神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩（SMA）的特征是脊髓运动神经元变性，导致肌肉无力和萎缩(40). 运动神经元存活基因(SMN公司)在5号染色体5q13处以反向重复出现，超过98%的SMA患者的基因端粒拷贝发生突变或缺失(SMN1型)导致存活运动神经元（SMN）蛋白水平降低(31; 参考文献中审查8).
snRNP核心颗粒在细胞质中由新输出的snRNA和核心Sm蛋白（SmB、SmD1、SmD2、SmD3、SmE、SmF和SmG）组装而成。U snRNAs的帽状超甲基化需要核心Sm蛋白在U1、U2、U4和U5 snRNAss的Sm位点上组装。snRNP Sm核心颗粒被认为是由一个包含Sm蛋白的七米环构成的，每个Sm蛋白都有一个U snRNA结合在环的中心(28). 正确组装的Sm核以及2,2,7-三甲基愈创木苷（m三G） snRNP导入到nucleus需要cap(13,16,17,27,38,39,41). 所有Sm蛋白中保守的区域（Sm基序1和2）(51)很可能是这些蛋白质正确折叠及其相互作用所必需的(28). 在细胞质中，SMN与Sm蛋白相关(9,36). 在爪蟾卵母细胞、微量注射抗SMN复合抗体抑制或刺激snRNP核心颗粒的形成，以及哺乳动物细胞中SMN显性阴性突变体的瞬时表达将Sm蛋白和snRNA隔离在大细胞质聚集体中(7,15,45). 这些结果表明，SMN复合物在snRNP核心粒子组装中起着关键作用。
另一种蛋白质pICln被认为是snRNP组装的负调节蛋白。这一结论是基于在将大量重组pICln注射到爪蟾卵母细胞。PICln还与Sm蛋白B′、D1、D2、D3和E结合(47)以及一种称为IBP72的蛋白质(30). 最近，IBP72被证明与Janus激酶（JAK1和JAK2）相互作用，并被重命名为JBP1（JAK结合蛋白1）(46). JBP1被证明是一种精氨酸甲基转移酶蛋白(46,49). JBP1（skb1）的酵母同源物似乎参与渗透反应和有丝分裂的调节(4,26). 然而，哺乳动物JBP1的功能尚不清楚。
SMN寡聚并发现于Gemin2（以前称为SIP1）的大型络合物中(36)、Gemin4(10)和DEAD盒RNA解旋酶Gemin3(9). 保守的YG结构域（人类SMN中的氨基酸276至279）负责SMN寡聚(37,44)，这大大增加了SMN对SmD1、SmD3和SmB的亲和力(44). SmD1和SmD3精氨酸和富含甘氨酸（RG）的羧基末端结构域对于SMN结合是必要的和充分的(20). 相比之下，SmB具有更长的羧基末端RG结构域（约151个氨基酸长），具有脯氨酸延伸和分散的RG重复序列。此域是SMN绑定所必需的，但还不够(20). 在未删除SMA基因的SMA患者中发现的所有经长期测试的SMN突变体都存在Sm蛋白结合缺陷，这为这些相互作用的缺陷可能在SMA的病理学中发挥作用提供了证据(7,20,44).
SmD1和SmD3羧基末端RG结构域中的特定精氨酸在翻译后修饰为对称的二甲基精氨酸（sDMA）(5). SMN优先与sDMA修饰的SmD1和SmD3结合，表明蛋白质甲基化可能是调节蛋白质相互作用的一般机制(21). 30多年前，蛋白质被证明含有二甲基精氨酸(42,43)然而，对精氨酸甲基化蛋白的分子功能的了解仍然有限。I型蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）活性产生不对称二甲基精氨酸（aDMA），而II型PRMT活性产生sDMA（参考24以及其中的参考）。许多I型PRMT已被鉴定，并且似乎大多数细胞PRMT活性来自I型酶(19,25). hnRNP蛋白的不对称二甲基化被认为在其核输出中起作用(52)I型甲基转移酶CARM1和PRMT1被证明参与核激素受体的转录激活(11,29). 没有克隆的PRMT被最终证明是II型酶，除了SmD1和SmD3，髓磷脂碱性蛋白(三)是已知唯一含有sDMA的其他蛋白质。
在这里，我们证明JBP1是一种II型PRMT，它对称地二甲基化Sm蛋白的RG结构域，并与pICln蛋白一起，在20S甲基转移酶复合物中与含有RG结构域的Sm蛋白缔合。我们将这种大的20S复合物称为甲基体，并表明来自甲基体的SmD3，而不是来自6S-pICln复合物的SmD3，可以转移到SMN复合物。这些发现表明，在Sm蛋白与SMN和snRNP组装结合之前，甲基体会对称地作用于二甲基化Sm蛋白，因此甲基体可以调节snRNP的组装。
材料和方法
DNA构建和重组蛋白。
通过连接编码Flag表位的连接子构建Flag-pcDNA3Hin公司dIII型-巴姆HI-叶pcDNA3（Invitrogen）。JBP1 cDNA是Stevan Marcus送给我们的礼物(26)并在含有Flag-pcDNA3中Flag表位的框架中克隆，制成Flag-JBP1pcDNA3。JBP1中精氨酸368-对丙氨酸的突变是通过PCR定点突变构建的，该突变是通过重叠PCR，使用编码所需氨基酸变化的引物对和克隆回Flag-pcDNA3的限制性位点构建的。谷胱甘肽的细菌表达和重组蛋白纯化的构建S公司-转移酶（GST）-D1、GST-D1c29、GST-D3和GST-D3c32以及哺乳动物细胞表达myc-D3、myc-D1、myc-D1Δc29和myc-D3Δc32的构建体已在前面描述(20). 麦芽糖结合蛋白（MBP）融合到β-半乳糖苷酶的α亚单位（MBP-βGalα），MBP融合到hnRNP A2的RGG结构域（MBP-A2-RGG），由pMAL-c2（新英格兰生物实验室）生产，并根据制造商的建议进行纯化。MBP-A2-RGG是通过将编码hnRNP-A2氨基酸266至341的PCR片段亚克隆到pMAL-c2中的MBP框架中而构建的。
细胞培养和转染。
293细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。根据制造商的建议，使用CalPhos哺乳动物转染试剂盒（Clontech Laboratories）将生长在100 mm直径培养皿（约40%融合液）上的293个细胞转染5至10μg DNA。
亲和层析和细胞提取物制备。
如前所述进行提取物制备和细胞分离(54). 固定在30μl谷胱甘肽-脑葡萄糖珠（Amersham）或固定在高效链霉亲和素-Sepharose（Amersham）上的肽（1 nmol）上的GST融合蛋白（3至8μg）与3至4 mg提取的细胞蛋白（50至150μl）在1 ml结合缓冲液（50 mM Tris[PH7.5]中孵育、200 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.05%NP-40、2 mM二硫苏糖醇和每50 ml一片完整的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物）。用1ml结合缓冲液洗涤珠子七次，在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中煮沸5分钟，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。使用的肽如前所述(21).
