介绍
神经精神疾病是全球残疾的主要原因，但其潜在的疾病机制仍不清楚1，2众所周知，自闭症谱系障碍（ASD）、精神分裂症（SZ）、智力残疾（ID）等非传染性疾病具有共同的行为症状和共病性三——5值得注意的是，所有这些条件都与癫痫有很强的流行病学关联，表明潜在的共同风险机制6——9ASD患者常合并癫痫，有（22%）ID或无（8%）ID，而癫痫儿童中有4-20%发生ASD7，10，11类似地，癫痫患者中精神分裂症的患病率和风险升高，估计有5-10%的人患有精神分裂症9，12，13与流行病学研究相结合，人类遗传学研究表明，癫痫的风险因素与常见精神疾病的风险因素重叠14因此，癫痫与NPD有着共同的遗传基础，并且广泛地与NPD共发病，但对这种共发病的生物学基础仍知之甚少。扩大我们对癫痫共同发病的分子和电路基础的理解，可以深入了解NPD的病理生理学和跨越诊断界限的新的治疗策略。
拷贝数变异（CNV）是一种高度渗透性的风险变异，增加了多种疾病的风险，为更好地理解NPD的会聚病因提供了强有力的模型15其中，近端16p11.2重复序列（BP4–BP5）因其广泛的多效性而显著，给包括癫痫在内的多种NPD带来风险。CNV包含人类16号染色体上约600kb的基因，该区域编码30个基因（27个蛋白质编码），其中许多基因在大脑中的功能定义不明确（补充图1a个)。荟萃分析已将该CNV确定为与SZ和ASD相关的最具统计稳定性的变异之一（奇数比率8–14），证实了初步研究16——19此外，16p11.2基因重复导致智力残疾、双相情感障碍、注意缺陷多动障碍（ADHD）、抑郁症和罗兰病癫痫的风险20——24临床确定的队列研究表明，最常见的疾病包括：ASD、ID、ADHD、精神病和癫痫25——27这些复杂的神经精神表型导致了16p11.2重复综合征的描述[MIM:614671]。合成16p11.2重复区域的小鼠模型已经生成重复/+小鼠），并且在运动活动、工作记忆、重复和社会行为方面有不同的损伤，但仍缺乏明确的疾病机制和基因型-表型关系28——31.
蛋白质组学技术和样品制备协议的进步改变了大规模蛋白质研究；神经元电路的构建模块32虽然RNA测序在神经科学中得到了广泛应用，但蛋白质组学为研究转录组学无法预测的改变分子通路提供了一个新的视角33重要的是，蛋白质组学可以提高亚细胞隔室的分辨率，如细胞膜、细胞间通信的关键部位，并揭示关键蛋白质：蛋白质相互作用网络。结合网络生物学，蛋白质组学可用于分离重要的疾病过程，识别可能介导发病机制的核心网络和关键中枢蛋白34因此，蛋白质组学有望发现与复杂遗传疾病相关的新分子和电路机制，并揭示能够逆转疾病生物学的中枢蛋白。
在这里，我们使用系统生物学方法，将蛋白质组学与人类遗传数据集相结合，以揭示16p11.2膜蛋白质组中被破坏的疾病网络和关键中枢蛋白复制/+小鼠模型。我们发现16p11.2中癫痫和突触基因产物的网络被破坏复制/+伴随着超同步电路的小鼠模型增强了网络谷氨酸的释放并增加了癫痫发作的敏感性。生物信息学预测和蛋白质：蛋白质相互作用分析进一步确定了PRRT2，一种编码在16p11.2区域的蛋白质，是16p112中被破坏的癫痫子网络内的高度连接中枢复制/+老鼠。值得注意的是，子网络中枢PRRT2的基因纠正纠正了异常电路功能，改善了癫痫发作易感性，并挽救了16p11.2的社会缺陷复制/+老鼠。我们的研究表明，蛋白质组学和网络生物学可用于剖析复杂CNV的疾病机制，揭示可能导致不同神经和精神症状的分子和电路机制。
结果
膜蛋白组学揭示16p11.2中突触和癫痫相关网络的破坏复制/+老鼠
16p11.2重复改变了小鼠和人类多个脑区的结构28，35在这里，我们重点研究了新皮质的蛋白质组功能障碍，这是一个在几个NPD中表现出分子和结构异常的大脑区域36，37我们对新皮质膜进行了定量蛋白质组学分析，因为这些亚室包含各种各样的转运体、细胞粘附分子、受体、离子通道和酶，它们整合了神经元生理学的许多方面，可以提供对细胞和电路功能的见解。此外，膜蛋白质组的组成可能揭示转录组学或全组织蛋白质组学无法捕捉到的新的疾病机制38我们首先验证了16p11.2蛋白表达的改变重复/+通过蛋白质印迹的小鼠模型（补充图1亿)然后分离16p11.2的新皮质复制/+小鼠获得膜组分。我们采用了基于哺乳动物稳定同位素标记（SILAM）的定量蛋白质组技术15N标记的小鼠大脑作为内部标准来比较16p11.2复制/+和野生型膜组分，然后通过液相色谱-串联质谱分析（图)。我们鉴定了约4400个代表不同膜室的蛋白质，包括小泡、树突、轴突和突触（补充图1c个)。我们的方法揭示了16p11.2中新皮质膜的广泛蛋白质组失调复制/+小鼠，包括659种显著上调的蛋白质和1024种显著下调的蛋白质（图)（补充数据1)。重要的是，16p11.2区编码的两种脑表达膜蛋白PRRT2（Z比率=115.6）和SEZ6L2（Z比率=23.3）在膜组分中被鉴定为上调。从全球来看，膜蛋白质组的变化丰富了基因产物，这些基因产物优先表达于兴奋性神经元而非抑制性神经元或其他细胞类型（补充图1天)。使用基因本体论（GO）分析，我们发现上调蛋白在调节电路活动的多个方面的生物途径中显著富集，包括突触信号、离子运输、胞吐和动作电位生成（补充数据2)（图)。相反，下调的蛋白质只对极少数途径有适度的富集。使用SynGO对突触本体进行更详细的分析表明，突触前过程（包括突触囊泡循环和胞吐）中上调的蛋白质特别丰富（补充图1e、f)（补充数据三).
定量膜蛋白组学揭示16p11.2突触和癫痫相关蛋白网络被破坏复制/+小鼠模型。一基于SILAM的16p11.2皮质膜定量蛋白质组分析程序+/+(n个 = 5只小鼠）和16p11.2复制/+(n个 = 5只小鼠）小鼠使用15富含氮的大脑作为内部标准。b条16p11.2皮层膜蛋白质组失调的图形显示复制/+老鼠。每个蛋白质都按Z比率绘制（为了清晰起见，从−150到+150），并按染色体排序，以可视化整个蛋白质组的失调程度。我们确定了659个上调蛋白（Z比率>1.96）和1024个下调蛋白（Z比例<−1.96）（补充数据中提供了完整的数据集1)。显示了合子16p11.2区域（小鼠7q4）内的膜蛋白PRRT2和SEZ6L2。c（c）基因本体（GO）分析揭示了突触信号和离子转运蛋白的上调。列出了来自顶级GO集群的代表性术语d日16p11.2的分子风险概况复制/+鼠标模型。蛋白质组分析中失调蛋白与通过大规模外显子组测序研究或OMIM数据库鉴定的从头变异基因集的比较。癫痫中受新生变异体影响的基因产物在上调的蛋白质数据集中高度高估。数据显示富集百分比和第页-双侧超几何试验（上调：对照，第页 = 0.2954; 电气工程师，第页 = 0.0011; 身份证件，第页 = 0.0059; 深圳，第页 = 0.0660; ASD中，第页 = 0.0094; Epi（OMIM），第页 = 0.0001; ID（OMIM），第页 = 0.0374. 下调：控制，第页 = 0.1687; 电气工程师，第页 = 0.1922; 身份证件，第页 = 0.0073; 深圳，第页 = 0.0235; ASD、，第页 = 0.0028; Epi（OMIM），第页 = 0.2965; ID（OMIM），第页 = 0.2922).e（电子）示意图显示了用于种子蛋白质相互作用网络的110个与癫痫相关的失调蛋白质。（f）在16p11.2中发现的癫痫相关蛋白相互作用网络（癫痫子网络）复制/+小鼠模型。节点按Z比率着色。克癫痫子网络的GO分析显示突触蛋白高度富集（单侧Fisher精确检验和Benjamini-Hochberg校正）。缩写：*第页 < 0.05时，**第页 < 0.01，***第页 < 0.001，EE epile公司第页抽搐性脑病、癫痫、ID智能障碍、SZ精神分裂症、ASD自闭症谱系障碍、RE罗兰癫痫、BD双相情感障碍、，P（P）校正，Benjamini-Hochberg已更正第页-值。
膜蛋白丰度的改变可能由多种机制引起，包括转录失调、蛋白质平衡和/或蛋白质运输。为了深入了解相关的分子机制，我们将我们的蛋白质组数据与两个已发表的数据集进行了比较，这两个数据集使用RNA-seq来描述16p11.2的整个新皮质或前额叶皮质的基因表达变化复制/+老鼠30，39（补充图2a–c)。在整个新皮质数据集中，我们发现了41个与膜蛋白组变化重叠的基因（补充图2a个)。富集分析表明，无论分析中是否包含16p11.2基因，这种重叠在统计学上都不显著（补充图第2天，第e天)。我们还考虑了整个皮层数据集中的基因/蛋白质，这些基因/蛋白质在同一方向上发生了改变（即RNA-seq向上vs膜蛋白组向上或RNA-seq-向下和膜蛋白组向下），并且再次发现没有统计学意义上的富集（补充图2d、e)。接下来，我们对重叠区的基因/蛋白质进行了相关分析(n个 = 41）并发现它们之间存在显著相关性(第页 = 0.0378），尽管线性关系较差（R2 = 0.022）（补充图第2页)。然而，这种相关性的重要性消失了(第页 = 0.1638），表明相关性依赖于16p11.2区域的顺式效应（补充图2克)。在前额叶皮层数据集中，我们发现53个与膜蛋白组变化重叠的基因，这代表着比预期的更丰富(第页 = 0.0036）（补充图2亿，小时)。当我们删除16p11.2位点基因时，这种富集持续存在(第页 = 0.0024）（补充图第2页)。然而，当考虑到基因/蛋白质在同一方向上发生改变时，我们发现没有静态显著的富集，这由两个数据集之间缺乏相关性所证实（补充图2j、k)。总的来说，这些数据表明16p11.2位点以外的基因/蛋白质的基因表达和膜蛋白质组变化之间缺乏相关性，并表明膜变化可能不是由于全球转录效应。
