Raf激酶抑制剂蛋白与NF-κB诱导激酶和TAK1相互作用并抑制NF-kb B活化

摘要

转录激活因子核因子κB（NF-κB）是炎症、病毒和细菌感染以及其他应激刺激反应中大量基因上调所必需的。对NF-κB作出反应的基因编码多种细胞因子、细胞粘附分子、急性期反应蛋白以及凋亡抑制和效应蛋白。人们相信，这种基因表达的重新编程对于生理危机情况下的细胞生存至关重要(61). NF-κB对促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）刺激的反应已被广泛研究(17,30)；然而，调节并最终限制这些反应的机制仍不清楚(61).

我们在这里报道了最近发现的蛋白激酶抑制剂蛋白RKIP（Raf激酶抑制剂蛋白）可以抑制NF-κB的活化。RKIP首先被鉴定为Raf-1的相互作用伙伴，并被证明是Raf-1启动的有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应的负调控因子(75,76). Raf-1启动的途径由三种顺序作用的蛋白激酶组成：MAP激酶激酶（MAPKKK）、MAP激酶（MAPK）和MAPK。现在已经发现，这种基本关系在几个蛋白激酶途径中保持不变。在Raf-1通路中，MAPK是ERK1/2（细胞外信号调节激酶1和2），MAPKK是MEK1（MAP/ERK激酶1），MAPK本身是Raf-1。使用获得功能和损失功能方法进行的功能研究表明，RKIP干扰了Raf-1和MEK1之间的相互作用(75,76). 内源性RKIP耗竭上调Raf-1激酶活性和MAPK信号，而RKIP异位表达抑制Raf-1酶活性、MAPK信号以及v-Raf介导的转化。生化研究表明，RKIP能有效地解离预先形成的Raf/MEK复合物，并在动力学上表现为MEK磷酸化的竞争性抑制剂。在体内，在血清刺激静止细胞期间，内源性RKIP与Raf-1的相关性与Raf-1激酶活性呈负相关。

活性NF-κB是一种二聚体，可以由转录因子Rel家族的几个成员组装而成，并且在大多数细胞类型中表达某种形式的NF-κ的B(61). 在未经刺激的细胞中，NF-κB以非活性形式保留在细胞质中，与一系列抑制蛋白IκB（κB抑制剂）结合。NF-κB的激活需要IκB磷酸化和降解，这允许NF-κ的B二聚体转位到细胞核。几乎所有能激活NF-κB的刺激物都会导致两个丝氨酸残基（IκBα中的Ser-32和Ser-36）上的IκB磷酸化。该事件以IκB为靶点，通过60S蛋白质组快速多泛素化和降解(2,31).

介导IκBα磷酸化的激酶活性最近被鉴定为一个大型（700至900 kDa）多亚单位细胞质IKK（IκBkinase）复合物的一部分(25). 参与IκB在丝氨酸32和36位磷酸化的IKK复合物的三个组分已被克隆并命名为IKKα、IKKβ和IKKγ（也称为NEMO或IKKAP1）(14,47,48,58,62,72,74). α和β亚基显示IκB的激酶活性，而在IKKγ中没有发现可识别的激酶结构域。有人提出，IKKγ的两个分子与催化的IKKα/IKKβ异二聚体结合，IKKγ的C末端将该核心粒子与上游信号分子连接(25,47,78). 这些分子在NF-κB信号传导中的重要性已通过基因敲除小鼠的遗传分析得到证实(23,39,41,45,63,68,69).

NF-κB可以被几个激酶信号级联激活，并受到多个水平的调节。NF-κB激活途径中的一些激酶与MAPK途径中的激酶序列保持相关。IKKα和IKKβ的激酶结构域包含一个具有SXXXS基序的激活环，该基序对所有MAPKK通用，其在两个丝氨酸残基上的磷酸化激活了激酶。此外，对显性阴性突变体的过度表达和干扰研究表明，MAPKKK家族中的一些激酶，包括NIK（NF-κB诱导激酶）、MEKK1（MEK激酶1）、TAK1（转化生长因子β活化激酶1），混合链激酶3，和Cot/TPL2参与IKK对特定刺激的磷酸化和激活(20,37,42,46,50). 除MAPKKs外的蛋白激酶，如蛋白激酶C和B，也被报道作用于IKK上游(27,35,54,60)和IKK的同源物NAK（NF-κB激活激酶）被认为是IKK上游激活物(57,70).