蔗糖梯度离心。
细胞提取物在5°C的SW41转子中以5至20%蔗糖梯度、33000 rpm的转速在5至20 min的温度下分离。收集部分（0.5 ml），用SDS-PAGE分离6%的每个部分，并用Western blotting进行分析，如图所示。将剩余部分按指示混合，直接用于免疫沉淀或相互作用分析。每个蔗糖梯度使用五个直径为100 mm的板，其中293个细胞转染了指定的表达结构。
SMN复合物的纯化。
为了纯化SMN复合物，在293细胞中瞬时表达Flag-Gemin2、myc-SMN、myc-Gemin3和myc-Gemin 4，并从这些细胞中制备细胞质提取物，并在4°C下与反Flag Sepharose（Sigma）孵育2 h。用RSB-200（10 mM Tris-HCl[PH7.5]，200 mM NaCl，2.5 mM MgCl）进行大量清洗后2)使用0.01%NP-40，因此纯化的络合物用于图中所示的实验。.
SmD3从甲基体转移到SMN复合物。将从表达myc-D3的293细胞制备的细胞质提取物在蔗糖梯度上分离，将组分2至5（6S）和12至15（20S）混合并与SMN复合物（FLAG-SMN）孵育，该复合物是从瞬时表达myc-SMN、FLAG-Gemin2、myc-Gemin3、，如图所示，myc-Gemin4或与从载体转染细胞（Flag-载体）制备的细胞质提取物孵育的抗旗帜珠。洗涤后，通过Western blotting分析残留蛋白以检测myc-D3和JBP1（箭头）。总车道显示了每个绑定中使用的混合分数的10%。
免疫沉淀、免疫印迹和抗体。
如前所述进行免疫沉淀、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析(36). 这些实验中使用的抗体如下：抗SMN（2B1）(35)，抗Gemin2（2E17）(36)，抗Gemin3（11G9）(9)，抗Gemin4（22C10）(10)、抗myc（9E10）、抗pICln（转导实验室）、抗Sm蛋白（Y12）(33)、抗JBP1（Michael Nunn和Gary Zieve赠送的礼物）、非免疫抗体SP2/0(12)和反标志（Sigma）。根据制造商的建议，在抗Flag珠上进行免疫沉淀并用Flag肽（Sigma）洗脱。
JBP1的质谱鉴定。
如前所述，用胰蛋白酶切除、还原、烷基化和消化GST-D3c32的70-kDa带(53). 将酸化的上清液置于作为基质的4-羟基-α-肉桂酸薄层上(56). 光谱是在Reflex III仪器上获得的（德国不来梅Bruker Daltonics）。使用MDS蛋白质组学（丹麦欧登塞）的蛋白质和肽软件套件，对包含600000多个蛋白质条目的非冗余数据库进行解释和搜索。
甲基转移酶活性测定。
将Flag-JBP1pcDNA3、Flag-JPP1R368ApcDNA3和Flag-pcDNA3DNAs（7.5μg）分别转染到一个直径为100-mm的293细胞平板中。在RSB-100（10 mM Tris[pH7.5]、100 mM NaCl和2.5 mM MgCl）中提取细胞总提取物2)用1%Empigen培养，用30μl抗病毒M2琼脂糖亲和凝胶（Sigma）培养，用1ml RSB-200和1%Empiden洗涤五次。标志-JBP1和标志-JBP2R368A型根据制造商的建议，用Flag肽（Sigma）从珠子中洗脱到RSB-100中，取约200 ng洗脱蛋白进行Western blot分析。对于甲基化，大约100 ng Flag-JBP1或Flag-JCP1R368A型（渗入缓冲液D[14])用2μCi的腺苷孵育-我-[甲基-三H] 蛋氨酸(三H-SAM）和600 ng每种重组蛋白在30μl、30°C下放置30分钟。通过添加SDS样品缓冲液停止反应，并通过SDS-PAGE分离产物。考马斯蓝染色后，通过Amplify（Amersham）处理放大放射性信号，并将其暴露于薄膜中3 h。通过蔗糖离心分离HeLa细胞质提取物，将12至25个组分与30μl抗pICln抗体或30μl固定在60μl GammaBind G Sepharose（Amersham）上的SP2/0混合并免疫沉淀。六分之一的免疫沉淀产物用于Western blot分析，其余的被均匀分割并用于甲基化。一个梯度的免疫沉淀产物用于12个甲基转移酶反应。除了将膜暴露16至18小时之外，在分析抗Flag免疫沉淀物的同时分析甲基转移酶活性。如上所述纯化甲基体并分析其甲基转移酶活性，但从蔗糖梯度上分离的细胞质提取物中的20S组分用0.01%NP-40而非Empigen的抗Flag抗体进行免疫沉淀。为了分析甲基化精氨酸产品，将1μg GST-TEV-D3c32与Flag-JBP1或His-PRMT1（500 ng）和20μl三H-SAM（20μCi，0.4 nmol）和1 nmol冷SAM在30°C下持续1.5小时。