鉴于人类16p11.2复制/+载体表现出广泛的表型谱，我们着手确定是否存在与蛋白质组数据中表示的NPD相关的分子网络。为此，我们使用基因集分析来确定失调蛋白是否包含由NPD的从头外显子组测序研究确定的疾病相关基因产物。我们使用外显子组测序数据，因为这些数据涉及疾病中的单个基因，因此可以用于识别具有明确生物学功能的疾病特异性蛋白网络40为了揭示这些分子网络，我们将蛋白质组研究中发现的失调蛋白质组与疾病特异性基因组进行了比较；生成16p11.2皮层膜的蛋白质组疾病谱复制/+鼠标。重要的是，我们使用数据集中所有已识别的膜蛋白作为这些分析的背景，消除了大脑表达或膜定位可能产生的任何偏见。我们发现与许多16p11.2相关的风险因素负担增加重复/+-我们数据集中的相关NPD（补充图3a年和图)。这些数据令人想起CNV携带者中观察到的不同临床谱，并表明与每种疾病相关的子网络可能在16p11.2中失调复制/+老鼠。最丰富的疾病基因集与癫痫风险因素相关，其次是ID、SZ和ASD基因集（补充图3a年)。大多数癫痫基因集包含在上调蛋白中（+69%，第页 = 1.07 × 10−3)而SZ基因集在下调蛋白中富集（+14%，第页 = 2.35 × 10−2)。ID和ASD基因集在上调和下调数据集中都得到了丰富。重要的是，在未受影响个体中识别的新生单核苷酸变体（dnSNV）的控制数据集未在任何蛋白质组数据集中富集，表明NPD风险因素的选择性富集（补充图3a年，图)。为了证实蛋白质组数据集中癫痫危险因素的富集，我们使用了一个独立的基因集，该基因集来源于与癫痫或ID相关的孟德尔病基因（OMIM）目录。该分析显示癫痫的富集程度更高（+103%，第页 = 1.11 × 10−2)这表明16p11.2皮层膜中改变的蛋白质之间有着密切的联系复制/+小鼠和癫痫相关的生物途径。
神经精神疾病中癫痫子网络发生改变
接下来，我们的目的是确定我们数据集中的癫痫相关蛋白是功能独立的，还是构成了具有丰富生物功能的更大蛋白质相互作用（PPI）网络的一部分。我们在16p11.2中植入了110个被破坏的蛋白质组成的网络复制/+小鼠模型和癫痫遗传相关（图)。通过与PPI数据库匹配41，我们发现大多数癫痫相关蛋白在物理上相互连接（100个节点，137个边），可能形成一个大的功能模块（图和补充图3亿)。GO分析进一步表明癫痫相关网络高度丰富了突触本体（图和补充图3立方厘米)（补充数据4).
为了确定该网络的更广泛相关性，我们旨在确定癫痫网络和16p11.2膜蛋白质组中的蛋白质是否被破坏复制/+NPD小鼠模型中的小鼠以及ASD和SZ中的人类死后脑组织也发生了改变（补充图三维)。为此，我们重叠了16p11.2中失调的蛋白质列表复制/+用来自小鼠或人类数据集的失调蛋白建立小鼠模型，并评估每个列表之间的重叠程度。然后使用基因富集集分析来确定重叠是否超出了偶然的预期。我们发现我们评估的大多数小鼠模型数据集（即，财务报告1-/年，柄3-/-，22问题11.2+/-，涵洞3-/-)富含16p11.2中观察到的膜蛋白改变复制/+老鼠。ASD和SZ的人类数据集也得到了显著丰富，表明人类和小鼠蛋白质组的变化趋于一致。接下来，我们评估了癫痫子网络中的蛋白质在相同的人类和小鼠数据集中是否被破坏。我们发现这个网络中的蛋白质也在多个小鼠模型中富集(财务报告1-/年，22问题11.2+/-，库3-/-)并且这些模型中癫痫网络的富集水平始终高于16p11.2中被破坏的全球蛋白质组复制/+老鼠。在人类尸检数据中，与完整的16p11.2相比，癫痫网络中ASD相关的变化更加丰富复制/+膜蛋白质组（1.86倍对3.08倍），以及来自SZ的突触体数据集（1.99倍对3.34倍）。这些数据共同表明，在具有不同病因的不同遗传小鼠模型中共享蛋白质组病理生理学的潜力，并揭示了癫痫网络的元素在小鼠模型和人类NPD中被破坏（补充图2e、f).
总之，我们发现了一个在NPD中被改变的癫痫模块，它可能调节16p11.2皮层网络的活动复制/+老鼠。
从16p11.2增强初级皮层神经元网络的功能连通性复制/+老鼠
我们假设观察到的蛋白质组改变可能导致与癫痫和相关NPD相关的网络改变。此外，突触基因集的上调表明网络连接可能发生改变。因此，我们使用钙成像同时监测初级皮层培养物中数百个神经元的活动，并建立16p11.2神经元网络的功能特性复制/+鼠标（图)。我们发现16p11.2中的自发神经元网络事件复制/+小鼠含有较高比例的协同活性细胞（图和图，第页 = 0.0239），但发生频率与野生型网络事件相同（图)。然后我们用荷包牡丹碱处理神经元，以评估16p11.2的网络特性是否发生改变复制/+小鼠依赖GABA能信号（图)。我们发现，GABA被阻断后，网络事件中仍有较大比例的协同活动细胞A类受体，表明较高的共激活率不是由GABA能神经传递引起的。这些数据表明，16p11.2重复/+由于谷氨酸能回路功能障碍，导致皮层神经元网络的功能连接增加。
16p11.2初级皮层神经元的功能连接增强复制/+老鼠。一负载有荧光钙染料（Cal520，绿色）和星形胶质细胞特异性染料硫罗丹明101（SR101，红色）的培养神经元网络的荧光显微镜图像。显示了用于测量钙瞬变的躯体ROI。比例尺，50μm。b条单个神经元的钙痕迹示例c（c）16p11.2中网络事件的代表性光栅图+/+（左）和16p11.2重复/+（右）文化。每个光栅图显示300 s（x轴）内150个神经元（y轴）的活动。d日量化网络事件期间的神经元共同活动（功能连接）。e（电子），（f）基础条件下神经元网络活动的特性（16p11.2+/+，n个 = 来自14个大脑的22视野；16页第11.2页复制/+=11个大脑的20视野）。e（电子）网络事件期间共同活动的神经元数量增加(第页 = 0.0239).（f）16p11.2中网络事件频率无变化复制/+神经元与16p11.2的比较+/+神经元(第页 = 0.641).克——小时50μM荷包牡丹碱（一种GABA）刺激时神经元网络活动的特性A类受体抑制剂（16p11.2+/+，n个 = 来自5个大脑的15个视野；16页第11.2页复制/+=6个大脑的15视野。克在网络事件期间增加联合激活(第页 = 0.0136)小时16p11.2中网络事件频率无变化复制/+神经元与16p11.2的比较+/+神经元。我数据显示为平均值±s.e.m。*第页 < 0.05,**第页 < 0.01，双尾吨-测试。缩写：dup/+，16p11.2复制/+;+/+，第11.2页+/+; 视野，视野。
16p11.2的皮质切片复制/+小鼠表现出超同步活动
我们对培养的神经元网络的研究表明，大脑皮层回路的动力学可能在16p11.2中被破坏重复/+老鼠。因此，我们试图利用双光子钙成像（图，补充图4，补充电影1)。我们记录了荷包牡丹碱存在时的局部钙瞬变，以刺激皮层网络活动。正如预期的那样，钙事件完全依赖于动作电位，因为这些动作电位在应用电压门控钠（Na）时受到抑制v（v）)通道阻滞剂河豚毒素（补充图4b个)。在评估个体野生型和16p11.2时，我们发现钙动力学存在明显差异复制/+神经元（图，补充图4c–e类)。16p11.2中的钙峰值复制/+神经元的振幅增加了1.7倍以上(第页 = 0.01），半宽减少约3倍(第页 = 0.0052），但与野生型神经元相比，事件频率没有变化。接下来我们评估了16p11.2的电路级特性复制/+鼠标（图)。在这里，我们发现16p11.2中的网络事件复制/+小鼠的数量更大，因为它们同时含有更多的活性细胞（图) (第页 = 0.0447），模拟神经元培养实验中的效果。为了确定钙事件的传播速度，我们测量了单个神经元峰值之间的成对时间延迟，并观察到神经元峰值16p11.2之间的持续时间缩短重复/+小鼠，表明网络激活更快（图) (第页 = 0.0091). 我们还发现，与野生型小鼠相比，网络事件的发生频率更低（图)。进一步分析表明，来自16p11.2的皮层神经元复制/+小鼠表现出高度相关的神经元活动，与网络中增强的功能连通性和同步性相一致(第页 = 0.0007）（图)。最后，我们评估了这些回路表型是否与体感皮层不同或存在于其他皮层结构中。我们在初级视觉皮层2/3层进行了类似的分析（补充图4f–k)。在这里，我们还发现了更多相关的神经元活动，这表明多个皮层回路可能过度同步。因此，我们的数据揭示了16p11.2皮层电路的核心功能障碍复制/+小鼠的神经网络表现出超同步性。