虽然在识别激活IKK复合物的激酶方面取得了相当大的进展，但对可能影响这些途径的负调控因子知之甚少(61). 我们在这里表明，RKIP的异位表达足以下调NF-κB活性，而内源性RKIP活性的消融则上调NF-κB通路。具体来说，RKIP可以通过上游激酶对IKKα和IKKβ的活化磷酸化进行负调控。从机制上讲，RKIP与NIK和TAK1在物理上相关，并调节NF-κB通路对TNF-α和IL-1β介导的信号的反应。这种作用模式与MAPK途径中RKIP与Raf-1和MEK的相互作用具有惊人的相似性。

材料和方法

结果

RKIP是NF-κB信号通路的抑制剂。

在实验中研究RKIP在MAPK通路信号传导中的作用(75,76)，NF-κB报告子被用作对照，并注意到对活性的离散影响。因此，我们进行了一系列定向实验来检测RKIP在NF-κB信号传导中的作用。首先，我们通过微量注射抗体来抑制内源性RKIP活性，并通过测量一个新注射的NF-κB的表达来监测对核因子κB活性的影响lacZ公司记者E-sellacZ公司（图。​（图1A）。1A） ●●●●。微量注射亲和纯化的抗RKIP抗体强烈激活NF-κBlacZ公司Rat1成纤维细胞中的报告子，其程度与微注射编码NF-κB p65亚基的质粒引起的程度大致相同（图。​（图1A）。1A） ●●●●。这种效应是特异性的，因为注射对照免疫球蛋白G（IgG）无效，抗RKIP IgG不影响环腺苷酸依赖性报告基因CRE×5的表达lacZ公司（图。​（图1A，1A、 钢筋1和7）。异位表达实验证实了这些结果，表明转染RKIP表达结构使NF-κB和AP-1报告子的基础活性降低到大致相同的程度（图。​（图1B）。1B） ●●●●。这种抑制是特异性的，因为缺乏NF-κB结合位点的报告者没有观察到这种作用（图。​（图1B，1B、 钢筋5和6）。

在单独的窗口中打开

图1

RKIP的消融激活和过度表达抑制了基础NF-κB的活性。（A） 通过抗体注射消融RKIP活性可激活NF-κB依赖性报告子（E-sel），但不激活环AMP刺激的报告子（CRE×5）。E-sel是一个E-选择素启动子DNA片段，包含一个一致的NF-κB结合位点拷贝(71). 静态Rat1细胞被微量注射所示的报告质粒和抗体，未经刺激或用每毫升20μg forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）处理。（B） RKIP过度表达抑制NF-κB-和AP-1依赖性报告子。RKIP置于巨细胞病毒（CMV）启动子（CMV-RKIP）的控制下。将RKIP或空载体对照（CMV）与指示的报告质粒共同转染到指数生长的NIH 3T3细胞中，48小时后检测提取物的荧光素酶活性。记者结合空CMV载体的活动设置为100%。在所有面板中，显示了至少两个独立实验的平均值和标准偏差。

根据报道的Raf对NF-κB信号传导的影响(15,40,52)，我们认为，观察到的RKIP阻遏可能是Raf/MEK/ERK通路的串扰的结果。为了解决这个问题，我们研究了MEK抑制剂（如U0126）对NF-κB荧光素酶报告子的抑制作用。这些实验表明，在取消MEK活性的U0126浓度下，未刺激、活跃生长的细胞中NF-κB信号的显著抑制可以发生（图。​（图2A2A和B，车道4至6）。U0126的作用是特异性的，因为它对Sp1反式激活活性没有影响（图。​（图2B，2B、 车道1至3）。MAPK和NF-κB通路之间确实存在相互作用，但其大小不足以解释RKIP对NF-κ）B活性的影响。例如，我们观察到，在指数循环293细胞中发现的大约20%的NF-κB基础活性可以被MEK抑制剂抑制，因此很可能是由Raf/MEK/ERK途径的串扰引起的（图。​（图2A，2A、 车道1和2）。