添加结合缓冲液（500μl），并将GST-TEV-D3c32捕获到20μl谷胱甘肽-脑葡萄糖中。在用1ml结合缓冲液洗涤五次，用1ml TEV裂解缓冲液（Gibco BRL）洗涤两次后，在50μl反应混合物中用5U TEV蛋白酶（Gibco-BRL）在30°C下裂解肽1h。去除TEV裂解缓冲液（肽仍与TEV裂解缓冲器中的Sepharose相关）。用50μl 1M三乙基碳酸氢铵（pH 8.5）洗脱肽，并在Speed Vac中干燥。在50μl 6 M恒沸（Pierce）HCl中重新悬浮后，在110°C的真空下水解肽20 h，并通过干燥去除酸。将水解肽重新悬浮在10μl水中，并将5μl与30 nmol的sDMA和单甲基精氨酸（MMA）（JBP1甲基化）或aDMA和MMA（His-PRMT1甲基化）混合。标准氨基酸购自Calbiochem。将该混合物装载在LK6DF硅胶60薄层色谱板（Whatman）上，并用氢氧化铵-氯仿-甲醇-水（2:0.5:4.5:1）分离。标准氨基酸用茚三酮可视化，放射性标记的甲基化精氨酸产品用磷成像仪分析可视化。
结果
SmD1和SmD3的RG结构域与甲基转移酶JBP1结合。
我们最近表明，SmD1和SmD3的RG结构域对于SMN结合是必要的和充分的(20). 此外，SMN优先结合这些域的sDMA修饰形式(21). 为了进一步研究SmD1和SmD3的RG结构域之间的相互作用，并确定修饰它们的潜在甲基转移酶，HeLa细胞提取物与融合到SmD3 RG结构区（GST-D3c32）或单独融合到GST的固定化GST孵育，作为对照。大量洗涤后，用SDS样品缓冲液洗脱结合蛋白，用SDS-PAGE进行分离，并用考马斯蓝染色进行可视化（图。). 固定化的蛋白质本身（不与细胞提取物孵育）也被分解和染色，以区分重组蛋白质和结合的细胞蛋白质。固定化GST-D3c32结合了特定的细胞蛋白谱。从凝胶中切下一个显著的条带，即与GST-D3c32结合但不单独与GST结合的约70-kDa蛋白，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法明确鉴定为JBP1（图。). 序列覆盖率为32%，质量精度低于30 ppm（22个匹配肽覆盖了JBP1 637个氨基酸中的205个）。JBP1结合蛋白pICln也与GST-D3c32结合，但不单独与GST结合（见下文）。
SmD3 RG结构域亲和层析分离甲基转移酶JPB1。将指示的重组蛋白（8μg）与（+）或（-）总HeLa提取物孵育。在大量洗涤后，通过SDS-PAGE分离蛋白质，并通过考马斯蓝染色进行可视化。甲基转移酶JBP1（箭头）通过MALDI-TOF质谱鉴定，pICln通过Western blot分析鉴定（见图。). 左边的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。
JBP1与SmD1和SmD3关联。
为了证实JBP1实际上是结合SmD1和SmD3的甲基转移酶，HeLa细胞提取物与固定化GST-D3c32和融合到SmD1（GST-D1）、SmD3（GST-D3）和SmD1的RG结构域（GST-D29）的GST孵育，结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并用抗SMN、-JBP1和-pICln特异性抗体进行Western blot。JBP1和JBP1-结合蛋白pICln与固定化Sm蛋白及其RG结构域结合，但不单独与GST结合。如前所述，SMN不与未修饰的蛋白质结合(21)（图。A） ●●●●。为了检查sDMA修饰在这些相互作用中的作用，先前描述的肽(21)对应于SmD1和SmD3的RG结构域，不含（D1c29和D3c32）或含有（D1c29-sDMA和D3c 32-sDMA），所形成的特异性sDMA修饰被固定并与HeLa细胞质提取物孵育。洗涤后，洗脱结合蛋白，通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting检测SMN、pICln和JBP1（图。B） ●●●●。引人注目的是，JBP1和pICln仅与未修饰肽结合，而SMN仅与sDMA修饰肽结合。这表明JBP1和pICln与SmD1和SmD3的未甲基化RG结构域结合，而SMN优先结合SmD1和SmD3的二甲基精氨酸修饰的RG结构域。