携带16p11.2重复的皮质切片中的超同步活动。一（左）示意图显示了双光子钙成像成像的初级体感皮层（S1）的位置。（右）16p11.2中网络事件的代表图像+/+和16p11.2复制/+躯体感觉皮层。图片显示了钙敏感染料（Cal520，绿色）、星形胶质细胞特异性染料（SR-101，红色）和荧光强度的z-score标记。比例尺，50μm。b条单个神经元的钙瞬变。c（c）16p11.2中网络事件的光栅图+/+和16p11.2复制/+躯体感觉皮层。每个光栅图显示50 s（x轴）内80个神经元（y轴）的活动(d日——小时)S1皮质切片中网络事件的量化（16p11.2+/+，个 = 4只小鼠7片；16页第11.2页复制/+，n个 = 4只小鼠的8片）。d日网络事件期间神经元共同激活增加(第页 = 0.0447）e（电子）减少网络事件期间神经元对之间的时间延迟(第页 = 0.0091).（f）减少16p11.2中同步网络事件的数量复制/+老鼠(第页 = 0.0046)克显示成对神经元之间功能相关性程度的代表性矩阵（每个矩阵代表80×80个神经元）。相关度（R）用热图进行彩色编码。小时16p11.2 S1皮层回路成对相关增加复制/+小鼠，符合超同步活动(第页 = 0.0007).我——我Kainate（KA）诱导的癫痫实验（16p11.2+/+，个 = 16老鼠；16页第11.2页复制/+，个 = 17老鼠）。我KA诱发癫痫实验示意图。使用BioRender.com创建。j个卡普兰-迈耶曲线显示了患有全身强直阵挛发作（GTCS）的小鼠比例。16页第11.2页复制/+红藻氨酸注射后，小鼠出现快速发作，GTCS比例增加（Log-rank试验，第页 = 0.0031，误差带代表s.e.m.）k个16p11.2癫痫发作严重程度增加复制/+小鼠1小时后（Mann-Whitney试验，第页 = 0.0039).我Kaplan-Meier曲线降低16p11.2的存活率复制/+红藻氨酸诱导小鼠（Log-rank试验，第页 = 0.0013，误差带代表s.e.m.）。条形图显示为平均值±标准误差*第页 < 0.05,**第页 < 0.01,***第页 < 0.001，双尾吨-测试，除非另有规定。缩写：dup/+，16p11.2复制/+;+/+，第16页第1.2页+/+.
PRRT2是突触和癫痫网络中枢。一每个基因的人脑共同表达网络与癫痫子网络中的蛋白质重叠（图)确定潜在的网络中心。b条气泡图显示基因集分析的富集结果(一)在y轴上。根据gnomAD数据库，气泡大小由该基因的约束度量（pLI）缩放109并被疾病协会染色。pLI评分越高，表明对突变的耐受性越高。遗传关联被定义为在EE、ID、ASD或SZ先证者的编码区中具有至少一个从头开始的单核苷酸变体（dnSNV）的基因，或OMIM数据库中与脑相关疾病相关的基因。c（c）免疫亲和纯化与质谱联用（IAP-MS）用于鉴定PRRT2相互作用体的示意图。使用BioRender.com创建。d日PRRT2 IAP-MS实验中鉴定的蛋白质的火山图(n个 = 3个独立实验）。与IgG和第页-值<0.1（一个-有尾的吨-测试），被视为交互组的一部分。原木的折叠变化10（2） 表明在对照IgG IAP中未发现该蛋白。彩色蛋白质名称表示癫痫相关基因e（电子）PRRT2相互作用组的SynGO分析（带FDR校正的单侧Fisher精确检验）（f）癫痫和智力残疾相关蛋白（来自OMIM数据库）在PRRT2相互作用组数据集（Epi，第页 = 3.14 × 10−5; 身份证件，第页 = 5.01 × 10−3)。数据显示富集百分比和第页-双边超几何测试的值。克72%的PRRT2相互作用蛋白在16p11.2的新皮质中失调复制/+小鼠模型小时超几何检验的富集值(克).我PRRT2相互作用组中识别的新相互作用映射到图中识别的蛋白质组子网络灰色边缘表示检索到的蛋白质相互作用，而IAP-MS实验中识别的PRRT2相互作用被着色为紫色边缘/节点。节点按中间中心度进行缩放(C类B类)得分以突出对蛋白质相互作用网络有强烈影响的节点。癫痫、ID智能障碍、SZ精神分裂症、ASD自闭症谱系障碍、DD发育障碍、，P（P）校正，Benjamini-Hochberg已更正第页-值。
16页第11.2页复制/+小鼠易受诱发癫痫的影响
我们推断，电路功能异常可能与癫痫发作倾向增加有关，因为超同步电路与癫痫发作密切相关42然而，我们在16p11.2中没有观察到自发惊厥发作复制/+在我们的研究中。相反，我们假设16p11.2复制/+小鼠对诱发性癫痫的敏感性可能发生改变。因此，我们注入16p11.2复制/+红藻氨酸小鼠是研究癫痫易感性的成熟模型（图)。我们发现男性和女性16p11.2重复/+小鼠对癫痫诱导高度敏感（图，第页 = 0.0031）（补充图5)。总的来说，约占16p11.2的82%复制/+小鼠表现出全身强直阵挛性癫痫发作（GTCS），而野生型同卵鼠约占44%(第页 = 0.0324). 16p11.2复制/+小鼠出现GTCS的速度更快（图)并且与注射后1小时的癫痫发作评分显著升高相关（图，第页 = 0.0039). 癫痫发作严重程度的增加仅导致16p11.2的12.5%复制/+与约56%的野生型小鼠相比，实验中存活下来的小鼠（图，第页 = 0.0013). 这些实验表明，16p11.2的异常皮层回路功能复制/+小鼠可能会增加癫痫的易感性。
癫痫子网络中枢基因的生物信息学预测
我们的数据表明，超同步是16p11.2神经元产生的中枢网络表型复制/+在皮层培养和脑切片中。这些网络特性可能会促进导致NPD的异常大脑活动。我们假设，鉴于癫痫与过度大脑活动之间的联系，癫痫相关网络将在调节异常电路方面发挥重要作用。因此，找到该网络的调节器可能是修改疾病表型的重要途径。
为了确定复制区内癫痫子网络的潜在驱动因素，我们使用了一系列生物信息学方法，利用大型人类遗传和转录组数据集43（图)。我们推断网络驱动因素在功能上与网络中的蛋白质相关。因此，我们利用人类大脑皮层的发育转录组数据，确定了16p11.2区域（27蛋白编码）内所有基因的功能相关共表达网络。然后，我们将16p11.2区所有基因的共表达基因集与癫痫子网络中失调蛋白的蛋白质组数据进行了比较（图)。我们的分析表明，共同表达网络与SEZ6L2型(2.6倍，第页 = 2.2 × 10−9)和PRRT2项目（2.52倍，第页 = 3.77 × 10−8)癫痫子网络中的蛋白质含量最高，使这些优先候选（图)。由于进化约束下的基因更有可能与疾病表型相关，我们评估了每个基因的约束度量（pLI）44，45。我们发现了PRRT2项目是pLI得分最高的前七名之一（即更受约束），而SEZ6L2型得分相对较低（分别为0.579和0.117）（图)。我们还考虑了16p11.2中膜蛋白质组实验的Z比率复制/+老鼠。这里，PRRT2具有领先的Z比率，表明皮质膜中存在明显的调节障碍（Z比率=115）（图)。最后，我们利用从头变异和OMIM的外显子组测序研究的数据确定16p11.2区域的基因是否与NPD相关。我们推断，与癫痫或相关NPD相关的基因更有可能调节癫痫相关的过程，如超同步性，并在该模型中对病理生理学产生强烈影响。遗传分析显示PRRT2项目是一种常染色体显性癫痫的致病基因，称为良性家族性婴儿癫痫（MIM:605751）。总之，这些数据表明PRRT2可能与癫痫子网络相互作用，并影响16p11.2的下游疾病过程复制/+老鼠。
交互作用分析显示PRRT2是癫痫子网络中的主要中枢
为了验证我们的生物信息学预测，我们旨在确定PRRT2是否可以与失调癫痫子网络中的蛋白质进行物理相互作用。尽管已知PRRT2与不同的SNARE蛋白质如SNAP25和离子通道相互作用46——51缺乏对其相互作用的全面认识。因此，我们利用大规模免疫亲和纯化和质谱联用（IAP-MS）对小鼠新皮质中PRRT2的蛋白质：蛋白质相互作用进行了一项基于发现的全球研究（图)。我们的实验鉴定了208种PRRT2相关蛋白，其中大多数以前从未被鉴定过（图)（补充数据5)。重要的是，我们捕获了所有已知的相互作用体或其亚单位，包括SNARE复合物（SYT1、VAMP2、STX1A）、+/K（K）+ATP酶ATP1A3和Ca亚基v（v）通道（CACNB1-2、CACNB4）、AMPA受体（GluA2、TARP-ϒ8）和钠v（v）通道（SCN1B、SCN2B），验证我们的方法。与SNARE和Na相互作用的子集v（v）通过免疫沉淀（IP）和Western blotting在异源细胞中的过度表达或通过皮质膜部分中的IP来确认通道成分（补充图6)。为了独立评估相互作用组的质量，我们还将MS鉴定的PRRT2相关蛋白的完整列表与与PRRT2项目在发育中的人类新皮质中，两个独立的数据集应该聚合到与PRRT2功能相关的蛋白质上。值得注意的是，这些数据集共享32.3%的重叠（1.82倍富集，第页 = 3.79×10−7)，增强了我们对交互式数据集的信心（补充图第7页).
