国际分子科学杂志。2023年2月；24(4): 3687.
VDAC1基因敲除通过影响复合物I活性影响线粒体耗氧量触发ETC重排
,概念化,形式化分析,调查,方法,验证,写作——原稿,写作–审查和编辑,1,2,*† ,调查,方法,三，† ,调查,方法,三 ,调查,方法,三 ,调查,方法,三 ,调查,方法,4 ,调查,方法,4 ,数据管理,形式化分析,监督,写作——原稿,4 ,概念化,写作–审查和编辑,2,三和,概念化,监督,写作–审查和编辑1,2
安德烈亚·马格里
1卡塔尼亚大学生物、地质和环境科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
2我们。MitoBiotech S.R.L.，C.so Italia意大利卡塔尼亚174，95125
萨尔瓦多安东尼奥·玛丽亚·库比西诺
三卡塔尼亚大学生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
朱塞佩·巴蒂亚托
三卡塔尼亚大学生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
克里斯蒂亚娜·露西娅·丽塔·利帕里
三卡塔尼亚大学生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
斯特凡诺·孔蒂·尼巴利
三卡塔尼亚大学生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
米里亚姆·维萨姆·萨博
4卡塔尼亚大学医学生物化学部生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 97，95123 Catania，Italy
亚历山德拉·皮塔拉
4卡塔尼亚大学医学生物化学部生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 97，95123 Catania，Italy
安吉拉·玛丽亚·阿莫里尼
4卡塔尼亚大学医学生物化学部生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 97，95123 Catania，Italy
维托·德平托
2我们。MitoBiotech S.R.L.，C.so Italia意大利卡塔尼亚174，95125
三卡塔尼亚大学生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
安吉拉·梅西纳
1卡塔尼亚大学生物、地质和环境科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
2我们。MitoBiotech S.R.L.，C.so Italia意大利卡塔尼亚174，95125
德米特里·佐罗夫，学术编辑和弗朗西斯科·帕洛蒂，学术编辑
1卡塔尼亚大学生物、地质和环境科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
2我们。MitoBiotech S.R.L.，意大利C.so 174，95125卡塔尼亚，意大利
三卡塔尼亚大学生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 64，95125 Catania，Italy
4卡塔尼亚大学医学生物化学系生物医学和生物技术科学系，Via S.Sofia 9795123 Catania，Italy
†这些作者为这项工作做出了同等贡献。
收到日期：2022年11月6日；修订日期：2023年2月4日；2023年2月10日验收。
- 补充资料
GUID:76BC2766-22FB-4494-8EFF-B29921A904EA
- 数据可用性声明
不适用。
摘要
电压依赖性阴离子选择性通道亚型1（VDAC1）是线粒体外膜（OMM）孔蛋白最丰富的亚型，是离子和代谢物进出细胞器的主要通道。VDAC1还参与许多其他功能，如调节细胞凋亡。虽然该蛋白并不直接参与线粒体呼吸，但它在酵母中的缺失会触发整个细胞代谢的完全重新连接，从而使线粒体的主要功能失活。在这项工作中，我们详细分析了VDAC1基因敲除对近单倍体人类细胞系HAP1线粒体呼吸的影响。结果表明，尽管细胞中存在其他VDAC亚型，但VDAC1的失活与氧消耗的显著损伤和电子传输链（ETC）酶的相对贡献的重新组织相关。准确地说，在VDAC1敲除的HAP1细胞中，复杂的I连接呼吸（N通路）通过从呼吸储备中提取资源而增加。总的来说，这里报告的数据加强了VDAC1作为线粒体代谢的一般调节器的关键作用。
关键词：线粒体、VDAC1基因敲除、HAP1细胞、复合物I、呼吸储备
1.简介
电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）是线粒体外膜（OMM）上最丰富、最普遍表达的孔形成蛋白家族。VDAC蛋白质允许小的亲水分子被动扩散到5000道尔顿，通过调节线粒体和细胞其余部分之间的代谢串扰来保证OMM的通透性[1,2]. VDAC因其独特的电生理特性而得名，该特性在30多年前的人工膜重建实验中建立：通道电导随着施加的电压而变化，从高导电和阴离子选择性状态切换到低导电和阳离子选择性状态[三,4,5].
三个基因编码哺乳动物中三种高度保守的亚型。根据发现顺序，它们被命名为VDAC1、VDAC2和VDAC3[6]. 小鼠或人类VDAC1的三维结构[7,8,9]和斑马鱼VDAC2[10]它们都是可用的，并且共享一个由19条反向平行的β链组成的共同的β-桶跨膜孔，以及一个以α-螺旋结构组织的N末端结构域，这也得到了体外实验的证实[11]. 在亚型中，VDAC1含量最高，分别比VDAC2和VDAC3高出一个或两个数量级[12].