在单独的窗口中打开

图2

RKIP可以独立于MEK抑制NF-κB。（A） MEK活性的药理抑制不会干扰RKIP抑制基础NF-κB活性的能力。如图所示，将293个细胞与空载体（巨细胞病毒[CMV]）、RKIP表达载体（CMV-RKIP）和NF-κB报告子（NF-κ的B×3Luc）共同转染。转染后24小时，用含有10μM MEK抑制剂U0126（通道2和4）或同等体积载体（二甲基亚砜）（通道1和3）的培养基替换培养基。24小时后采集细胞，测定荧光素酶活性。相对于由报告基因加上空的CMV载体（泳道1）引起的活性计算抑制，其被赋予100%的值。（B） 平行进行控制实验，以证明U0126在所用条件下是活性的。Gal4（DNA-binding domain）-Sap1（transactivation-domain）融合蛋白[CMV-Gal4（Sap1）]与Gal4记者（Gal4×4-Luc）联合使用。Sap1事务激活域是ERK的已知目标。激活（通道5）是相对于Gal4-only向量[CMV-Gal4（1至94）]（通道4）测量的，并设置为1。为了控制U0126的非特异性效应，使用Gal4-Sp1（反式激活域）融合蛋白[CMV-Gal4（Sp1）]。众所周知，该反式激活域独立于ERK活性，并且未被U0126（通道1至3）抑制。

RKIP与IKK和NF-κB上游激酶激活剂的相互作用。

RKIP最初被鉴定为Raf-1的抑制剂，Raf-1是MAPKKK家族中的一种激酶。MAPKKK家族的三种激酶TAK1、MEKK1和NIK最近被认为是NF-κB通路的上游激活物(37,38,46,50). 基于它们与Raf-1的功能相关性，我们认为这些激酶可能是RKIP的靶点，因此，我们直接测试了物理相互作用的证据。用FLAG标记的RKIP和各种HA标记的MAPKKs转染COS-1细胞，用FLAG标签特异性抗体免疫沉淀细胞裂解物，用HA标签特异性的抗体免疫印迹观察MAPKKS的共免疫沉淀。明显可检测到的TAK1与RKIP共免疫沉淀（图。​（图3A）。三A） ●●●●。TAK1与RKIP的共免疫沉淀具有特异性，因为当转染中不包括FLAG-RKIP时，在抗FLAG免疫沉淀中未发现HA-TAK1（图。​（图3A）。三A） ●●●●。HA-MEKK1或HA-ASK1均未观察到HA标签交叉反应物质，MAPKKK与TNF-α介导的JUN激酶途径激活有关(11,51). 除HA-MEKK1外，所有被测蛋白在COS-1细胞中的表达水平大致相同（图。​（图3A）。三A） ●●●●。使用类似的方法，我们还测试了RKIP与NIK的相互作用，并观察到FLAG标记的NIK和HA标记的RKIP的共同免疫沉淀。尽管RKIP对NIK的结合亲和力明显低于Raf-1，但这种结合具有高度的特异性，因为在同一实验中，FLAG标记的蛋白磷酸酶2A（催化亚基）没有与HA-标记的RKIP发生免疫沉淀（图。​（图3B）。三B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图3

NIK、TAK1、IKKα和IKKβ与RKIP的免疫共沉淀。（A） 将FLAG-RKIP与指定的HA标记表达质粒共转染到COS-1细胞中。提取物用所示的抗HA或抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到膜上，用所示抗体通过免疫印迹（IB）监测HA标记或FLAG标记蛋白的表达水平。（B） 将HA-RKIP与标记的FLAG表达质粒共转染到COS-1细胞中。如上所示对提取物进行分析。（C） HA-RKIP单独或与FLAG-标记的IKKα或IKKβ表达质粒共转染COS-1细胞。如上所示对提取物进行分析。

IKKα和IKKβ都含有典型的MAPKK激活环，并且MEK（一种MAPKK）在体内和体外结合RKIP，这促使我们将RKIP相互作用研究扩展到IKK。使用上述方法，通过在COS-1细胞中表达的FLAG标记的IKK和HA-RKIP的共免疫沉淀来研究IKKα、IKKβ和RKIP的相互作用。IKKα和IKKβ共同免疫沉淀可检测到的RKIP数量（图。​（图3C）。三C） ●●●●。虽然结合较弱，但我们观察到的RKIP、IKKα和IKKβ之间的相互作用似乎是特定的，因为我们没有检测到RKIP和另一种IKK相关激酶NAK之间的任何关联（数据未显示）。