我们发现，相互作用组数据集高度丰富了涉及突触信号和突触前过程的生物过程，反映了16p11.2中断的通路复制/+小鼠新皮质（补充图7亿，图)（补充数据6和7)。基因集分析显示OMIM癫痫基因编码的蛋白质主要富集（+252%，第页 = 3.14 × 10−5)和ID基因（+157%，第页 = 5.00 × 10−3)表明它与其他癫痫相关基因产物在生物网络中运作（图)（补充图第7页c).
新皮质中PRRT2相互作用组的鉴定使我们能够确定16p11.2中的蛋白质是否失调复制/+蛋白质组可以在全球范围内与PRRT2相互作用，因此可能受到PRRT2的影响。因此，我们比较了PRRT2相互作用组与16p11.2改变的皮层蛋白质组复制/+老鼠。我们在同一大脑区域，在同一发育时间点进行了两组实验，以确保它们能够直接进行比较。值得注意的是，我们发现在16p11.2的膜蛋白组中PRRT2相互作用蛋白被系统性破坏复制/+小鼠（72%的相互作用蛋白）（图)相反，8.3%被破坏的膜蛋白质组是PRRT2复合物的一部分。这一重叠代表了1.9倍的浓缩(第页 = 8.56 × 10−26)超出了背景膜蛋白质组的预期，并强烈表明PRRT2调节16p11.2皮层蛋白质组内的蛋白质网络复制/+鼠标（图)。此外，我们检测了PRRT2相互作用组是否可以直接与16p11.2中确定的癫痫子网络中的蛋白质相互作用复制/+老鼠。我们汇编了IAP实验中确定的二进制相互作用列表，并将PRRT2相互作用组与图中的癫痫子网络合并，生成新网络（图)。通过执行网络分析，我们发现PRRT2具有最高程度的连接性(D类 = 16） 和中间中心性（CB类 = 0.37），使其成为16p11.2癫痫子网中拓扑最重要的节点和中心枢纽复制/+鼠标（图)。因此，我们的数据强烈暗示中枢蛋白PRRT2是16p11.2中被破坏的癫痫亚网络的调节因子重复/+这表明它可能会影响核心疾病的表型。
PRRT2剂量增加与神经系统疾病
遗传研究表明PRRT2项目婴儿癫痫和阵发性运动障碍（MIM:605751和128200），但尚不清楚PRRT2项目功能增益可能是。确定是否增加PRRT2项目仅拷贝数可能具有临床相关性，我们还考虑了PRRT2项目在缺乏完整16p11.2的情况下存在重复复制/+在人类中，这些是否足以形成神经表型。因此，我们搜索了ClinVar数据库，发现四名患者的重复数据涵盖了整个PRRT2项目编码区域（补充图第7天，第5天)。有趣的是，其中两名患者有阵发性运动障碍，两名患者出现癫痫发作，这表明PRRT2项目基因剂量本身可能会引起人类的神经症状。
Prrt2校正恢复16p11.2皮层网络同步性和谷氨酸释放复制/+老鼠
为了实验测试PRRT2在疾病表型中的作用，我们利用小鼠遗传学来选择性地纠正项目216p11.2中的表达复制/+小鼠模型。我们越过了16p11.2复制/+带有杂合子小鼠的小鼠项目2删除(项目2+/-或Het)，产生重复的后代，但进行了纠正项目2副本号（16p11.2校正老鼠）（补充图第8页a)。这种策略构成性地调节16p11.2中PRRT2的表达复制/+小鼠达到野生型水平，其他复制蛋白增加（补充图8b、c)。随后，我们使用来自该杂交的小鼠来研究16p11.2中皮层网络的功能腐蚀，腐蚀老鼠。
来自PRRT2相互作用组的数据表明，PRRT2、突触前功能和癫痫相关的生物通路之间存在密切关系。因此，我们使用一种神经元中专门表达的基因编码谷氨酸传感器（Syn-iGluSnFR）来评估16p11.2皮层网络的功能复制/+小鼠修正为项目2表达52（补充电影2)。使用谷氨酸传感器代替钙2+成像可以让我们直接在网络层面上观察突触释放，而不是监测钙2+躯体的动力学。通过iGluSnFR成像获得的皮层网络活动揭示了丰富的自发事件，包括高（>0.2ΔF/F0)和低（<0.2ΔF/F0)同步事件（图)。重要的是，iGluSnFR荧光依赖于动作电位，对谷氨酸浓度的增加敏感（补充图第8天，第5天)。有趣的是，高同步性事件强烈地让人联想到Ca捕获的大型网络事件2+成像，在幅度和事件率方面（图，图)。虽然所有事件或低同步事件在基因型之间没有变化，但高同步事件在16p11.2中的振幅更大复制/+小鼠与野生型相比（图)（补充电影2)。纠正后，高同步性事件也被逆转项目2拷贝数，证明其对PRRT2剂量的敏感性（图)。接下来，我们使用KCl诱导的去极化来确定诱发的谷氨酸释放是否发生改变（图)。我们发现皮层网络中KCl诱发的谷氨酸释放的峰值振幅从16p11.2增加复制/+小鼠，这种表型在校正后的小鼠中也被逆转（图)。基因型之间的衰变峰面积和半衰期没有差异（图)。这些数据确立了PRRT2作为16p11.2皮层网络同步性和谷氨酸功能的调节器复制/+老鼠。
16p11.2初级皮层神经元异常网络同步性和谷氨酸过度释放重复/+小鼠矫正后恢复正常项目2副本编号。一感染皮层神经元的谷氨酸传感器Syn-iGluSnFr的表观荧光图像（比例尺100μm）。高（>0.2ΔF/F）示例0)和低同步性（<0.2ΔF/F0)事件如图所示b条显示iGluSnFr荧光网络水平变化的单个痕迹。高同步事件和低同步事件分别用红色和蓝色箭头表示。c（c）——克皮层培养物的自发谷氨酸成像（WT=20 FOV，来自6个大脑；Dup=42视野，来自11个大脑；Corr=来自10个大脑的27个FOV；Kruskal–Wallis检验和Dunn的事后检验）。c（c）——e（电子）来自16p11.2的皮层网络复制/+小鼠的网络事件频率、振幅或半宽度没有变化。（f）高同步事件的振幅在16p11.2中增加复制/+老鼠(第页 = 0.0378），并在校正小鼠中恢复到WT水平(第页 = 0.0382).克基因型间低同步事件的幅度保持不变。小时使用KCl（30 nM）诱发谷氨酸释放后的荧光变化。我——我皮层培养物中诱发的谷氨酸释放（WT=17 FOV，来自8个大脑；Dup=26视野，来自12个大脑；Corr=19个视野，来自10个大脑；霍尔姆-西亚克事后测试的单向方差分析）(我，j个)16p11.2诱发事件的高振幅复制/+老鼠(第页 = 0.0185）在纠正后的小鼠中获救(第页 = 0.0063).k个-我这个第页峰面积和半衰期（T1/2)诱发的谷氨酸释放在基因型之间没有改变。数据显示为平均值±标准误差*第页 < 0.05;**第页 < 0.05. 缩写：WT，16p11.2+/+; 重复，16p11.2复制/+; 更正，16p11.2腐蚀，腐蚀.