VDAC1位于细胞溶质和线粒体的界面，主要调节克雷布斯循环中间产物（丙酮酸、琥珀酸、苹果酸和谷氨酸）、ADP/ATP、离子（钠+，K+，氯−)、核苷酸和NAD+/NADH，从而支持整个细胞生物能量学[13,14,15,16]. 此外，VDAC1作为许多细胞溶质蛋白的锚定，包括己糖激酶和Bcl-2家族的特定成员，参与调节线粒体介导的凋亡[17,18,19,20]. 鉴于这些考虑，VDAC1已迅速成为癌症和神经变性的药理靶点[21,22,23,24].
与亚型1类似，VDAC2是细胞死亡和存活的关键调节剂，通过与Bak和Bax相互作用发挥促凋亡和抗凋亡功能[25,26,27]. VDAC3的作用似乎更为复杂：它具有特定的电生理特征和翻译后修饰，这些修饰随着氧化还原环境发生显著变化[28,29,30]. 然而，直到最近我们的小组才明确证明VDAC3是一种氧化还原感应蛋白，可以保护线粒体免受氧化应激[31].
VDAC功能的许多信息来自基因失活研究。在酵母中酿酒酵母具有单一功能的线粒体孔蛋白[32]VDAC1失活会显著影响线粒体DNA的维持和表达以及细胞器的功能，导致整个细胞代谢的完全重新连接[33]. 在哺乳动物中，由于存在其他亚型，敲除实验的解释变得更加复杂，这可以部分补充VDAC1的缺乏。有趣的是，在小鼠胚胎成纤维细胞中，VDAC1缺失促进基因表达的部分重排，从而引发代谢损伤和活性氧（ROS）的积累[34]，部分重叠了酵母中已经看到的变化。此外，VDAC1基因敲除使H9c2细胞更容易受到ROS诱导的凋亡[35]而在慢性粒细胞白血病衍生细胞中，它与线粒体质量的轻微减少和线粒体膜的超极化有关[31]. 然而，尽管VDAC1在线粒体代谢中发挥着重要作用，但其可能参与线粒体呼吸的调节尚未得到充分研究。
为了研究上述机制，利用近单倍体人HAP1细胞敲除VDAC1进行了高分辨率呼吸（HRR）实验。结果清楚地表明，VDAC1的缺乏或其部分抑制与主要呼吸状态下的耗氧量减少相关。同时，VDAC1基因敲除细胞通过提高复杂I连锁呼吸的相对效率，耗散部分呼吸储备，从而进行呼吸的重新排列。总的来说，这些发现说明了VDAC1作为线粒体功能的关键调节器的关键作用。
2.结果
2.1. HAP1ΔVDAC1细胞的特性
HAP1细胞具有每条染色体的一个拷贝，是基因敲除研究的强大模型[36]. 如图所示A、 VDAC1表达的失活是通过相应基因外显子VI中2 bp的缺失实现的。在得到的细胞系（即ΔVDAC1）中，Western blot实验中抗VDAC1抗体未检测到蛋白带(B） ●●●●。相反，表达野生型VDAC1蛋白（此处用作参考对照）的亲本系细胞在预期分子量约32kDa时显示出易于检测的条带(B） ●●●●。此外，还测试了VDAC2和VDAC3亚型的表达水平。在这方面，经量化证实，ΔVDAC1和亲代细胞之间未检测到显著差异(B） ●●●●。因此，与其他细胞系不同[12]，HAP1细胞中VDAC1的不表达并不影响其他VDAC亚型的表达。与之前观察到的情况类似[31]，VDAC1敲除不会改变细胞增殖或生存能力：如所示C、 ΔVDAC1 HAP1细胞的生长曲线与亲本细胞几乎重合；此外，在MTT试验中未观察到显著差异(D） ●●●●。相反，与亲代HAP1相比，敲除细胞中线粒体质量轻微但显著减少，为−10.5%(第页= 0.0012,n个=3），如流式细胞术定量MitoTraker荧光信号所示(E） ●●●●。
本研究中使用的HAP1细胞的表型特征(A类)VDAC1基因敲除的图式化：在VDAC1的外显子VI中进行了2 bp的缺失。(B类)亲代和ΔVDAC1细胞总裂解物的代表性Western blotting（左）和相对蛋白水平定量（右），显示了三种VDAC亚型的表达。正如预期的那样，在敲除细胞中未检测到VDAC1蛋白带。N.D.-未检测到。(C类)增殖试验表明样品之间没有显著差异。数据显示为的平均值±SDn个=3个独立计数，通过双向方差分析进行统计分析；ns-不显著。(D类)MTT法的细胞活力分析显示样品之间没有显著差异。(E类)流式细胞术对亲代和ΔVDAC1细胞中MitoTraker信号的定量。观察到大约10%的轻微但显著的差异。中的数据(D类,E类)表示为平均值±SEMn个=3个独立计数，由未配对者进行统计分析t吨-测试，使用**第页< 0.01; ns-不显著。