JBP1和pICln与未修饰的Sm蛋白相关。（A） 将指示的固定化GST融合蛋白与HeLa细胞提取物孵育，并通过Western blotting分析结合蛋白以检测指示蛋白（箭头）。总车道显示每个绑定中使用的提取的10%。（B） 用HeLa细胞质提取物孵育链亲和素固定化的生物素连接肽，分别加入（D1c29-sDMA和D3c32-sDMA）或不加入（D1c 29和D3c 32）体内形成的特异性sDMA修饰物和生物素，并用Western blotting分析结合蛋白以检测指示蛋白（箭头）。总车道显示每个绑定中使用的提取的10%。（C） 使用抗SMN（2B1）、抗Sm蛋白（Y12）、抗pICln（α-pICln）和非免疫（SP2/0）抗体对HeLa细胞质提取物进行免疫沉淀，并通过Western印迹分析结合的细胞蛋白以检测箭头所示的蛋白。总路线显示每次免疫沉淀中使用的提取物的10%。
因为之前已经证明pICln绑定到JBP1（当时称为IBP72）(30)，结果如图所示。表明JBP1-pICln复合物和SMN复合物与同一Sm蛋白的不同形式相关。这表明这两种复合物是分开的，SMN复合物在被JBP1修饰后与Sm蛋白结合。为了直接检测这些复合物并确定JBP1是否确实与Sm蛋白相关，使用针对Sm蛋白SMN和pICln的单克隆抗体从HeLa细胞细胞质裂解液中进行免疫沉淀。作为阴性对照，还使用了非免疫抗体（SP2/0）（图。C） ●●●●。抗JBP1抗体不能有效免疫沉淀JBP1（数据未显示），因此未用于这些实验。正如预期的那样，抗SMN抗体共同免疫沉淀SMN、Gemin2、Gemin3、Gemin4和SmB(9,10,36)但不是pICln或JBP1。相反，抗pICln抗体共免疫沉淀pICln、JBP1和SmB，但不沉淀SMN、Gemin2、Gemin3或Gemin4。免疫沉淀pICln、JBP1、SMN、Gemin2、Gemin3、Gemin4和SmB的抗-Sm蛋白抗体。SP2/0非免疫抗体不能共同免疫沉淀这些蛋白。这些结果表明，JBP1与Sm蛋白相关，SMN复合物和JBP1-pICln复合物作为两个单独的复合物存在，两者都包含Sm蛋白。
包含pICln、JBP1和RG域Sm蛋白的20S复合物。
用蔗糖梯度离心法研究了含有Sm蛋白的snRNP组装体中细胞质中间产物的大小(22,23,50). 为了研究细胞质pICln和JBP1在蔗糖梯度上与Sm蛋白的分离，制备并分离了细胞质提取物。离心后，收集组分，用SDS-PAGE进行解析，并用pICln和JBP1抗体进行Western印迹分析（图。A） ●●●●。pICln在大约6S和20S的两个峰中检测到。有趣的是，JPB1只在含有20S pICln的峰中发现。因此，哺乳动物细胞的细胞质中存在一种独特的含有JBP1和pICln的20S复合物，我们称之为甲基体（见下文）。
SmD1和SmD3的羧基末端RG结构域需要与20S pICln-JBP1复合物结合。（A） 293细胞胞质提取物在5%至20%蔗糖梯度上分离。收集部分（用数字表示），用SDS-PAGE分离，并用蛋白质印迹法检测箭头表示的蛋白质。（B） 在蔗糖梯度上分离293个瞬时表达myc-D3、myc-D4Δc32、myc-D1或myc-D1-Δc29（如图所示）的细胞，收集部分细胞，用SDS-PAGE分离，并进行免疫印迹检测myc标记蛋白。myc标记蛋白的存在不会影响pICln或JBP1的蔗糖梯度迁移模式（数据未显示）。在面板A和B中，通道P包含5%的梯度颗粒。总车道包含每个坡度上加载的5%提取。（C） 将表达myc-D3-和myc-D3Δc32的细胞质提取物的蔗糖梯度分离得到的组分2至5和12至15（分别如图A所示为6S和20S）与所示的抗Sm蛋白（Y12）、抗pICln（α-pICln）和非免疫（SP2/0）抗体混合并免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀的蛋白质，并进行免疫印迹以检测指示的蛋白质（箭头）。总车道显示了每次免疫沉淀中使用的混合组分的10%。
为了直接测量SmD1和SmD3相对于JBP1和pICln的蔗糖梯度迁移模式，在293细胞中瞬时表达了myc标记的SmD1（myc-D1）和SmD三（myc-D3），并在蔗糖梯度中沉淀，用抗myc抗体进行Western blotting分析组分（图。B） ●●●●。myc-D3和myc-D1在两个峰中迁移，这两个峰几乎与6S的pICln峰和20S的甲基体峰完全一致。由于JBP1和pICln与SmD1和SmD3的RG结构域结合，我们研究了SmD1与SmD3 RG结构区缺失的蔗糖梯度迁移模式。为此，在蔗糖梯度上分离瞬时转染myc标记的SmD1（myc-D1Δc29）和SmD3（myc-D3Δc32）RG结构域缺失的细胞的细胞质提取物，并用抗myc抗体进行Western blotting分析组分。引人注目的是，myc-D3Δc32和myc-D1Δc29仅在梯度的6S区域检测到（图。B） ●●●●。myc标记蛋白不影响pICln或JBP1的蔗糖梯度迁移模式（数据未显示）。为了确定这些myc标记的Sm蛋白及其RG结构域缺失是否与pICln和20S甲基体的6S峰相关，分别将组分2至5和12至15合并，并与抗-pICln、抗Sm蛋白或SP2/0非免疫抗体进行免疫沉淀（图。