RKIP抑制NIK和TAK1介导的NF-κB活化。

为了研究上述RKIP、NIK、TAK1和IKKα/β之间的物理联系的功能后果，我们利用这些激活物激酶的异位表达可以上调NF-κB反应性报告子这一事实。因此，在NF-κB荧光素酶报告子存在的情况下，用不同的激酶和RKIP表达载体组合转染293细胞。为了检测RKIP对TAK1介导的NF-κB报告子活化的影响，除了TAK1外，转染中还包括TAB1，一种重要的TAK1辅活化因子(50). IKK的所有四个上游激酶激活物，即NIK、NAK、TAK1和MEKK1，都刺激了NF-κB报告子（图。​（图4）。4). 如前所述，不同激酶对NF-κB活性的刺激程度不同，其中NIK最强（50倍），其次是NAK（20倍），TAK1和MEKK1（4-5倍）(37,38,46,49,50,70). RKIP强烈拮抗NIK诱导的NF-κB的激活（高达五倍），而更弱的拮抗TAK1诱导的激活（达两倍）。值得注意的是，RKIP不拮抗NAK或MEKK1引起的激活（图。​（图4A4A和B）。RKIP下调NIK和TAK1介导的NF-κB报告子活化并不是NIK和TAK1表达水平降低的结果，因为当RKIP过度表达时，我们没有观察到内源性NIK和TAK1蛋白水平降低（数据未显示）。综上所述，这些体内激活实验的结果与共免疫沉淀结果完全一致。

在单独的窗口中打开

图4

RKIP抑制NIK和TAK1介导的NF-κB活化。如图所示，用NF-κB荧光素酶报告子（NF-κ·B×3）、RKIP表达载体（CMV-RKIP）或空载体对照（巨细胞病毒[CMV]）和NIK、NAK、TAK1、MEKK1、IKKα、IKK-β和NF-κ-B/p65表达载体共同转染293个细胞。NIK和NAK（A）、IKKα、IKKβ和NF-κB/p65（B）以及TAK1和MEKK1（C）载体分别以两种DNA浓度转染：0.1和0.5μg/35-mm直径平板。NF-κB×3、CMV-RKIP和CMV载体保持不变（NF-κ的B×3为50 ng，CMV-RKIP和CMV为2μg）。每个平板的总DNA浓度与pUC19质粒DNA保持恒定。在没有激活激酶的情况下，NF-κB×3与CMV载体控制共转染引发的活性设置为1。在转染后2天，制备细胞提取物并分析荧光素酶活性。在内部转染控制（胸腺嘧啶激酶启动子驱动雷尼利亚荧光素酶报告子）。

为了进一步描述RKIP在NF-κB激活级联中的作用位置，我们检测了其对NF-κ的p65亚单位转染诱导的反式激活的影响。RKIP对NF-κB报告子的p65介导的活化没有影响（图。​（图4C）。4C） ●●●●。该下游点的阻断失败表明RKIP并不直接干扰NF-κB的活性，而是作用于上游。有趣的是，RKIP也没有阻断由IKKα和IKKβ过度表达引起的NF-κB的激活（图。​（图44C） ●●●●。

RKIP抑制IL-1β和TNF-α介导的NF-κB活化和IKK活性。

根据之前的研究结果，NIK和TAK1是IKK对促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的生理激活剂(46,50,67)我们还研究了RKIP对TNF-α和IL-1β介导的NF-κB活性刺激的影响。在293个细胞中，RKIP持续降低TNF-α介导的NF-κB活性刺激达五倍（图。​（图5，5，左侧面板）。NF-κB的TNF-α刺激量和RKIP抑制作用量与NIK过度表达的结果显著平行（对比图。​图5，5，左侧面板，图。​图4A）。4A） ●●●●。与TAK1是RKIP靶点的结果一致，我们还观察到RKIP对IL-1β介导的NF-κB报告子的激活产生了明显的抑制作用（图。​（图5，5，右侧面板）。重要的是，这种效应的大小与RKIP对外源性表达的TAK1所诱导的效应相当（对比图。​图5，5，右侧面板，图。​图4B）。4B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图5