校正Prrt2基因剂量可挽救16p11.2的神经精神表型复制/+老鼠
我们接下来评估了项目2在这里和以前的工作中建立的行为表型校正29，30行为分析显示16p11.2复制/+小鼠在旷野中的运动活动减少，重现了先前的发现（图)。然而，项目2-校正后的小鼠行进的距离与16p11.2相似复制/+小鼠，表明项目2剂量对运动活动没有影响（图)。我们没有发现焦虑表型的证据，这是根据在旷野区域中心的时间来评估的，与之前的工作一致（图)30.
遗传校正项目2拯救16p11.2的神经精神表型复制/+老鼠。一30分钟记录期间小鼠运动活动的痕迹和热图。一——c（c）与WT相比，Dup和Corr小鼠的运动活性降低(第页 = 分别为0.0323和0.0073），并且似乎没有焦虑样表型（WT，n个 = 20只小鼠；杜普，n个 = 14只小鼠；科尔，n个 = 17只小鼠；赫特，n个 = 13只小鼠）d日，（f）修正PRRT2基因剂量逆转16p11.2的癫痫表型复制/+小鼠（WT，n个 = 14只小鼠；重复，n个 = 13只小鼠；科尔，n个 = 16只小鼠；赫特，n个 = 16只老鼠）。d日癫痫发作表型的逆转表现为全身强直阵挛性发作（GTCS）的发作延迟，GTCS小鼠的百分比降低（WT vs.Dup，第页 = 0.0006; WT与Het，第页 = 0.0012; Dup与Corr，第页 = 0.0223，对数-秩检验，误差带代表s.e.m.）。e（电子）16p11.2癫痫发作的严重程度校正注射后1小时，小鼠与WT小鼠相当（WT vs.Dup，第页 = 0.0074; WT与Het，第页 = 0.017; Dup与Corr，第页 = 0.039).（f）16页第11.2页校正由于癫痫发作严重程度降低（WT vs.Dup，第页 = 0.025; WT与Het，第页 = 0.017）对数-库测试，未显示清晰度误差带）。克——j个社会行为（WT，n个 = 17只小鼠；杜普，n个 = 7只小鼠；科尔，n个 = 16只小鼠；赫特，n个 = 12只老鼠）。克用于三室社交互动测试的仪器示意图。使用BioRender.com创建。小时社交行为期间的活动热图。我每只实验鼠用于研究新老鼠或空杯子（WT，第页 < 0.0001; 重复，第页 < 0.0212；科尔，第页 < 0.0001; 赫特，第页 < 0.0001).j个与WT和PRRT2-correction相比，Dup小鼠有社会缺陷，恢复了社会行为（WT vs.Dup，第页 = 0.0086; Dup与Corr，第页 = 0.0054; Dup vs.Het，第页 = 0.0114). 条形图显示为平均值±标准误差*第页 < 0.05时，**第页 < 0.01,***第页 < 0.001（使用Tukey的事后检验进行双向方差分析）。缩写：WT，16p11.2+/+; 重复，16p11.2复制/+; 更正，16p11.2校正; 赫特，项目2+/-.
评估项目2根据发作表型的拷贝数，我们将小鼠置于之前使用的化学惊厥发作范式。在这里，我们发现了项目2+/-小鼠对癫痫发作有较高的敏感性，这支持了之前使用类似分析的数据（图)53.16p11.2重复/+小鼠同样容易癫痫发作，这与我们之前的研究结果相同（图)。值得注意的是，PRRT2表达的纠正逆转了16p11.2的癫痫发作表型复制/+老鼠(第页 = 0.0231，图)导致GTCS起效曲线在统计学上与野生型小鼠没有区别（图)。这种影响是由于GTCS发病延迟，表现GTCS的小鼠比例降低。16p11.2腐蚀，腐蚀与16p11.2相比，小鼠的GTCS发作延迟了约40%复制/+老鼠(第页 = 0.0227，补充图第8页)。此外，16p11.2中癫痫发作的严重程度校正注射后1小时，小鼠被挽救至野生型水平，与16p11.2完整的小鼠相比，存活率更高复制/+（约81%，而约62%）（图)。因此项目2导致16p11.2癫痫发作延迟，发作严重程度降低重复/+老鼠。这些结果表明，夸大和不足项目2表达集中了癫痫的易感性。
最后，我们研究了项目2关于16p11.2报告的社会赤字复制/+小鼠是与ASD和SZ相关的核心行为内表型。小鼠接受三室社交测试，以评估每个基因型的社交能力54（图)。在习惯化阶段，小鼠没有表现出对腔室两侧的偏好（补充图8克)。在社交阶段，所有小鼠都对社交线索有偏好（图)。然而，16p11.2复制/+与野生型小鼠相比，小鼠社交能力持续下降（DI（%）分别为34.67和60.11）（图).项目2+/-相反，老鼠没有社会缺陷。引人注目的是，16p11.2中的行为分析Corr公司小鼠的社交行为完全恢复（DI（%）=61.59）（图).
总之，这些结果表明，纠正PRRT2剂量可以挽救与16p11.2神经精神障碍相关的不同回路和行为表型复制/+老鼠。
讨论
NPD有重叠的症状，通常与癫痫同时发生，这表明存在趋同生物学，但其潜在的分子和电路机制尚不清楚。了解共同风险机制的一个有力切入点是研究与NPD和癫痫相关的高度渗透性遗传变异。在这项工作中，我们使用16p11.2重复的小鼠模型来揭示可能参与调节NPD谱风险的关键蛋白网络和电路表型。重要的是，我们确定第2阶段作为一种能够逆转重要疾病相关表型如癫痫易感性和社会功能障碍的单一基因。
膜蛋白组学揭示NPD中癫痫网络被破坏
理解疾病过程的一个主要挑战是解决基因型和表型之间的机制。虽然已经很好地确定，CNV，例如16p11.2重复，通过改变受影响基因的转录水平发挥作用，但这些基因座效应如何导致更多的全球变化，特别是在蛋白质组网络中，尚不清楚。转录组学方法是理解疾病机制的关键步骤。然而，蛋白质是神经回路的基本组成部分，mRNA对动态系统中蛋白质丰度的预测能力较差55此外，细胞隔室具有离散水平的mRNA和蛋白质，以服务于突触传递等特殊功能56为了评估RNA和蛋白质之间的重叠水平，我们将我们的膜蛋白质组数据与之前在同一小鼠模型中发布的RNA-seq数据集进行了比较。我们发现，mRNA和蛋白质的变化之间几乎没有相关性，这说明除了转录组学之外，进行蛋白质组学分析对充分了解疾病过程的重要性。RNA和蛋白质之间缺乏相关性表明，尽管转录效应可以解释疾病的某些方面，但它们不能解释膜蛋白在这个模型中是如何改变的。因此，很可能涉及调节蛋白质丰度和定位的转录后效应。鉴于PRRT2已被证明可以调节膜蛋白的表面运输48，49并且它与大量失调的蛋白质相互作用，我们认为PRRT2依赖的膜转运可能是重塑16p11.2膜蛋白质组的重要因素复制/+老鼠。
我们基于发现的蛋白质组学筛查发现，被破坏的蛋白质与广泛的疾病相关，包括ASD和SZ。然而，我们发现与癫痫相关的蛋白质网络在失调蛋白质中特别丰富。这些数据表明可能存在一种分子层次结构，即癫痫网络优先受16p11.2细胞膜的影响复制/+老鼠。重要的是，我们发现，在具有不同遗传病因的NPD小鼠模型以及ASD和SZ患者的人类脑组织中，失调癫痫网络中的蛋白质也被破坏。这些数据可能揭示了与NPD相关的分子特征。因此，我们表明癫痫网络中的蛋白质组改变可能是16p11.2的病理生理学关键复制/+老鼠。
16p11.2重复综合征小鼠的电路表型
神经元网络中的同步活动发生在细胞群一致激发时，从而产生相关活动。局部和远程回路中神经元的同步是大脑信息处理的基本机制57，58这里，我们发现在大型网络事件中，共激活神经元的数量异常高，表明功能连通性和同步性增强。我们证实了16p11.2的电路功能障碍复制/+使用钙的小鼠2+谷氨酸成像是两种互补技术，融合了对大型同步网络事件的改变。重要的是，我们表明即使在GABA能输入被阻断后，电路也会发生超同步，这表明这些特性与抑制性突触无关。然而，先前报道的抑制性突触的缺陷可能会加剧异常的谷氨酸能回路，导致体内进一步的回路功能障碍30在培养的神经元网络、体感皮层和视觉皮层中观察到神经元共同激活表型增加，这表明同步性增强可能是16p11.2皮层回路的基本特性复制/+老鼠。
回路表型对癫痫的影响
癫痫是指反复出现的无端癫痫发作，可通过脑电图（EEG）进行捕捉。脑电图上记录的癫痫样活动被认为是由数千个神经元不受控制的同步放电引起的。尽管同步性升高与癫痫发作有关42，我们在16p11.2中没有观察到任何明显的惊厥发作重复/+老鼠。相反，我们发现16p11.2复制/+小鼠易受化学诱导癫痫发作的影响，这表明存在亚阈值电路表型。我们认为，大脑皮层回路的同步性增强会增加癫痫发生的风险，这可能会在特定的遗传和/或环境背景下导致癫痫。脑成像研究的证据支持网络超同步是一种癫痫内表型，可能促进癫痫发生的观点59也值得注意的是，并非所有人类16p11.2复制/+携带者癫痫发作。然而，癫痫是16p11.2中最常见的症状之一复制/+影响高达40%个人的携带者26有趣的是，16p11.2复制/+导致高危罗兰迪氏癫痫，这是儿童癫痫最常见的形式之一，影响感觉运动区20因此，体感皮层区域的同步性增加可能会增加罗兰病发作的风险。尽管如此，16p11.2复制/+据报道，携带者有多种发作类型，包括局灶性认知障碍、全身强直阵挛性、发热性和婴儿性发作，表明其似乎普遍易患癫痫25，26.