2.2. VDAC1基因缺失或其蛋白抑制对HAP1细胞耗氧量的影响
用HRR研究HAP1细胞的总耗氧量。该技术可以测量相对于不同呼吸状态的氧流量，以及每种状态或特定电子传输链（ETC）复合物对实现最大呼吸容量的贡献[37]. 为此，底物-非偶联剂抑制剂滴定（SUIT）协议被用作除了HAP1亲本细胞的代表性曲线外，还有A。特别是，曲线显示了添加特定分子后耗氧量的变化。简言之，在完整细胞中测量内源性底物（常规状态）存在下的呼吸；然后，通过质膜的轻度渗透和特定底物和ADP的刺激，评估氧化磷酸化相关呼吸（OXPHOS状态）；最后，用解偶联剂滴定法确定电子传递链的最大电子输入。
HAP1细胞的耗氧量。(A类)亲代HAP1细胞线粒体呼吸剖面的代表性曲线，以及用于完整细胞和渗透细胞的SUIT协议。对丙酮酸盐；苹果酸甲酯；谷氨酸；地高辛；S-琥珀酸酯；鱼藤酮；阿玛霉素。(B类)定量分析ROUTINE、OXPHOS的耗氧率和HAP1细胞中的最大ET容量，以pmol/second/百万细胞表示。与亲代相比，ΔVDAC1细胞在每种状态下的耗氧量都显著降低。数据显示为中位数±SEMn个=6个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试，使用***第页< 0.001.
然后将相同的方案应用于ΔVDAC1细胞，计算主要呼吸状态下的耗氧量，并与对照组进行比较（参见补充图S1ΔVDAC1电池的代表曲线）。如所示B、 VDAC1的敲除会显著影响所有分析状态下的氧气流量。准确地说，ΔVDAC1细胞在完整细胞（ROUTINE）中显示约58%的通量减少，在细胞渗透和刺激OXPHOS活性后显示约68%(第页<0.001 vs.父母HAP1，n个= 6). 此外，与最大容量相关的耗氧量减少了约76%(第页<0.001 vs.父母HAP1，n个= 6).
基于这些结果，我们质疑这些减少是直接由于VDAC1失活还是由于我们的敲除模型中发生的VDAC1非依赖性变化。为此，将亲代HAP1细胞暴露于亚致死剂量的VBIT-12（一种特定的VDAC1抑制剂）。VBIT是一组能与VDAC1相互作用的穿透细胞的小分子，以其降低通道电导的能力而闻名[38,39]. 在这种特殊情况下，通过测量常规状态和最大ET容量，HRR分析仅限于完整细胞(A） ●●●●。值得注意的是，这些参数是在用VBIT-12快速治疗后评估的，以避免因长期接触该分子而产生任何最终副作用。如中所述B、 在VBIT-12处理的细胞中观察到呼吸显著减少，其中ET容量为-22%(第页=0.01与DMSO处理的细胞相比，n个= 6). 虽然不显著，但在常规状态下也观察到类似的下降趋势(第页= 0.07,n个= 6). 相反，VBIT-12在暴露于该分子的ΔVDAC1细胞中没有显著作用(补充图S2)表明VBIT-12对VDAC1具有特异性抑制作用。
暴露于VBIT-12后HAP1细胞的耗氧量。(A类)亲代HAP1完整细胞线粒体呼吸剖面的典型曲线以及此处使用的SUIT协议。为了达到最大呼吸容量，增加了解偶联CCCP。(B类)定量分析先前用VBIT-12或DMSO处理过的HAP1亲代细胞的ROUTINE耗氧率和最大ET容量（对照）。在处理过的细胞中观察到ET容量显著降低。数据表示为每百万个细胞的pmol/second，并显示为n个=6个独立实验。数据通过未配对进行统计分析t吨-测试，使用*第页< 0.05; ns-不显著。
综上所述，这些结果明确支持VDAC1在线粒体呼吸调节中的关键作用。
2.3. VDAC1敲除改变呼吸状态或复合物对ET容量的贡献
接下来，通过分析流量控制比（FCR），以独立于线粒体质量或其他外部因素的方式研究每个呼吸状态或ETC复合物对实现最大容量的相对贡献[37,40]. 在A、 显示了ROUTINE和OXPHOS对最大呼吸的相对贡献。令人惊讶的是，ΔVDAC1细胞中的常规贡献更高（+37%，第页=0.0053 vs.父母HAP1，n个= 6). 以类似的方式，当VDAC1基因敲除约15%时，OXPHOS的相对贡献增加(第页=0.004 vs.父母HAP1，n个= 6). 值得注意的是，ROUTINE和OXPHOS达到最大呼吸量的方法分别与呼吸储备（E-reserve）和过剩（E-excess）的显著减少相关(A、 虚线直方图），由生物能量供应组成，线粒体可以在进一步刺激的情况下吸收，产生额外的ATP[41].