C） ●●●●。用抗myc、抗pICln或抗JBP1抗体进行Western blot分析表明，在6S峰中，myc-D3和myc-D3Δc32均与pCCln相关。Y12抗体结合SmD3和SmD1的RG结构域(5). 因此，myc-D3Δc32不是由Y12抗体免疫沉淀的，而pICln可以由Y12通过不含D3△c32的SmD1-pICln复合物免疫沉淀。相反，myc-D3与20S峰的甲基体相关，但与myc-D4Δc32无关。myc-D1和myc-D1Δc29也是如此（数据未显示）。这些结果表明，SmD1和SmD3在20S与甲基体相关，在6S与pICln相关。此外，SmD1和SmD3的RG结构域需要与20S甲基体结合，但不需要与6S pICln结合。
甲基体与含有RG的Sm蛋白结合。
为了确定哪些天然Sm蛋白与6S的pICln和20S的甲基体相关，用[35S] 蛋氨酸和[35S] 制备半胱氨酸和细胞质提取物，并在蔗糖梯度上分离。如前所述，将组分2至5（6S）和组分12至15（20S）混合并用于与抗Sm蛋白、抗pICln和SP2/0非免疫抗体的免疫沉淀。免疫沉淀经过SDS-PAGE，免疫沉淀蛋白通过荧光显影（图。). 免疫沉淀Sm蛋白在SDS-PAGE上具有明确的模式(32,58)，其位置如图所示。所有Sm蛋白均在两个混合组分中检测到。然而，与以前的报告一致(2,22,50)SmD1、SmD2、SmE、SmF和SmG在6S组分中表现突出，SmD3和SmB在20S组分上表现突出。类似于图。，抗pICln抗体免疫沉淀20S组分中的pICln和JBP1，以及6S组分的pICNn。在6S和20S组分的抗pICln免疫沉淀中检测到SmD3和较小程度的SmD1/D2（在我们手中，使用该凝胶系统无法完全分离SmD1和SmD2）。SmB仅在20S组分的抗pICln免疫沉淀中检测到。相反，不含RG的Sm蛋白SmE、SmF和SmG与含6S或20S pICln的复合物无关。抗-pICln还从梯度的6S和20S区域共免疫沉淀了一些未知蛋白（图。). 来自20S组分（p50和p37）的两个显著蛋白质可能是甲基体的组成部分（图。). 这些结果表明，20S甲基体结合RG的Sm蛋白SmB、SmD1/D2和SmD3，但不结合非RG的Sm蛋白SmE、SmF和SmG。
细胞质SmD1/D2、SmD3和SmB与20S甲基体相关。细胞质提取物由代谢标记的HeLa细胞制备[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸并在5%至20%蔗糖梯度上分馏，如图所示。将组分2至5（6S）和12至15（20S）混合，用所示的抗Sm（Y12）、抗pICln（α-pICln）和非免疫（SP2/0）抗体免疫沉淀，并用SDS-PAGE分离。使用Amplify（Amersham）增强放射性信号，并将凝胶暴露在胶片上。指出了Sm蛋白SmB/B′、SmD3、SmD1/D2、SmE、SmF和SmG，根据它们的分子量和在Y12免疫沉淀物中的存在进行鉴定。根据JBP1的分子量和在20S抗pICln免疫沉淀中的存在，对其进行了鉴定。同样，根据6S和20S pICln抗体免疫沉淀物中pICln的大小和存在情况，对其进行鉴定。由抗-pICln从梯度的6S和20S区域共同免疫沉淀的相对较小的未鉴定蛋白质用黑点表示。还显示了20S组分中抗pICln免疫沉淀的显著蛋白质（p50和p37）。分子质量标记的位置（单位：千道尔顿）如左图所示。
pICln结合SmD1和SmD3的Sm结构域。
以前的研究表明，pICln结合RG结构域的Sm蛋白SmB、SmD1和SmD3(47). 为了确定RG结构域是否介导这些相互作用，通过体外翻译产生放射性标记的myc-D1、myc-D3、myc-D1-Δc29和myc-D3-Δc32，并与融合到pICln（GST-pICln）或仅与GST孵育。洗涤后，通过SDS-PAGE分离结合蛋白，并通过荧光成像进行可视化（图。A和B）。SmD1和SmD3 RG结构域的缺失并不影响它们与GST-pICln的结合。在反向实验中，在体外翻译的pICln与固定化SmD1和SmD3结合，但没有与固定化的SmD1或SmD3的RG结构域结合（图。C） ●●●●。因此，pICln与SmD1和SmD3的Sm结构域相互作用。此外，因为SmD1和SmD3的RG结构域是这些蛋白质与20S甲基体结合所必需的（图。)这些结果表明，JBP1与RG结构域的结合对于SmD1和SmD3与甲基体的相互作用很重要。这也表明pICln被GST-D3c32从细胞提取物中拉下（图。)通过绑定到GST-D3c32的JBP1。
pICln结合SmD1和SmD3的Sm结构域。（A和B）在vitro-translated和[35S] 蛋氨酸标记的蛋白质与GST或GST-pICln孵育，洗涤后，用SDS-PAGE分离结合蛋白，并用荧光显影。（C） 与面板A和B一样，将体外翻译的pICln与指定的固定化蛋白质结合。