电路表型对其他NPD的影响
神经元同步性的改变与包括自闭症和精神分裂症在内的多种NPD有关60。位于离散脑区的神经网络中相关活动的中断可能会通过干扰稀疏的编码模式、增加噪音或损害显著信号的处理，导致NPD患者表现出一系列行为症状61——64例如，局部体感和视觉皮层的过度同步可能会引起16p11.2重复携带者表现出的感觉敏感性增强65或者，异常同步可能会导致“噪声网络”，从而损害信息处理并破坏高阶皮层处理66——68有趣的是，对静止状态脑电图的分析表明，16p11.2重复载体提高了θ带的同步性，这是一种与认知、学习和记忆有关的振荡69.此外，Ca2+在综合征ASD和SZ小鼠模型中的成像研究发现，皮层回路中的神经元协同活动增加，这表明超同步活动可能是NPD与癫痫共存的一种聚合机制70——73因此，过度同步的皮层回路是一种很有吸引力的机制，可通过这种机制影响多种神经精神表型，包括认知、社会功能和癫痫发作等方面。在这里，我们已经证明了16p11.2中的反转电路表型复制/+小鼠还与社会缺陷（一种非癫痫表型）的挽救有关。然而，回路表型与人类携带者表现出的各种症状的相关性，以及确切的大脑区域和所涉及的回路，仍有待完全确定。
16p11.2重复小鼠的PRRT2与疾病机制
16p11.2区域包含30个基因，其中许多基因在大脑中表达，因此可能有一个或多个基因与疾病表型有关。尽管许多候选基因只是向前发展的，但关于它们在行为水平和疾病模型背景下的作用的经验证据仍然稀少。这里，我们表明PRRT2在电路和行为水平上都具有关键作用，调节16p11.2中与疾病相关的表型复制/+老鼠。我们的工作表明第2阶段基因剂量导致膜上PRRT2的上调，从而失调癫痫相关蛋白网络，导致电路同步性升高，谷氨酸释放增加，从而影响癫痫易感性和社交能力。
有趣的是PRRT2项目（与复制中的功能丧失相反）导致良性家族性婴儿癫痫（OMIM:605751），这是最常见的婴儿癫痫疾病之一。因此，我们的工作出乎意料，因为降低PRRT2水平与癫痫发作和神经症状有关，但降低16p11.2的PRRT2复制/+小鼠模型对癫痫易感性和行为表型有良好的影响。这表明PRRT2项目可能有害并导致神经精神症状项目2剂量与受损的社会行为有关，但功能丧失研究并未涉及到这一点。尽管如此，必须注意区分人类和小鼠的表型。16p11.2复制/+小鼠模型具有很强的结构效度，因为与人类条件相比，相同的一组基因在小鼠体内复制。然而，不可能辨别小鼠表现出的行为缺陷（面部有效性）是否是NPD中观察到的社会损害的真实反映。16p11.2中的社交能力变化复制/+小鼠可能代表人类症状的非机械联系的现象74然而，社会缺陷似乎是16p11.2中最具重复性的行为表型之一复制/+通过纠正PRRT2表达拯救小鼠和。
先前的研究表明，PRRT2是一种富含谷氨酸能神经元突触前末端的突触蛋白47，75考虑到与兴奋性神经元和突触前功能相关的基因集在16p11.2中优先被破坏，这种亚细胞表达模式与我们的工作高度相关复制/+膜蛋白质组。通过在小鼠新皮层中使用IAP-MS，我们发现PRRT2与广泛的蛋白质相互作用，这些蛋白质富含突触前功能以及ID和癫痫基因的产物。该数据与之前的报告一致，报告显示PRRT2与SNARE复合体的成员相关，并调节Ca2+-突触小泡的依赖性融合47然而，我们的蛋白质组数据超越了以往的研究，显示了200多个与PRRT2功能相关的蛋白质，我们希望这些蛋白质将为研究这一重要疾病基因本身提供有价值的信息。有趣的是，PRRT2在小鼠的围产期开始表达，这表明我们观察到的救援机制大多是在出生后发生的，发生在皮质发育的主要里程碑之后47这些数据表明，出生后治疗可能对16p11.2重复携带者有效，针对单个基因也可能是CNV疾病的适用策略76.
总之，我们的工作表明，蛋白质组学可以帮助识别复杂CNV中能够逆转表型的疾病中心，并强调了NPD与癫痫共存的分子和回路表型。
方法
鼠标模型
所有动物程序都是在西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行的（IS00006149和IS00015320）。16p11.2复制/+携带小鼠染色体7qF4（人类染色体16p11.2的同步区）复制的小鼠模型由Alea Mills博士（冷泉港实验室）制作28由Nicolas Katsanis博士将小鼠回交5代以上至C57BL/6 J背景，并好心赠送给我们的实验室。雄性16p11.2复制/+实验前，小鼠在C57BL/6 N背景下杂交至少2代（查尔斯河实验室）。如前所述，我们进行了SILAM标记77简单地说，雌性小鼠（F0）被喂食15从P21开始到繁殖和断奶，以富含N的螺旋藻为基础的食物喂养十周。在“重”胎（F1）的大脑中，至少95%的蛋白质是15N富集。“重”F1小鼠喂食正常的(14N） 节食十周。项目2+/-在C57BL/6J背景上项目2飞行/飞行Mark LeDoux慷慨捐赠78。对于项目2校正实验，16p11.2复制/+小鼠与项目2+/-老鼠。根据性别，在温度为70–74°F、湿度为30–70%的条件下，以14小时开启/10小时关闭的光/暗循环将小鼠关在家中。每个笼子最多容纳五只动物，有混合基因型的窝友。除非另有说明，所有实验均在6-10周龄的雄性和雌性小鼠上进行。所有实验均在室友对照组上进行。
蛋白质印迹
或16p11.2区编码的蛋白质的western blotting，通过在冷RIPA缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，+添加新鲜蛋白酶抑制剂）中溶解1SDS-PAGE和免疫印迹前h，使用抗SEZ6L2（Abcam，ab197058，1:500）、抗PRRT2（Sigma，HPA014447，1:2000）、抗ERK1（Santa Cruz，sc94，1:5000）、抗TAOK2（Santa Cruz，sc-47447，1:500
膜蛋白质组学的分离
6周龄男性大脑皮层16p11.2复制/+老鼠(n个 = 5） ，他们的16p11.2+/+男室友(n个 = 5） 、和15将N标记的小鼠解剖并在液氮中快速冷冻。接下来，我们从冷冻的皮层组织中制备P2膜组分（或粗突触体）。所有皮层在添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的冷蔗糖缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，320 mM蔗糖，5 mM EDTA）中均质，并进行BCA以评估每个样品的蛋白质浓度。量化后，15将N标记的匀浆以1:1的比例分别添加到每个16p11.2中复制/+和16p11.2+/+小鼠匀浆。然后以低速离心匀浆，使细胞核和细胞碎片（3000g，在4o个C） 然后将上清液（S1）高速离心（38000克4点持续30分钟o个C） 以获得膜分数（P2颗粒）。将膜微丸在低温RIPA缓冲液中溶解1 h，4o个C并通过离心澄清（10分钟，15000克)。然后使用甲醇/氯仿沉淀提取蛋白质，并将其储存在−80o个C在质谱之前。
质谱样品制备
用100μl的8 M尿素将膜部分（或IP样品）重新悬浮30 min。然后添加100μl 0.2%的蛋白酶MAX（Promega，Cat#V2072）并培养2 h。样品用TECP还原1 h，并用IAA在室温黑暗中烷基化20 min。用300μl的50然后加入mM碳酸氢铵、5μl 1%蛋白酶MAX和胰蛋白酶（1:100），在37°C下剧烈搅拌培养过夜。第二天，通过添加1%甲酸来终止反应。使用HyperSep C18筒（Thermo Fisher Scientific）对膜分馏样品进行脱盐，并真空离心干燥。使用Hypersep SCX柱（Thermo Fisher Scientific，产品目录号60108-420）对脱盐样品进行分馏。在增加醋酸铵浓度（0、25、50、500、1000 mM）的300μl缓冲液中两次洗脱馏分，快速抽真空至干燥，然后用ZipTips（Pierce，Cat#87784）脱盐，再次干燥。
质谱法