HAP1细胞通量控制比（FCR）分析。(A类)计算并证明了ROUTINE和OXPHOS状态对ET容量的特定贡献，以及呼吸储备（虚线直方图）、E-Reserve和E-Excess。ΔVDAC1细胞的两个FCR值均显著增加，这对应于储备的成比例减少。(B类)针对泄漏状态计算的FCR。亲代和ΔVDAC1细胞之间未检测到显著差异。中的数据(A类,B类)显示为平均值±SEMn个=6个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试，使用**第页<0.01和***第页< 0.001; ns-不显著。
根据之前的结果，我们质疑ROUTINE和OXPHOS贡献的增加是否是由于非磷酸化组分（即所谓的LEAK状态）的比例增加所致，此处是在质膜渗透后测量的，即允许ADP离开细胞。如中所述B、 然而，LEAK的贡献在样本中没有变化。
接下来，我们分析了与NADH底物（N途径）或琥珀酸（S途径）相关的呼吸，即分别与复合物I或II耦合的呼吸。准确地说，N-途径是在丙酮酸、苹果酸、谷氨酸和ADP的饱和浓度下实现的，而不是琥珀酸。如图所示A、 在这种结构中，电子完全通过Q结从络合物I流向络合物III。或者，在饱和浓度的琥珀酸盐和鱼藤酮（配合物I的一种特定抑制剂）存在下，电子可以从配合物II流向Q结(B） ●●●●。
HAP1细胞中N-和S-通路的分析。(A类,B类)在我们的实验HRR装置中ET链活性的示意图。通过Q-连接激活复合物III只能由复合物I或II发生，精确地说是通过用NADH-连接底物刺激复合物I，并且在没有琥珀酸（N-途径，A类)或在鱼藤酮抑制复合物I（S途径，B类). 对丙酮酸盐；苹果酸甲酯；谷氨酸；S-琥珀酸酯；Rot-rotenone公司。(C类)定量分析N-和S-途径的耗氧速率，以百万细胞pmol/second表示。与亲代相比，ΔVDAC1细胞在每种状态下的耗氧量都显著降低。(D类)计算N-和S-通路的FCR显示，ΔVDAC1细胞中N-的增加超过S-通路。数据显示为中位数(C类)或表示(D类)±SEMn个=6个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试**第页<0.01和***第页< 0.001.
就耗氧量而言，N-和S-途径的减少与ΔVDAC1细胞的典型呼吸曲线一致（分别为−65%和−82%，第页<0.001 vs.父母HAP1，n个= 6,C） ●●●●。此外，FCR分析中出现了有趣的差异。特别是，如中所示D、 在ΔVDAC1细胞中观察到N途径的相对贡献显著增加（+24%，第页=0.0026 vs.父母HAP1，n个=6）被S途径的相对贡献的减少所抵消（−34%，第页<0.001 vs.父母HAP1，n个= 6).
总之，FCR分析表明，以前在ΔVDAC1细胞中观察到的ROUTINE和OXPHOS呼吸作用的增加严格依赖于复合物I活性。
2.4. VDAC1敲除细胞中NADH的线粒体氧化增加
以磷酸化和非磷酸化烟酰胺二核苷酸形式存在的烟碱辅酶的细胞含量清楚地描述了氧化还原状态和线粒体功能。因此，我们分析了四种不同形式（NAD）的总浓度+、NADH、NADP+和NADPH；看见表S1原始数据）。如中所述A、 ΔVDAC1样品中的总烟碱辅酶库显著减少（−40%，第页=0.007 vs.父母HAP1，n个= 4).
