胞中过度表达或被敲除时，与对照组相比，miR-HCC2水平显著升高或降低，相关分析表明YY1对肝癌组织中的miR-HCCO2具有显著正调控作用(). 这些结果表明，YY1通过与启动子结合激活miR-HCC2转录。
YY1结合启动子区域并增强miR-HCC2的转录。（A） 启动子2.0表明预测的转录起始位点位于前miR-HCC2上游1至4kb区域。预测的miR-HCC2启动子-2273至-2288 bp和-2883至-2898 bp核苷酸的YY1结合位点由hTF靶点识别。（B） 双荧光素酶分析显示了Huh7细胞中miR-HCC2启动子片段报告子的活性。基本用作阴性对照。***与基本值相比，P<0.001。（C） 双荧光素酶分析显示与YY1或shR-YY1共转染后miR-HCC2启动子片段报告子的活性。碱性和pGL3-对照分别用作阴性和阳性对照。*P<0.05和***P<0.001（YY1 vs.pcDNA3和shR-YY1 v.pSilencer-NC）。（D） 采用双荧光素酶分析评估转染YY1或shR-YY1后miR-HCC2启动子2-mut1和miR-HCCO2启动子2-mut2的活性。***P<0.001（YY1 vs.pcDNA3和shR-YY1 v.pSilencer-NC）。（E） 转染YY1或shR-YY1后，使用RT-qPCR评估miR-HCC2的主要转录物。*P<0.05和***P<0.001（YY1 vs.pcDNA3和shR-YY1 v.pSilencer-NC）。（F） 使用RT-qPCR在13对肝癌组织中评估YY1的表达水平。（G） 肝癌组织中YY1和miR-HCC2表达水平的相关性分析。将所有结果与相应的对照组进行比较。数据表示为平均值±标准偏差。（H） YY1/miR-HCC2/BAMBI轴在肝癌细胞干细胞调节中的作用模型。miR，microRNA；基本，pGL3-Basic；ns，不显著；RT-qPCR、逆转录定量PCR；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；前体、前体。
讨论
先前的研究报告称，CSC因其高度的自我更新能力、致瘤性和化疗耐药性，对肝癌的肿瘤进展至关重要(6,7). 利用干细胞标记物（包括CD90）和某些干细胞相关转录因子（如Nanog、Sox2、EpCAM和Oct4）在实体瘤中对CSC进行了表征(8,9,14,38). 然而，肝干细胞干细胞因子基因表达调控的机制尚不清楚。为了评估miRNAs对肝癌干细胞的潜在影响，采用深度测序分析从肝癌组织样本中分离的miRNAs:；确定了某些异常表达的miRNAs。本研究的重点是miR-HCC2，其在肝癌组织中的表达增加，此前有报道称其促进肝癌细胞的生长、迁移和侵袭在体外(32). 然而，miR-HCC2在肝癌细胞干性中的作用尚不清楚。
本研究表明，与邻近的非肿瘤组织相比，miR-HCC2在肝癌组织中显著上调，并促进肝癌细胞的干细胞样特性体内和在体外先前的研究报告称，BAMBI通过增强Wnt/β-catenin信号活性，参与调节多种癌症和CSC的细胞增殖和分化(24,39). 例如，BAMBI促进Frizzled5和Dishevelled2之间的相互作用，促进Wnt/β-catenin活性(23). BAMBI的减少表达显著抑制了β-catenin的核转位和Axin2的转录，这两个Wnt/β-catentin活性的指标(40-42). 以前有报道称，Wnt/β-catenin信号通路的激活显著增加了肝CSC相关分子标记CD90和EpCAM的表达水平，从而导致造血祖细胞转化为肝CSC(43). 因此，本研究评估了BAMBI对肝癌细胞中β-catenin表达和核转位的影响。结果表明，miR-HCC2通过靶向BAMBI促进Wnt/β-catenin信号传导，影响肝癌细胞的干细胞样特性。先前的报告表明，YY1过度表达导致某些肿瘤抑制因子miRNAs的下调，从而增强NF-κB的活化和原癌表型(44,45). 然而，另一项研究报告称，YY1是c-Myc转化活性的有效抑制剂，可能具有肿瘤抑制特性(46). 本研究证明YY1是一种上游转录因子，通过与启动子区直接结合促进miR-HCC2表达。
本研究也有一定的局限性。例如，BAMBI促进β-catenin核转位激活肝癌细胞Wnt/β-catentin信号通路的机制尚未阐明。YY1被鉴定为miR-HCC2的上游转录因子；然而，其在肝癌细胞中高表达和功能的分子机制尚需进一步阐明。
总的来说，本研究的重点是miR-HCC2，这是一种新的肝癌相关miRNA，在肝癌组织中的表达水平位居第二。功能分析表明，miR-HCC2通过增强肿瘤的成球能力、CD90的比例和CD90在肝癌细胞中的表达，从而显著促进肝癌细胞的干细胞生成+细胞、干细胞标记物的表达与转移在体外和体内通过激活Wnt/β-catenin信号通路靶向BAMBI(). 此外，YY1通过结合miR-HCC2的启动子区域激活了pri-miR-HCC2转录。本研究的结果表明，YY1通过上调BAMBI上调miR-HCC2作为癌症干性诱导剂，BAMBI将YY1/miR-HCC2/BAMBI轴与到了均至的是的一一个的有关的的新的的为本，，本的该一一件本到这种一一部的的的的与一个一了它了一的电（一。本研究证明了miR-HCC2作为肿瘤干细胞诱导剂的重要性，从而为肝癌转移和复发提供了新的见解。
资金报表
本研究得到了国家自然科学基金（批准号81602410和81773002）和天津市自然科学基金会（批准号17JCQNJC11300）的支持。
作者的贡献
HG负责研究概念和设计。HG、HF和HX负责材料准备、数据收集和分析。HG和HX负责起草这份手稿。HG和HX确认所有原始数据的真实性。所有作者阅读并批准了最终手稿。
道德批准和参与同意
本研究是根据ARRIVE指南报告的。所有动物实验方案均经天津医科大学动物伦理委员会批准（批准号：TMULA-201954）。
工具书类
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