用Thermo EASY nLC 1000 UPLC泵将每种组分或样品的三微克自动取样仪加载到排气的Acclaim Pepmap 100 75μm×2 cm纳米毒蛇捕集柱上，该捕集柱与纳米毒蛇分析柱相连（Thermo Fisher Scientific，分类号：164570，3µm，100Ω，C18，0.075 mm，500mm），不锈钢发射极尖端组装在纳米喷射Flex离子源上，喷射电压为2000 V。使用耦合Orbitrap Fusion（Thermo Fisher Scientific）和Xcalibur 4.4生成质谱（MS）数据。缓冲液A含有94.785%H2O（含5%ACN和0.125%FA），缓冲液B含有99.875%ACN（含0.125%FA）。色谱运行共4小时，曲线如下：7分钟为0-7%，6分钟为10%，160分钟为25%，40分钟为33%，7分钟为50%，5分钟为95%，15分钟为95%。如前所述使用CID-MS2方法(79)。简言之，离子传输管温度=300°C，Easy-IC内部质量校准，默认充电状态=2，循环时间=3 s。探测器类型设置为Orbitrap，分辨率为60 K，宽四路隔离，质量范围=正常，扫描范围=300–1500 m/z，最大注入时间=50 ms，AGC目标=200000，微扫描=1，S透镜射频水平=60，无震源碎片，数据类型=正值和质心。MIPS设置为打开，包括充电状态=2–6（拒绝未分配）。使用启用了动态排除n个 = 1为30 s，45 s，高、低浓度为10 ppm时的排除持续时间。前兆选择决策=最强，前20，隔离窗=1.6，扫描范围=自动正常，第一质量=110，碰撞能量30%，CID，探测器类型=离子阱，OT分辨率=30 K，IT扫描速度=快速，最大注入时间=75 ms，AGC目标=10000，Q=0.25，为所有可用的并行时间注入离子。
质谱数据分析和量化
蛋白质鉴定/定量和分析采用集成蛋白质组学管道-IP2（Integrated Proteomics Applications，Inc.，San Diego，CA）进行。http://www.integratedproteomics.com/)使用ProLuCID80，81，DTA选择282，83人口普查和定量分析。使用RawConverter 1.0.0.0将光谱原始文件提取到MS1、MS2文件中(http://fields.scripps.edu/downloads.php)。根据UniProt小鼠蛋白质数据库（2014年3月25日下载）搜索串联质谱84并使用ProLuCID/SEQUEST算法（ProLuCID 3.1版）与对前体离子具有20ppm肽质量耐受性和对片段离子具有600ppm肽质量耐受性的序列匹配。搜索空间包括质量耐受窗口内的所有全胰蛋白酶肽和半胰蛋白酶肽候选肽，并使用DTASelect2至IP2进行组装和过滤。为了准确估计肽概率和假发现率（FDR），我们使用了一个目标/诱饵数据库，其中包含附加到目标数据库的所有蛋白质的反向序列85.每种被鉴定的蛋白质都需要至少有一个肽，其最小长度为六个氨基酸残基；然而，该肽必须与FDR<0.001和至少一个优秀肽相匹配。筛选肽/光谱匹配后，我们估计每个样品分析的蛋白质FDR≤1%。产生的蛋白质列表包括子集蛋白质，以便考虑从复杂的IE蛋白质混合物中识别的给定肽所涉及的所有可能的蛋白质形式。然后，我们在IP2中使用人口普查和定量分析15基于N的蛋白质定量。人口普查中计算了每对提取离子色谱图的肽离子强度比。简而言之，使用线性最小二乘相关算法定义未标记和标记离子色谱图数据点之间的比率（即线斜率）和拟合质量[即相关系数（r）]。在这项研究中，只有具有r的肽比率2大于0.5被认为是可靠的测量值，并用于进一步分析。我们进一步使用Grubbs检验来定义统计异常值。截止日期是第页 = 0.01之间。任何带有第页大于此阈值的值已从进一步分析中删除
Z比率计算
Z分数的计算公式如下：
Z轴（P，i）指定为蛋白质P在生物复制（BR）i.P中的Z评分我指定为BR i中蛋白质P的值。平均值我指定为BR i.SD的平均值我指定为BR i的标准偏差。
Z比率的计算公式如下：86
Z比率第页表示蛋白质P的Z比率。Z（第页，复制/+)_平均表示从16p11.2中获得的蛋白质P的所有z分数的平均值复制/+老鼠。Z轴（第页，+/+)_平均表示从16p11.2获得的蛋白P的所有z分的平均值+/+老鼠。标准偏差[Z差异（p1…pn）]表示16p11.2之间所有Z分数差异的标准偏差复制/+和16p11.2+/+小鼠的所有定量蛋白质，p1….第页n个.
基因本体分析
使用DAVID进行基因本体分析(https://david.ncifcrf.gov网址/)和SynGO(https://www.syngoportal.org/)87，88对于使用DAVID的GO分析，使用DAVID基因ID转换器将所有基因列表转换为Entrez基因ID，生成背景膜蛋白质组列表(n个 = 4351），上调蛋白质列表(n个 = 647）和下调蛋白列表(n个 = 1010). 使用GOTERM_BP_4功能和功能注释聚类（图和S6b）。当使用功能注释聚类时，显示了该聚类的代表术语，完整数据集显示在补充数据（补充数据2，4，6)。仅Benjamini–Hochberg（BH）调整第页-所有结果中都使用了值。数据显示为-Log10（BH-调整第页-值）。对于使用SynGO进行的GO分析，所有列表都转换为HGNC ID。结果报告为-Log10（FDR修正第页-值）。
基因集富集分析
质谱数据经过过滤，仅包括至少三个16p11.2中定量的蛋白质+/+和三个16p11.2复制/+样本。16p11.2中所有失调蛋白质（上调，Z比率>1.96或下调，Z比率<-1.96）复制/+基因集富集分析中考虑了膜组分，包括（按基因符号）659个上调蛋白和1024个下调蛋白。使用在R和自定义基因集中实现的超几何检验进行富集分析。分析中排除了背景膜蛋白质组中不存在的所有基因/蛋白质（即在膜组分中检测到的所有4447个蛋白质）。重要的是，为了控制膜中任何预先存在的基因集富集，所有超几何测试都是以膜蛋白质组为背景集进行的。数据显示为富集度比相关超几何偶然预期的富集度增加%第页-值。
自定义基因列表
在神经精神疾病患者中发现的含有从头开始单核苷酸变体（dnSNV）的基因列表是从从头开始数据库中编辑的先前发布的数据中获得的(http://denovo-db.gs.washington.edu/denovo-db)来自大规模外显子组测序研究89——93只有预测会影响蛋白质编码的dnSNV被用于下游分析（错义、移码、停止获得、停止丢失、开始丢失、剪接受体和供体变体）。编码区以外的变体以及同义变体被排除在外。对照dnSNV列表来自相同的来源，包括来自未受影响的兄弟姐妹或没有已知精神障碍的个人的外显子变异。
下载OMIM数据库，并通过使用GeneMap功能搜索关键字，生成与癫痫或智力残疾相关的基因列表。其中包括癫痫搜索词（“癫痫”、“癫痫病”、“发作”和发作”）和智力残疾搜索词（包括“智力残疾”、“精神发育迟滞”和“发育迟缓”）。
细胞类型特异性基因集（星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞）和兴奋/抑制基因集是从已发表的补充材料中获得的94，95在兴奋性神经元中富集的基因被定义为在新皮层中表达的所有基因，其转录物大于百万分之2（TPM），并且平均表达是抑制性细胞类型（PV+和VIP+）的1.2倍第页 < 0.05. 同样的策略被用于确定抑制基因集，其中计算了兴奋神经元表达的富集。
人脑共表达基因集用于识别16p11.2区的分子网络功能相关基因43前2000个共表达基因（r2)每个基因都从大脑跨度门户下载(http://brainspan.org/rnaseq/search/index.html)选择所有人类皮层区域和所有发育阶段。
人类NPD和小鼠模型中被破坏的蛋白质列表来自已发布的蛋白质组数据集96——102.所有蛋白质P（P） < 0.05用于基因集分析（补充图三).