HAP1细胞NADH减少分析。烟酰胺辅因子NAD总量的定量分析+、NADH、NADP+和NADPH(A类)、NAD比率+/NADH公司(B类)和乳酸的总体水平(C类). ΔVDAC1细胞中较低水平的烟酰胺辅因子被高NAD比例抵消+/NADH值。使用亲代HAP1作为对照，数据表示为倍增长。数据显示为中位数±SEMn个=4个独立实验，由非配对进行统计分析t吨-测试，使用**第页< 0.01; ns-不显著。
值得注意的是，这一发现与之前的呼吸测定结果一致，在该结果中观察到线粒体效率的调节，特别是限制氧气利用的新情况。有趣的是，NAD+/NADH增加20%(第页=0.007 vs.父母HAP1，n个= 4,B） 可能表明在络合物I水平上NADH氧化速率较高，从而确保OXPHOS或ET容量以及TCA循环的正常运行。根据这些数据，我们发现样本之间的乳酸浓度没有显著差异(C） 这表明，ΔVDAC1细胞中NADH的氧化增加主要是通过线粒体而不是通过乳酸脱氢酶进行的细胞溶质氧化[42].
2.5. VDAC1敲除使细胞对鱼藤酮更敏感，但对丙二酸不敏感
根据之前的观察结果，我们最终分析了特定ETC复合物抑制剂的作用。为此，使用了为完整细胞开发的SUIT协议。简而言之，CCCP达到了每个样品的最大ET容量；然后，用抑制剂滴定法监测呼吸变化。
鱼藤酮是一种亲脂的细胞渗透性分子，常用作复合物I的特异性抑制剂和模拟帕金森病分子特征的毒素[43].A显示了HAP1亲代细胞的典型曲线以及此处应用的SUIT协议。如报告所述，使用非饱和剂量的鱼藤酮进行纳米级滴定，如预期的那样，以剂量-反应的方式诱导ET容量逐渐减少。特别是，在此处使用的较高浓度（16 nM）下，与未经处理的对照组相比，ET容量减少了约50%(B） ●●●●。ΔVDAC1细胞也观察到类似的剂量-反应效应。然而，在这种特殊情况下，滴定效果更为明显：不仅2 nM鱼藤酮足以使ET容量减半(第页=0.0046 vs.父母HAP1，n个=3）但是，在较高浓度下，毒素会将ET容量降低80%(第页<0.001 vs.父母HAP1，n个= 3,B） ●●●●。
通过HRR分析HAP1细胞对复合I和II抑制剂的敏感性(A类)除此处使用的SUIT协议外，亲代HAP1完整细胞线粒体呼吸曲线的代表性曲线。在CCCP达到ET容量后，通过鱼藤酮滴定法（1-16 nM）监测呼吸。(B类)鱼藤酮滴定后ET容量的定量分析显示亲代和ΔVDAC1细胞的ET容量均减少。然而，与亲代细胞相比，ΔVDAC1细胞对鱼藤酮的敏感性增加。(C类)除了用于丙二酸滴定的SUIT方案（0.1–1.6μM）外，亲代HAP1完整细胞的线粒体呼吸谱的代表性曲线。(D类)定量分析表明用丙二酸滴定时ET容量降低。亲代和ΔVDAC1细胞的呼吸测定曲线无显著差异。中的数据(B类,D类)显示为平均值±SEMn个=3个独立实验，通过双向方差分析进行统计分析**第页<0.01和***第页< 0.01.
我们使用丙二酸重复了这个实验，丙二酸可以特异性抑制复合物II。如中所述C、 D，亲代和VDAC1基因敲除的HAP1细胞对丙二酸滴定的耐受性更好。事实上，在这里使用的最高浓度下，在两个样品中实现的最大抑制约为30%。无论如何，在亲代细胞和敲除细胞之间没有观察到显著差异(D） ●●●●。
这些结果再次表明了复合物I对ΔVDAC1细胞生物能量呼吸的贡献的重要性。
3.讨论
线粒体VDAC允许大多数底物的被动扩散，供给克雷布斯循环和ETC的呼吸酶[1,17]. 此外，正如原子力显微镜实验所揭示的那样，它们代表了OMM中最丰富的蛋白质，赋予了其典型的筛状外观[44,45]. 在酵母中酿酒酵母在完整的线粒体蛋白质组被描述的地方，每个线粒体估计有多达19000个VDAC1拷贝，这个数量大约是第二丰富的蛋白质Tom40拷贝数的十倍[46]. 由于这些原因，VDAC被广泛认为是维持OMM代谢交换的关键参与者。
为了描述主要亚型VDAC1在呼吸（线粒体的一种特殊功能）中的确切作用，我们使用了VDAC1敲除HAP1细胞系。单倍体系HAP1是一个特别有利的模型，因为基因敲除保证了相应基因产物的完全缺失。具体而言，我们使用的HAP1ΔVDAC1细胞系特别适合我们的目的，因为VDAC1基因的单一拷贝失活不会导致补偿反应和其他VDAC亚型表达水平的后续变化。此外，正如我们小组和一个独立小组最近所证明的那样，这种细胞模型可以很容易地用于完整或渗透协议中的HRR实验[31,47].