甲基体甲基化Sm蛋白。
为了专门测试甲基体是否能甲基化Sm蛋白，我们纯化了甲基体并测试了甲基转移酶对Sm蛋白的活性。为此，从293个瞬时表达Flag-JBP1的细胞中制备细胞质提取物，并在蔗糖梯度上分离。用免疫印迹法检测Flag-JBP1、天然JBP1和pICln（图。A） ●●●●。虽然在梯度颗粒中发现了大量的Flag-JBP1，但在甲基体中发现了一些Flag-JP1。20S峰（第12至15段）用抗Flag珠免疫沉淀并用Flag肽洗脱。洗脱液的Western blotting显示Flag-JBP1和天然JBP1以及pICln都是免疫沉淀的（图。B） ●●●●。这与之前显示JBP1齐聚物的结果一致(49). 纯化的甲基体可以有效地甲基化GST-D3、GST-D3c32、GST-D1c29和His-SmB，但不能甲基化GST、GST-D1、MBP-βGalα和MBP-A2-RGG（图。C） ●●●●。这表明甲基体甲基化Sm蛋白。
甲基体。（A） 从293个瞬时表达Flag-JBP1的细胞中制备细胞质提取物，并在蔗糖梯度上分离。收集部分，用SDS-PAGE分离，并用Western blotted检测Flag-JBP1、原生JBP1和pICln（箭头）。（B） 用抗Flag珠免疫沉淀组分12至15（20S），用SDS-PAGE和Western blotted分离Flag肽稀释的甲基体，检测Flag-JBP1、天然JBP1和pICln（箭头）。（C） 纯化的甲基体与三H-SAM和每个蛋白底物在50μl结合缓冲液中于30°C下放置30分钟。然后用SDS-PAGE分离样品，用考马斯蓝染色以检查蛋白底物，并在Amplify处理后暴露于薄膜中以增强辐射信号。
JBP1产生sDMA修饰的Sm蛋白。
我们无法从细菌产生的重组JBP1（rJBP1）中检测到甲基转移酶活性。其他研究表明，rJBP1的甲基转移酶活性至少比培养细胞中产生的JBP1低200倍(49). 因此，使用两种独立的方法从细胞提取物中免疫纯化JBP1。首先，我们使用了一种以前用于证明JBP1确实是甲基转移酶的技术(46). 为此，我们在高度保守的假定SAM结合域中瞬时表达标记有Flag表位的JBP1（Flag-JBP1(46)（标志-JBP1R368A型). 将标记蛋白从细胞质提取物中用反标记珠纯化并用标记肽洗脱。如抗JBP1特异性抗体的Western blotting所示，从标记JBP1-和标记JBP1制备的提取物的抗标记免疫沉淀R368A型-表达细胞中含有大量的Flag-JBP1和Flag-JP1R368A，分别（图。A） ●●●●。相反，来自Flag表达细胞（转染载体）的抗Flag免疫沉淀产物不含任何JBP1。在去污剂Empigen的存在下进行抗Flag抗体免疫沉淀，该去污剂去除免疫沉淀蛋白。之所以这样做，是因为我们希望确定JBP1本身，而不是一种污染蛋白质，是否可以甲基化Sm蛋白质。经SDS-PAGE银染测定，这些Flag-JBP1制剂的纯度超过90%（数据未显示）。我们还从HeLa细胞质提取物中免疫纯化了天然JBP1。为此，在蔗糖梯度上分离HeLa细胞质提取物，并将含有JBP1和pICln的20S组分与固定化抗pICln或SP2/0孵育，作为阴性对照。正如Western blotting检测到的那样，JBP1和pICln存在于抗-pICln免疫沉淀中，而SP2/0沉淀中不存在（图。B） ●●●●。
JBP1对SmD1、SmD3和SmB具有甲基转移酶特异性。（A） 从瞬时表达Flag-JBP1、Flag-JP1的293细胞制备的细胞质提取物R368A型或单独使用Flag（如图所示）与固定化抗Flag抗体（α-Flag IP）进行免疫沉淀。用Flag肽洗脱后，用抗JBP1抗体免疫印迹每个免疫沉淀的一部分。总通道包含每个免疫沉淀通道中使用的总提取物的10%。（B） HeLa细胞质提取物在5%至20%蔗糖梯度上分离。分数12至15（20S）（见图。A） 与抗pICln（α-pICln）和非免疫（SP2/0）抗体混合并免疫沉淀。用特异性抗体对每个免疫沉淀物的一部分进行蛋白质印迹，以检测JBP1和pICln（箭头）。总通道包含每个免疫沉淀通道中印迹的总提取物的10%。（C至F）标志-JBP1（C），标志-JBP2R368A型（D） 或将蔗糖梯度组分12至15（E）中的抗pICln抗体免疫沉淀与三H-SAM和每个蛋白底物在50μl结合缓冲液中于30°C下放置30分钟。然后用SDS-PAGE分离样品，用考马斯蓝染色，并用Amplify处理以增强放射性信号。（F） 一种代表性的考马斯蓝染色凝胶，显示重组蛋白的位置。（G） 将His标记的SmD1和SmD3用免疫纯化的Flag-JBP1甲基化，通过SDS-PAGE分离，并通过荧光照相法观察，如图C至F所示。