RKIP抑制TNF-α和IL-1β介导的NF-κB活化。293（A）或293/IL-1R1（B）细胞转染有NF-κB荧光素酶报告子（NFκB×3）和RKIP表达载体（CMV-RKIP）或空载体对照（巨细胞病毒[CMV]）。转染后30小时，细胞未经处理或用TNF-α（A）或IL-1β（B）刺激6小时，制备提取物并分析荧光素酶活性。图中的数据代表了我们进行的三个实验。

为了更直接地检测RKIP抑制对IKK酶活性的影响，我们用带有或不带有RKIP的FLAG-标记的IKKα或IKKβ转染293细胞，然后用TNF-α刺激细胞。用抗FLAG抗体对IKKα和IKKβ进行免疫沉淀，并在[γ-³²P] ATP用于自体磷酸化以及外源性添加的GST-IκBα底物的磷酸化（图。​（图6）。6). 据报道，TNF-α治疗可刺激IKK对IκBα的活性（图。​（图6A）。6A） ●●●●。有趣的是，在两种分析中，转染中包含RKIP将体外IKK活性降低了四到五倍（图。​（图6A）。6A） ●●●●。与先前的报告一致，IKK的自磷酸化程度与激酶活性直接相关，我们观察到在RKIP存在下IKKα和IKKβ自磷酸化下调（图​（图6B）。6B） ●●●●。这些结果表明，RKIP可以拮抗TNF-α处理细胞引起的体内IKK活性激活。为了检测RKIP是否直接抑制IKK活性，在COS-1细胞中表达FLAG-标记的IKK，用TNF-α刺激细胞，用抗FLAG抗体纯化FLAG-IKK。以GST-IκBα为底物，采用体外激酶试验检测纯化细菌重组RKIP对IKK活性的影响。如图所示。​图6C，6C、 增加RKIP浓度（0至2.3μM）导致IκBα磷酸化的剂量依赖性降低。RKIP的抑制作用是特异性的，因为添加等量的牛血清白蛋白对IKK活性没有影响。

在单独的窗口中打开

图6

RKIP对IKKα和IKKβ磷酸化IκB蛋白的影响。（A） IKKα和IKKβ抑制IκBα磷酸化。用指示的FLAG-标记的IKK表达载体转染293个细胞，其中包括或不包括RKIP表达载体。转染30小时后，细胞要么未经处理，要么用TNF-α刺激10分钟。用抗FLAG抗体免疫沉淀IKK蛋白，并使用纯化的重组细菌表达全长IκBα和[γ-³²P] ATP作为底物。（B） 抑制IKKα和IKKβ自身磷酸化。如A组所述，转染293细胞。通过将IKKα或IKKβ免疫沉淀物与[γ-³²P] ATP。通过用多克隆抗FLAG抗体对激酶反应进行免疫印迹，测定每次检测中IKK总蛋白的量。（C） 体外RKIP对IKK活性的抑制。将COS-1细胞与FLAG-IKKα（1.5μg）、FLAG-IKαK44A（1.5μc）、FLAH-IKKβ（2μg）或FLAG-ICKβK44A瞬时共转染，剥夺血清24 h，然后用50 ng TNF-α/ml处理10 min。用FLAG-M2抗体免疫沉淀FLAG-标记蛋白，并用等分的免疫沉淀（IP）（10μl）在冰上孵育30分钟，同时增加RKIP（2.5至22.5μM）或22.5μM牛血清白蛋白的浓度。激酶反应是通过加入10μl含有2.5μM GST-IκB（氨基酸5到55)、50μM ATP和3μCi[³²P] 1×激酶缓冲液中的ATP。IKKα反应在30°C下孵育10分钟，IKKβ反应孵育30分钟。（D）RKIP干扰TNF-α诱导的体内IκBα降解。用所示表达载体转染293个细胞。转染30小时后，细胞要么未经处理，要么用TNF-α刺激10分钟。用抗FLAG或抗RKIP抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

为了研究RKIP的过度表达是否会抑制TNF-α诱导的内源性IKK的活化，我们利用了活化的IKK磷酸化的IκB是快速降解的靶点这一事实。将FLAG标记的IκBα单独或与HA标记的RKIP联合转染293细胞。用TNF-α处理细胞以激活内源性IKK活性，用抗FLAG抗体免疫印迹法监测FLAG-IκBα的表达水平，检测RKIP过表达的影响。正如预期的那样，TNF-α治疗后IκBα的表达水平降低（图。​（图6D）。6D） 。与RKIP在体外抑制IKK活性的结果一致，我们观察到RKIP对IKK介导的IκBα在转染细胞中的降解有明显的抑制作用（图。​（图66D） ●●●●。