这里进行的详细HRR分析得出了许多有趣的结果。首先，尽管存在其他两种亚型，但VDAC1似乎是代谢物进出线粒体的首选途径。事实上，VDAC1失活显著影响HAP1细胞在所有三种主要呼吸状态下的耗氧量。这一结果不能仅用此处和其他地方观察到的线粒体质量的轻微减少来解释[31]VBIT-12的实验结果证实了这一点。
其次，常规呼吸和OXPHOS呼吸对ΔVDAC1最大容量的相对贡献显著高于亲本细胞。令人惊讶的是，这种情况发生时，呼吸的非磷酸化成分没有成比例增加。即使在生理条件下，由于ETC产生的质子梯度分数，线粒体耦合效率也始终低于100%，并在称为质子泄漏的过程中消散[48]. LEAK状态的增加是线粒体功能失常的常见结果，如线粒体内膜损伤或解偶联蛋白过度表达所观察到的，解偶联蛋白被细胞用作ROS积聚或其他应激刺激时的保护策略[49,50]. 并非巧合的是，许多病理状况与LEAK呼吸增加有关，这被广泛认为是线粒体功能障碍的标志[40,51,52,53,54]. 然而，ΔVDAC1细胞并非如此，因为两种HAP1细胞中LEAK状态的具体贡献是可比较的。
第三，就绝对值而言，在ΔVDAC1细胞中，N通路的减少方式与S通路或总OXPHOS类似。相反，其增加的FCR值，特别是NAD的持续比率+/NADH有利于氧化形式，表明络合物I在激活我们设置中的ETC方面的主要贡献大于络合物II。这些数据表明，VDAC1缺乏促使细胞重新排列线粒体代谢，涉及复合物I。正如我们的滴定实验所证明的那样，ΔVDAC1细胞对鱼藤酮更敏感，而对丙二酸不敏感，这确实不是巧合。
总的来说，这似乎是VDAC1基因敲除细胞采取的一种策略，即使VDAC1等关键蛋白缺失，线粒体也能保持活性。无论如何，这个过程是有代价的：敲除细胞从呼吸储备中获取资源，线粒体可以依靠呼吸储备在高能量需求或存在额外应激刺激时产生额外的ATP[41,55]. 与LEAK呼吸的增加类似，呼吸储备的限制正在成为一种功能失调参数，也是许多病理状况的共同特征，确切地说，是神经退行性过程[51,56].
以前在缺乏内源性VDAC1的ΔPOR1酵母细胞中获得了类似的结果。酵母中的两个基因编码两种孔蛋白亚型，两者都显示了人工膜中典型的VDAC孔特征[57,58]. 然而，只有VDAC1是组成性表达的。事实上，亚型2的表达可以忽略不计，并且主要发生在存在外部刺激的情况下[46,59]. 在这种情况下，整个新陈代谢被重组：由于线粒体DNA拷贝的急剧减少，线粒体基因的表达被完全抑制，细胞被迫转向基于脂质的新陈代谢[33]. 当然，在HAP1细胞中，由于存在其他亚型，VDAC1失活的后果不那么严重：如果在ΔPOR1中，没有VDAC1的替代物存在，则高等真核生物VDAC2和VDAC3会同时组成性表达。他们受到严格监管[60,61,62]并且可以部分补偿VDAC1的缺失，如补体分析所示[28,63]. 由于核苷酸的引入，这不仅允许代谢交换，甚至是有限的，还允许线粒体DNA的维持和表达[31].