为了测试甲基转移酶活性，洗脱液在图中进行了Western印迹。A和B与三H-SAM和每种重组蛋白底物。然后通过SDS-PAGE分离每个样品，并通过考马斯蓝染色和荧光成像显示重组蛋白。图中显示了一种代表性的考马斯蓝染色凝胶，显示了所用重组蛋白底物的迁移模式。F.来自Flag-JBP1表达细胞的抗Flag免疫沉淀（图。C） 以及来自20S蔗糖梯度组分的抗pICln免疫沉淀（图。E） 对Sm蛋白底物具有甲基转移酶特异性。与纯化的甲基体类似，这两种免疫沉淀都能有效地甲基化GST-D3、GST-D3c32、GST-D1c29和His-SmB。然而，这些免疫沉淀不能有效地甲基化GST、GST-D1、MBP-βGalα和MBP-A2-RGG。蔗糖梯度组分中的SP2/0免疫沉淀和载体转染细胞中的抗标记免疫沉淀均未对任何所用底物显示出显著的甲基转移酶活性（数据未显示）。来自Flag-JBP1的抗-Flag免疫沉淀物R368A型-与免疫纯化Flag-JBP1相比，表达细胞的甲基转移酶活性显著降低（图。D） ●●●●。用Flag-JBP1进行的实验表明，JBP1可以甲基化Sm蛋白。我们注意到，天然JBP1位于与Sm蛋白相关的20S复合物中（图。和). 用抗Flag抗体免疫沉淀该复合物（在Flag-JBP1表达的情况下）（图。)和抗pICln抗体（图。)分离出一种使Sm蛋白特异性甲基化的活性，强烈表明JBP1在该甲基体的环境中发挥作用。
令人惊讶的是，免疫纯化的JBP1使SmD1融合到GST的RG结构域甲基化，但没有使全长SmD1与GST融合的RG区域甲基化。当SmD1与GST融合时，可能是JBP1的不良基质。为了解决这一问题，我们生产了重组His-tagged SmD1（His-D1）和SmD3（His-D3），并发现在上述相同条件下，Flag-JBP1确实可以甲基化His D1，其效率与His D3类似（图。G） ●●●●。这些结果表明，JBP1可以特异性地甲基化SmD1、SmD3和SmB。
如果JBP1是Sm蛋白精氨酸甲基转移酶，它应该在Sm蛋白的RG结构域上形成sDMA而不是aDMA。为了测试这一点，Flag-JBP1与三H-SAM和GST融合到与SmD3（GST-TEV-D3c32）羧基末端融合的TEV蛋白酶位点。作为控制，高度活跃(55)重组His-tagged PRMT1（His-PRMT1）也用于甲基化GST-TEV-D3c32。甲基化后，将融合蛋白捕获在谷胱甘肽-脑葡萄糖上，洗涤并用TEV蛋白酶裂解。将释放肽的酸水解产物与标准物（sDMA、aDMA和MMA）混合，并在硅胶60板上通过薄层色谱进行解析（图。). 通过茚三酮染色显示标准氨基酸，并在磷光成像仪上显示放射性标记的精氨酸产物。正如预期的那样，已知的I型甲基转移酶PRMT1(34)生成了DMA和MMA。相反，JBP1生产sDMA和MMA。这些结果表明JBP1是一种II型甲基转移酶，它修饰SmD1和SmD3的RG结构域形成sDMA。
JBP1是一种II型蛋白精氨酸甲基转移酶。GST-TEV-D3c32标记有[三H] JBP1或PRMT1的甲基（如图所示）。在谷胱甘肽-Sepharose微球纯化并用TEV蛋白酶裂解后，D3c32肽在酸中水解；与aDMA、sDMA和MMA标准氨基酸混合（如图所示）；并在硅胶60薄层色谱板上分离。用茚三酮可视化甲基化精氨酸标准品三氢甲基化精氨酸残基在磷光成像仪上可见。
甲基体相关的SmD3可以在体外转移到SMN复合物中。
到目前为止的实验表明，SMN和甲基体这两种复合物结合不同形式的Sm蛋白。甲基体结合未修饰的Sm蛋白并产生sDMA修饰的Sm-蛋白，SMN优先结合sDMA修改的Sm蛋白质。因此，经甲基体sDMA修饰后，Sm蛋白可以转移到SMN复合体。为了确定与6S pICln相关的Sm蛋白与与甲基体相关的Sm-蛋白结合SMN复合体的能力是否存在差异，我们确定了来自梯度的这两个区域的myc-D3是否与SMN存在差异。为此，从瞬时表达myc-D3的细胞中制备细胞质提取物，并在蔗糖梯度上分离。含有myc-D3的6S和20S峰的馏分（图。B） 将SMN复合物混合并与固定在反旗帜珠上的SMN复合液孵育。洗涤后，通过Western blotting分析固定化SMN复合物结合的蛋白质（图。). 引人注目的是，来自甲基体而非6S组分的myc-D3与SMN复合物结合。相反，来自甲基体的JBP1没有与SMN复合物结合。这表明甲基体可以将Sm蛋白转移到SMN复合体。
讨论