内源性NIK和TAK1与RKIP共同免疫沉淀。

为了研究RKIP在蛋白表达生理水平下是否与NIK和TAK1相关，我们用抗RKIP抗体免疫沉淀Rat1成纤维细胞提取物中的RKIP。用TAK1或NIK特异性抗体监测抗RKIP免疫沉淀物中TAK1和NIK蛋白的数量。如图所示。​图7A，7A、 在抗RKIP免疫沉淀中可检测到内源性TAK1，但在对照免疫沉淀中未检测到。根据之前的调查结果(50)IL-1β治疗刺激TAK1的活性，我们决定研究IL-1β是否会影响TAK1与RKIP的关联。用HA-RKIP转染293细胞，血清饥饿，IL-1β刺激5或15分钟。通过共免疫沉淀和TAK1抗体免疫印迹检测内源性TAK1与HA-RKIP的相关性。尽管检测到的TAK1与循环细胞中的RKIP有关（图。​（图7A），7A） ，从去血清293细胞裂解物中的抗HA免疫沉淀物中未检测到TAK1（图。​（图7B）。7B） ●●●●。有趣的是，在IL-1β刺激5分钟后发现TAK1与HA-RKIP相关，并且在15分钟后这种相关性显著降低（图。​（图7B）。7B） ●●●●。注意，RKIP与TAK1的结合和解离与之前报道的TAK1活化动力学密切相关(67). RKIP是否能直接抑制TAK1的激酶活性尚待观察。

在单独的窗口中打开

图7

内源性TAK1和NIK与RKIP的免疫共沉淀。（A） 从Rat1成纤维细胞提取物中共免疫沉淀RKIP和TAK1。Rat1细胞（2×10⁷)在磷酸盐缓冲盐水中通过超声波进行溶解。蛋白质提取物用抗RKIP或对照抗体进行免疫沉淀。用抗RKIP或抗TAK1抗体通过免疫印迹（IB）监测免疫沉淀的蛋白质。RKIP裂解物泳道中存在的条带不是IgG，而是来自与RKIP抗体交叉反应的蛋白质。（B） IL-1β治疗后TAK1与RKIP的相关性。用HA-RKIP表达载体转染293/IL-1R1细胞。转染30小时后，细胞被剥夺血清24小时，并按指示用IL-1β处理。细胞在低渗缓冲液中采集，并通过25号皮下注射针快速排出进行溶解。用抗RKIP或抗TAK1抗体免疫印迹法监测HA抗体免疫沉淀蛋白。（C） S100细胞溶质提取物的分离。按照材料和方法中所述，用DEAE-Sepharose色谱法对稳定转染HA-标记的RKIP的Rat1细胞制备的S100提取物进行分离。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用所示抗体进行免疫印迹，对组分进行分析。FT，色谱柱流动。（D） 从DEAE-Sepharose色谱组分中共免疫沉淀RKIP、NIK和TAK1。将通过免疫印迹显示含有NIK、TAK1和HA-RKIP的级分（如图C所示）合并，并用抗HA或对照抗FLAG抗体进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法监测沉淀蛋白。