有趣的是，我们的研究结果加强了先前关于VDAC蛋白和位于线粒体内膜（IMM）的特定酶之间存在功能联系的数据，确切地说，腺嘌呤核苷酸载体和二羧酸盐载体[64]. 这些观察结果来源于对分离的大鼠肝线粒体和有丝分裂体（即不含OMM的线粒体）呼吸状态3的分析，以及所有VDAC亚型的分析。事实上，在线粒体中，在琥珀酸存在下实现的耗氧量显著低于整个线粒体，对靶向这些IMM酶的特异性抑制剂的敏感性也是如此。相反，在有丝分裂体中添加富含VDAC的OMM制剂可以增加呼吸并部分恢复对抑制剂的敏感性[64]. 尽管我们的实验条件不同，但在琥珀酸盐和鱼藤酮（S-途径）的存在下，我们注意到耗氧量也有类似的减少。这表明复合物II也可能受到线粒体通道蛋白缺乏的影响。
总之，我们的工作明确指出了VDAC1在呼吸中的关键作用，并再次强调了主要孔蛋白亚型在保持线粒体正常功能方面的关键作用。
4.材料和方法
4.1. 细胞系的维持、增殖和治疗
HAP1是起源于白血病的近单倍体人类细胞。HAP1亲代和敲除型VDAC1细胞系购自Horizon Discovery（Waterbeach，UK）。细胞保存在Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM，GIBCO，Waltham，MA，USA）中，并在受控环境（37°C和5%CO）中补充10%的胎牛血清（GIBCO）和青霉素/链霉素抗生素（GIBCO）2). HAP1亲代细胞和敲除细胞的增殖在一段时间内（6天，每24小时）通过使用Burker室的显微镜进行监测。第0天，将每个基因型的80.000个细胞接种在12孔板中。进行了三次独立的细胞计数分析。
为了抑制VDAC1活性，HAP1亲代或VDAC1敲除细胞在受控环境（37°C和5%CO）中暴露于20μM先前溶解在DMSO中的VBIT-12或DMSO作为对照30分钟2)HRR实验之前。
4.2. Western印迹分析
亲本和VDAC1敲除HAP1细胞的总裂解物从106裂解缓冲液中的细胞（50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，EDTA 1 mM，1%TRITON X-100，蛋白酶抑制剂混合物）。使用SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，并将其转移至PDVF膜（GE Healthcare，Chicago，IL，USA）。在室温下用0.1%吐温-20在PBS中的5%BSA中封闭细胞膜1小时，并在4°C下与以下主要抗体孵育过夜：VDAC1（1:1000，Abcam，Cambridge，UK）、VDAC2（1:200，Abcam）、VDAC 3（1:100，Abcam）和β-Tubulin（1:2000，Cell Signaling，Danvers，MA，USA）。清洗后，用IRDye-conjugated二级抗体（1:25000，Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，USA）培养膜。信号由Odyssey CLx成像系统（Li-Cor Biosciences）检测，并使用Image Studio Lite软件（Li-Cor Bioscinces）进行分析。使用相同的软件进行量化。
4.3. 细胞活性测定
使用3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）分析法研究亲代和VDAC1敲除HAP1细胞的活性。将细胞置于96个平板（10.000个细胞/孔）中，24小时后添加MTT，以达到5 mg/mL的最终浓度。培养（37°C，3小时）和去除培养基后，将生成的formazan晶体溶解在100μL二甲基亚砜中。然后使用Varioskan微孔板阅读器（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher）测定590 nm处的吸光度。三个独立实验一式三份。
4.4. 线粒体肿块分析
HAP1系的线粒体质量通过流式细胞术使用荧光探针进行估算，荧光探针在线粒体中的积累与线粒体膜电位无关。粘附细胞在37°C下与Krebs Ringer缓冲盐（130 mM NaCl、3.6 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM NaHCO）培养30分钟三，0.5 mM NaH2人事军官4，0.5 mM氯化镁2，1.5 mM氯化钙2，4.5 g/L葡萄糖，pH 7.42），并补充300 nM的Mito tracker Green（Thermo Fisher）。然后使用CyFlow ML流式细胞仪（Partec）系统在490/516 nm处收集并分析细胞[31,53]. 使用FCS Express 4软件（DeNovo）采集和门控数据。通过分析每种情况下约20000个细胞，进行了三组独立实验，每组三次。
4.5. 高分辨率呼吸测定法（HRR）
HAP1系线粒体呼吸的特征通过HRR在双室系统O2k-FluoRespirometer（奥地利因斯布鲁克Oroboros Instruments）中进行。旨在分析主要呼吸状态和/或ET复合物对最大呼吸能力的贡献的特定SUIT协议改编自[51,53,65].