这里我们描述了一种用于对称地二甲基化Sm蛋白的甲基体。我们证明了SMN复合物和甲基体是单独的复合物，并结合相同Sm蛋白的不同形式。我们证明SmD3可以从甲基体转移到SMN复合体，但在6S时来自pICln的SmD3不能（图。). 根据本文的结果以及SmD1和SmD3的RG域的sDMA修改对于它们与SMN的关联很重要(21)，我们提出了一个模型，其中甲基体甲基化SmD1和SmD3（可能还有SmB）将这些蛋白质靶向SMN复合体，以组装成snRNP核心颗粒（图。). JBP1与未修饰RG结构域的结合以及pICln与含RG Sm蛋白的Sm结构域结合（图。和)似乎将这些蛋白质募集到JBP1进行甲基化。基于注射重组pICln后抑制snRNP组装爪蟾卵母细胞，pICln被认为是snRNP组装的抑制剂(47). 我们的结果表明，pICln至少部分地作为JBP1甲基转移酶复合物的一个成分发挥作用，该复合物为SMN复合物产生甲基化的含RG的Sm蛋白，从而组装成snRNP。因此，过量的pICln可能会在SMN-Sm蛋白结合之前干扰这一途径，使得pICln-在Sm蛋白甲基化中发挥作用时，似乎是snRNP组装的一般抑制剂。
含有RG的Sm蛋白的甲基化将其靶向SMN复合体，以组装成snRNP核心颗粒。显示了甲基体对Sm-RG结构域翻译后甲基化的示意图。sDMA修饰后，Sm蛋白与SMN复合体结合，并与其他Sm蛋白（也结合SMN）一起组装在snRNA上，形成snRNP核心颗粒。
Sm蛋白被认为储存在细胞质中(50)，表明核心组装可能受到调节，我们的研究结果表明，甲基体可以调节RG型Sm蛋白与SMN的相互作用，从而调节snRNP组装。有趣的是，JBP1已被证明与JAK激酶相互作用(46)，增加了JBP1磷酸化可能调节其活性的可能性。JAK激酶已被证明参与许多细胞因子、激素和生长因子的信号转导（参考文献综述57)它们可能为细胞提供调节snRNP生物生成速率的能力。确定JAK激酶是否可以磷酸化JBP1，以及这是否可以改变JBP1的活性，将是一个有趣的问题。
免疫纯化的JBP1在SmD3的羧基RG末端产生sDMA修饰的残基，表明JBP1是一种II型甲基转移酶。JBP1制剂中的甲基转移酶活性不太可能是甲基转移酶污染的结果，因为高度保守的假定SAM结合域中的单点突变（R368A）大大降低了甲基转移酶的活性（图。). 其他研究表明，细菌产生的rJBP1具有精氨酸甲基转移酶活性，该活性比哺乳动物细胞产生的JBP1的活性低至少200倍(49). 我们在rJBP1的制备过程中无法检测到甲基转移酶活性。二硫键同聚或特异性磷酸化可能对JBP1活性很重要(46,49). 此外，由于JBP1作为大型复合物的一部分发挥作用，其活性可能需要甲基体的其他成分，例如Sm域结合蛋白pICln。I型甲基转移酶产生aDMA并构成细胞精氨酸甲基转移酶活性的大部分(25,55). 只有三种蛋白质被证明含有sDMA：髓鞘碱性蛋白(25)和SmD1和SmD3(5). 其中两个，SmD1和SmD3，与甲基体中的JBP1相关。在编写本文时，Branscombe等人报告说JBP1是一种II型甲基转移酶(6). 然而，这些作者没有证明JBP1甲基化Sm蛋白，也没有证明它在甲基体的背景下发挥作用，正如我们在这里所展示的那样。
我们发现pICln存在于细胞质中一个6S JBP1游离复合物和一个20S JBP1-含复合物中。在20S和6S配合物中均发现SmD3和SmD1和/或SmD2（图。). 基于脉冲相实验，提出Sm蛋白在组装成约11S的snRNP核心颗粒之前，先在4S-6S复合物中积累(18). 随后的工作还确定了约20S杂岩中的SmB和SmD3(1,22,50). 抗-Sm蛋白抗体免疫沉淀实验和Sm蛋白纯化鉴定了B/D3、D1/D2和E/F/G的前RNP-Sm蛋白复合物(48,50). 我们的结果表明，在6S络合物中，SmD3（而非SmB）与pICln相关，这与之前的工作一致，即B和D3在20S络合物（而非6S络合物）中相互关联(22,50,58). 我们的数据表明，SmD1和SmD3可以与6S，JBP1自由的pICln络合物相互作用，并且这些结合不需要羧基末端RG结构域。这与我们的数据一致，表明pICln与SmD1和SmD3的Sm结构域结合（图。). 相反，SmD1和SmD3的RG结构域是这些蛋白质与甲基体结合所必需的，这种结合可能至少部分地通过JBP1与RG结构区的直接结合来介导。
甲基体对于修饰Sm蛋白很重要，因此它们对SMN复合物具有更高的亲和力。这增加了甲基体活性降低可能降低Sm蛋白-SMN相互作用水平的可能性，这可能会产生与SMN水平降低或突变类似的后果，如SMA中的情况。因此，可以想象，甲基小体的缺陷或亚最佳功能也可能导致运动神经元退化或进一步加重SMA的严重性。
总之，我们提供的证据表明，SmD1和SmD3的RG结构域的修饰形成sDMA是由一种新型20S复合物甲基体进行的。甲基体的活性取决于甲基转移酶JBP1。甲基体的功能是产生sDMA修饰的SmD1和SmD3，这大大增加了它们对SMN复合物的亲和力。这些发现表明，Sm蛋白甲基化通过甲基体调控snRNP核心颗粒组装的snRNP组装途径。