尽管我们在Rat1成纤维细胞裂解液中检测到内源性TAK1和RKIP的相关性，但尽管多次尝试，我们还是未能在抗RKIP免疫沉淀物中检测到NIK或在抗NIK免疫沉淀物质中检测到RKIP。由于NIK和RKIP在两种蛋白的标记版本表达时共同免疫沉淀（图。​（图3B），三B） 我们认为NIK或RKIP抗体可能会干扰NIK/RKIP复合物的形成。为了解决这种可能性，我们通过逆转录病毒感染产生了一系列克隆性Rat1细胞系，表达一个带有HA标记的RKIP cDNA。选择一个表达HA-RKIP的克隆，其水平与内源性RKIP蛋白的水平相当（图。​（图7C）。7C） ●●●●。为了明确检测HA-RKIP与NIK的相互作用，我们用离子交换色谱法从内源性RKIP中分离HA-RKIP。这是可能的，因为带电的HA标签赋予HA-RKIP一个不同的色谱剖面，以将其与内源性RKIP区分开来。虽然大多数内源性RKIP在DEAE-Sepharose色谱柱的流通和洗涤馏分中检测到，但HA-RKIP与色谱柱结合，并且在盐梯度洗脱中与TAK1和NIK共分馏（图。​（图7C）。7C） ●●●●。为了进一步检查HA-RKIP和内源性NIK的相关性，将含有HA-RKIP和NIK的组分混合，并用抗HA抗体进行免疫沉淀。正如预期的那样，HA-RKIP在抗HA免疫沉淀中检测到，但在对照免疫沉淀中未检测到（图。​（图7D）。7D） ●●●●。为了检测内源性NIK是否与RKIP相关，用抗NIK抗体免疫印迹抗-HA免疫沉淀物。如图所示。​图7D，7D、 在抗HA免疫沉淀中检测到明显可检测的NIK量，但在对照免疫沉淀中未检测到。作为对照，监测相同的抗HA免疫沉淀物中是否存在肌动蛋白，肌动蛋白也与DEAE柱中的HA-RKIP共存；尽管肌动蛋白丰度很高，但没有检测到（图。​（图7D）。7D） ●●●●。与粗Rat1蛋白提取物的共免疫沉淀实验结果一致，在抗HA免疫沉淀中也检测到TAK1（图。​（图77D） ●●●●。

讨论

首次证明RKIP的功能是Raf/MEK/ERK信号通路的负调节因子。由于RKIP是一种比Raf-1丰富得多的蛋白质，我们考虑了它可能具有额外的细胞内靶标的可能性(75,76). 在本研究中，我们发现了RKIP通过NF-κB途径影响信号传导的证据。正如Raf/MEK/ERK通路中的情况一样，RKIP活性对NF-κB通路产生负面影响。

两种不同的模型可以解释RKIP介导的NF-κB抑制。首先，RKIP可以抑制NF-κB的活性，因为它以前已经证明对Raf/MEK/ERK通路有影响。其次，RKIP可以直接干扰导致NF-κB活化的途径。这封信中提出的几条证据强烈表明了一种直接的行动方式。首先，我们一致观察到RKIP与NF-κB通路的一些但不是全部上游激活激酶之间的特定物理联系。在异位表达系统和生理水平蛋白质表达下的细胞提取物中都检测到了这些关联。其次，RKIP可以抑制由部分而非全部上游NF-κB活化激酶激活所引发的NF-κ子B活性。最重要的是，物理相互作用和体内激活研究的结果完全一致。RKIP与NIK和TAK1相互作用并阻断，但既不与MEKK1或NAK1相互作用也不阻断。重要的是，TAK1和RKIP之间的联系是通过IL-1β（已知的TAK1活性激活剂）处理细胞后进行生理调节和诱导的。第三，在MEK活性药物抑制剂存在的情况下，RKIP可以有效拮抗NF-κB活性。

我们的基因上位性分析涉及NIK、IKKα、IKKβ、TAK1、NAK1、MEKK1和p65 NF-κB的过度表达，结果表明，RKIP仅对NIK-和TAK1介导的NF-κ的活化发挥抑制作用。事实上，RKIP不干扰MEKK1介导的NF-κB的激活，这表明RKIP通过涉及所有MAPKKs的混杂相互作用，对NFκB信号传导没有普遍影响。遗传上位性数据的最简单解释是RKIP作用于IKK上游。RKIP作用于与IκB上游激活物平行的途径并绕过IKK的可能性不大，因为RKIP可以通过TNF-α阻断IKK活性的激活。

我们的结果表明，RKIP与TAK1和NIK有物理交互作用，但与MEKK1没有物理交互作用。我们还检测到RKIP与IKKα和IKKβ的物理联系，这两种蛋白都属于MAPKKs家族(43). 由于RKIP与TAK1、NIK、IKKα和IKKβ的结合尚未通过纯化成分在体外实现，因此尚不清楚这些相互作用是否直接。然而，RKIP与Raf-1（MAPKKK）和MEK1（MAPKK）的相互作用已经过深入研究，并且已知是直接的(75). 因此，虽然不能排除RKIP和任何NF-κB途径激酶之间存在桥接伙伴，但无法根据Raf/MEK/ERK途径的研究预测。自TAK1以来，NIK、IKKα和IKKβ均被报道为700-kDa TNF-α诱导的IKK复合物的一部分(48)，RKIP也可能是该复合体的一部分。