完整的呼吸曲线如下。在存在内源性底物的完整细胞中测量常规状态。然后，用3μM洋地黄苷对细胞的质膜进行轻度透化。在5 mM丙酮酸、2 mM苹果酸和10 mM谷氨酸存在下测定耗散呼吸，即LEAK状态，但不测定腺苷酸[41,66]. 通过添加饱和ADP浓度（2.5 mM）激活OXPHOS呼吸，然后添加10 mM琥珀酸。通过使用0.5μM CCCP的解偶联滴定观察到最大ET容量。通过使用2μM鱼藤酮和2.5μM抗霉素抑制ET链，最终实现剩余氧消耗，即ROX状态。
或者，在完整细胞中使用HRR来监测ET容量的变化[67]. 简言之，在常规呼吸稳定后，通过添加1μM CCCP可获得最大ET容量。将不同浓度的鱼藤酮（1至16 nM）或丙二酸（0.1至1.6µM）直接添加到试管中。
所有实验均在37°C的Mir05呼吸缓冲液（Oroboros Instruments）中进行，持续搅拌。所有化学品均购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
4.6. 呼吸状态分析
使用DatLab软件（v7.4.0.1，Oroboros Instruments）将仪器和化学背景通量作为氧浓度的函数进行校准。ROX校正了与常规、OXPHOS和最大ET容量相对应的耗氧率，并表示为pmol/s每百万个细胞。流量控制比（FCR）与最大ET容量、储备容量以及N和S通路对呼吸剖面的贡献有关，计算如下：[51,68].
4.7. 能量代谢产物的色谱分析
按照我们实验室建立的方法，对脱蛋白样品进行辅酶分析[69]. 本协议有资格保护活性化合物免受氧化或水解。简单地说，1 mL沉淀溶液（CH三中国+韩国2人事军官410 mM pH值7.4；3:1v（v）:v（v）)添加到3×106颗粒细胞，剧烈混合，高速离心（20890×克在4°C下保持10分钟）。向上清液中添加两体积的氯仿，以排出乙腈和所有疏水污染物，并在上述条件下再次离心。最后，回收了适合色谱分离的水样。P4000泵（Thermo Electron，Waltham，MA，USA）根据既定的二元梯度将HAP1亲本和ΔVDAC1细胞提取物送入Hypersil柱（250×4.6 mm，5µm粒径）。使用高灵敏度UV6000LP二极管阵列检测器（热电）进行分析鉴定和定量，该检测器配备有一个5厘米光路流动池，波长设置在200至300 nm之间。使用标准混合物作为参考对照。
4.8. 细胞内乳酸的测定
细胞内乳酸通过比色法进行测试，如[70]. 简单地说，将50µL细胞提取物与乳酸氧化酶/过氧化物酶试剂混合在Tris缓冲液和4-氨基安替比林中，以形成有色加合物。吸光度变化与乳酸浓度成正比，随后在545 nm波长处设置的自动微孔板光度计Elx800 Box 998（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）中进行。将此变化与标准曲线进行比较。
4.9. 统计分析
所有数据均表示为平均值或具有标准偏差的中位数。每种测定至少进行三次独立实验。数据由以下人员进行统计分析：t吨-使用Prism软件（GraphPad，San Diego，CA，USA）进行测试或双向ANOVA。以下值*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001为显著。
致谢
作者感谢Varda Shoshan Barmatz（以色列Beer Sheva内盖夫本古里安大学）赠送VBIT-12抑制剂Marianna F.Tomasello（CNR，卡塔尼亚）对流式细胞术实验的支持，Giuseppe Lazzarino（意大利卡塔尼亚大学）用于对AIM Linea 1致敬（AIM1833071）的数据和财务支持进行有益的讨论。
资金筹措表
本研究由PIACERI（授权号ARVEST）和概念证明（授权号PEPSLA POC 01_00054）资助，授予A.Messina，PIACERI（授权号VDAC）和CHANCE，授予V.D.P。
作者贡献
概念化，A.M.（安德烈亚·马格尔），V.D.P.（安吉拉·梅西纳）；方法论，A.M.（安德烈亚·马格尔）和A.M.A。；验证，A.M.（安德烈亚·马格尔），A.M.A.（安吉拉·梅西纳）；形式分析，A.M.（Andrea Magr）和A.M.A。；调查、A.M.（安德烈亚·马格尔）、S.A.M.C.、G.B.、C.L.R.L.、S.C.N.、M.W.S.和A.P.、数据管理、A.M.（安德烈娅·马吉尔）和A.M.A。；书面原稿编制，A.M.（安德烈亚·马格尔）；写作审查和编辑，A.M.A.、V.D.P.和A.M.（安吉拉·梅西纳）；可视化，A.M.（安德烈亚·马格尔），S.A.M.C.，G.B。；监督，A.M.（安德烈亚·马格尔），A.M.A.（安吉拉·梅西纳）；项目管理，A.M.（安德烈亚·马格尔）和A.M；资金收购，V.D.P.和A.M.（安吉拉·梅西纳）。所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
脚注
免责声明/出版商注释：所有出版物中包含的声明、意见和数据仅为个人作者和撰稿人的声明、意见和数据，而非MDPI和/或编辑的声明、意见和数据。MDPI和/或编辑对内容中提及的任何想法、方法、说明或产品造成的任何人员或财产伤害不承担任何责任。
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