部分描述了参与IL-1β和TNF-α信号传导的NF-κB激活途径，发现其涉及共享和独特成分(33,50,58,67). 这两条途径都集中在NIK上，NIK通过IKKα的直接磷酸化激活IKK。TAK1与NIK上游的IL-1β信号转导有关。与此观点一致，我们一致观察到RKIP对TNF-α和IL-1β介导的NF-κB活化的抑制作用。这种抑制可能部分是由于TAK1/NIK对IKK激活的抑制，因为我们观察到TNF-α处理过表达RKIP的293细胞提取物中IKKα和IKKβ的自磷酸化降低。这种抑制也可能是RKIP直接干扰IKK活性的结果，因为我们观察到RKIP在体外抑制纯化的TNF-α激活的IKKα和IKKβ的激酶活性。直接抑制IKK活性也与RKIP与IKKα和IKKβ共免疫沉淀的结果一致。与体外激酶检测结果一致，RKIP还通过干扰内源性IKK的活性，拮抗TNF-α诱导的IκBα降解。出乎意料的是，RKIP并没有通过IKKα或IKKβ的异位表达干扰NF-κB报告子的激活。这种差异可能是由于IKK的过度表达可能导致其他IκB或其他未知IKK底物的磷酸化和活化。因此，RKIP可能不抑制这些其他IKK底物的磷酸化。综上所述，我们认为RKIP通过拮抗NIK和TAK1激活IKK以及直接下调IKK复合物的活性，对TNF-α和IL-1β信号传导起到刹车作用。

在这些研究之前，IκB和A20蛋白是唯一已知的NF-κB信号传导的负调控因子(44,66). A20是一种细胞质锌指蛋白，在多种细胞中由TNF-α诱导(53). 小鼠敲除研究表明，在TNF-α刺激后，需要A20来下调IKK活性，但IL-1β刺激不需要A20(36). 在TNF-α刺激后，A20和IKK复合物被招募到TNF受体。有人提出A20通过与复合物的IKKγ亚基相互作用来拮抗IKK活性(21,79).

本报告中的数据表明，RKIP通过与IκB和A20不同的机制对抗NF-κB活性。与IκB不同，IκBs通过与Rel蛋白的直接相互作用抑制NF-κB，我们的上位性分析表明RKIP作用于p65上游。而据报道，A20主要作用于TNF-α信号(36)RKIP可抑制TNF-α和IL-1β介导的NF-κB活化。此外，基于TRADD、TRAF2、RIP和NIK过度表达的上位性分析表明，A20作用于NIK上游(21)而我们的数据表明NIK是RKIP的直接目标。RKIP是否在细胞因子受体刺激后被招募到细胞因子受体尚待确定。RKIP是否能与IKKγ相互作用也是未知的。

迄今为止，在所有被检测的哺乳动物物种中都发现了与RKIP高度同源的蛋白质（85%至95%的同源性）(18,56). 一个RKIP相关蛋白家族与哺乳动物蛋白的序列同源性为29%至55%果蝇属,秀丽隐杆线虫,酿酒酵母，几种寄生虫，包括卷尾蛇和犬弓蛔虫和开花植物金鱼草属和拟南芥(5,6,16,18,56,59,64). 尽管哺乳动物RKIP和其中一些同源物之间的序列保守性有限，但最近对两种哺乳动物RKIPs和金鱼草CEN揭示出它们显示了几乎相同的新型β-折叠拓扑(三,4,65). 哺乳动物RKIP和植物RKIP同源物在结构上的密切保守性增加了它们可能具有类似功能的可能性。事实上，遗传学研究表明，植物中的RKIP同源基因在控制植物结构和发育的信号转导途径中发挥作用(1,5,6,29,32).

来自不同生物体的新数据表明，RKIP和RKIP相关蛋白代表了一个新的高度保守的蛋白激酶调节因子家族(4). RKIP对Raf/MEK/ERK MAPK通路和NF-κB通路都有影响，这一事实增加了一种有趣的可能性，即RKIP和相关蛋白可能在许多不同的蛋白激酶信号通路中发挥作用。由于MAPK和NF-κB通路在生理上具有不同的作用，RKIP的功能可能在一定程度上协调这些通路的调节。

致谢

参考文献