PRRT2相互作用组列表包含IAP-MS实验中的所有蛋白质(n个 = 208）通过选择标准(P（P） < 0.1）（见方法部分PRRT2的免疫亲和纯化）。
来自16p11.2的皮层差异表达基因列表复制/+老鼠（用于P（P） < 0.01）从之前发表的研究中获得30，39.
蛋白质：蛋白质相互作用网络分析
为了建立一个全面的癫痫相关网络，我们生成了一个癫痫风险因素的扩展列表（参见基因集富集分析详细信息）包括OMIM癫痫相关基因103，癫痫dnSNV数据来自从头数据库90，参考文献中的补充数据。89和反复受影响的基因，参考文献中至少有两个dnSNV。104扩大的癫痫列表与16p11.2中确定的所有失调蛋白交叉复制/+膜蛋白质组，这导致了110个蛋白质的重叠。将与列表中的每个蛋白质相对应的基因符号列表导入Cytoscape中的GeneMANIA插件（v3.6.0）。该网络通过自动加权构建，仅使用物理交互作为边，并为每个节点查找前50个相关基因和最多20个属性。为了将新识别的PRRT2相互作用纳入癫痫子网络，将IAP-MS实验中的二进制PRRT2蛋白：蛋白质相互作用列表作为网络表导入膀胱镜，然后与癫痫子网络合并。使用Cytoscape对网络进行可视化和注释。度值(D类)和中间性中心(C类B类)使用Cytoscape的集成网络分析模块进行计算。
初级皮层神经元培养和转染
所有实验均在17-23天的体外原代小鼠皮层神经元上进行。从分离的同胞16p11.2制备初级皮质神经元复制/+和16p11.2+/+胚胎第18.5天的胚胎。从胚胎中提取大脑，使用解剖显微镜分离皮层，并将其储存在冰冷的L-15培养基（Thermo Fisher）中，该培养基补充有青霉素（50 U/ml）和链霉素（50μg/ml）（pen/strep，Gibco）。在含有EDTA（0.5 mM，Sigma）和DNaseI（2个单位/ml，Sigma-）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM，Corning#10013CV）中稀释的木瓜蛋白酶（Sigma；20个单位/ml）中消化皮层组织。在用L-半胱氨酸（1 mM）进行酶消化前10分钟激活木瓜蛋白酶溶液，并在37°C下培养20分钟。在高糖解离培养基（含10%胎牛血清（FBS，Corning）、1.4 mM谷氨酸MAX和6 g/L葡萄糖的DMEM）中机械分离皮层组织。将含有分离的皮层神经元的上清液接种在含有盖玻片（Neuvitro Corporation）的12或24孔板上，盖玻片用50µg/ml聚-D-赖氨酸（Sigma）预涂过夜。12个孔板中包含18 mm的盖玻片，每孔密度为20’000个细胞，24个孔板包含12 mm的盖博片，每井密度为10’000细胞。播种后2小时，用Neurobased培养基（添加B-27补充剂（Gibco）、2 mM谷氨酸MAX（Gibco）和pen/strep）的Neurobated培养基代替分离培养基。神经细胞培养物保持在37°C和5%CO中2每周进行两次Neurobased培养基和半培养基更换。
培养神经元的钙显像
所有实验均在18 mm盖玻片上培养的DIV19-23初级皮层神经元上进行，实验人员对基因型一无所知。自发活动数据来自4种独立培养物（16p11.2+/+=14个大脑，22个盖玻片；16页第11.2页复制/+=11个大脑，20个盖玻片），荷包牡丹碱的数据来自2个独立的培养基（16p11.2+/+=5个大脑，15个盖玻片；16页第11.2页复制/+=6个大脑，15个盖玻片）。细胞直接在培养基中与荧光钙指示剂（Cal520AM，1:1000，AAT biotech）和胶质细胞染料（SR101，1:1000和Sigma）孵育30分钟，然后在含有mM:125 NaCl，2.5 KCl，26.2 NaHCO3，1，NaH2PO4，11葡萄糖，5 HEPES，2.5 CaCl2和1.25 MgCl2的热ACSF中洗涤三次。含神经元的盖玻片在37℃孵育30分钟o个C放在成像室（华纳仪器公司，QR-41LP）中，并转移到OKOLAB阶段式培养箱中，37℃CO2浓度为5%o个C在成像之前。使用配备ANDOR Zyla 4.2 sCMOS相机和x10物镜的尼康C2+显微镜，以2帧/秒的速度通过外荧光采集神经网络活动，持续10分钟。在含有30μM荷包牡丹碱（Tocris）的ACSF或ACSF中记录自发神经元活动，并通过蠕动泵（Gilson）将其灌注到记录室中。在NIS-Elements（v4.20 Nikon）中手动追踪与神经元胞体相对应的感兴趣区域（ROI）（约300个/盖玻片），以在10分钟的记录中获得钙的踪迹。使用没有神经元的盖玻片区域减去每个盖玻片的背景。将钙信号归一化为生成F/F0值的局部基线，并将其导入MATLAB。
急性脑切片的钙成像
实验于约2周龄16p11.2进行复制/+和16p11.2+/+由一名对基因型一无所知的实验者从同一窝幼崽中取出小白鼠（出生后第12-16天）。体感皮层数据来自4只独立幼崽（16p11.2）+/+=4只小鼠，7片；16页第11.2页复制/+=4只小鼠，8片），从3只独立的幼崽（16p11.2）中生成视觉皮层数据+/+=2只小鼠，7片；16页第11.2页复制/+=4只小鼠，10片）。用3.5%异氟醚对小鼠进行深度麻醉，斩首，将其大脑快速提取并冷冻在由（mM）NaCl 92、KCl 2.5、NaH组成的冷冻“切割”ACSF中2人事军官41.2，NaHCO三30、HEPES 20、葡萄糖25、抗坏血酸钠5、丙酮酸钠3、MgSO4.7小时2O 10，氯化钙2.2小时2O 0.5，pH 7.3，用95%O起泡2，5%一氧化碳2将大脑粘在振动VT1000S（徕卡）上，并切割成400μm的厚度。切片在33分钟时保持至少45分钟o个“恢复”ACSF中的C（类似于使用2 mM MgSO切割ACSF4和氯化钙2)在与钙传感器Cal520AM（AAT生物技术公司）和胶质染料SR101（Sigma）孵育45分钟之前，使用多光子激光扫描显微镜（A1R MP，Nikon）以每秒4.8帧的速度采集初级体感皮层（S1）或初级视觉皮层（V1）的2/3层，激光功率为20 mW，波长为820 nm。切片在33时孵化o个“记录”ACSF中采集期间的C（单位：mM）：NaCl 124、KCl 2.5、NaH2人事军官41.2，NaHCO三24、HEPES 5、葡萄糖12.5、MgSO4.7小时2O 1，氯化钙2.2小时2氧气，pH值7.3，95%2，5%一氧化碳2在对照组ACSF中获得前5分钟，然后在浴中应用荷包牡丹碱（50μM）25分钟，诱导大的同步神经元事件。在ImageJ上使用定制的常规程序自动追踪神经元体对应的ROI，检测40至500μm2的元素轮廓，并呈现等于或高于2.5的Cal520信号的z评分变化。人工检查ROI以消除伪影和胶质细胞（平均而言，自动ROI被删除的不到5%）。钙信号导入MATLAB中，使用局部背景进行归一化，并使用小波滤波器进行平滑，钙瞬态表示为基线周围的变化百分比（∆F/F0）。
钙成像分析
使用软件的“findpeaks”功能自动检测钙事件，最低变化率高于基线15%（急性切片为20%）。在MATLAB中计算峰值振幅、半宽度和频率。通过将局部基线（F0）减去最大峰值（F）来测量钙事件幅度，并通过除以局部基线将其归一化为百分比：（F-F0）/F0。Monte-Carlo模拟使用每个神经元的1000个峰值排列，无偏检测可被视为同步钙事件的最小数量的协同活动细胞（阈值等于1000个模拟事件总和的99.9%）。在检测到同步事件后，我们在MATLAB中确定了每个事件的共激活细胞数和网络事件的频率。还使用成对相关性来评估神经元同步性，该相关性测量所有成对神经元信号的R系数相关性（值1等于完美正相关性，即完美同步性）。神经元之间的延迟是通过测量每对神经元在正负2.1秒的间隔内将钙事件与最近的钙事件分开的时间来量化的。
培养神经元的谷氨酸成像
在DIV17-22对初级皮层神经元进行实验。数据收集自5种独立培养物(重量 = 6个大脑，20个视野；杜普 = 11个大脑，42个视野；Corr＝10个大脑，27个FOV）。神经元被镀在18 mm盖玻片上（3×105/coverslip），在DIV11-14感染Syn-iGluSnFR病毒（Addgene#98929-AAV1），并在37o个C和5%CO2持续6-8天。在成像之前，盖玻片在温暖的ACSF中清洗三次（与体外钙的成分相同2+成像），37℃孵育10分钟o个C直接放置在成像室中，并安装在含有5%CO的OKOLAB阶段式培养箱中2第37页o个C.使用配备ANDOR Zyla 4.2 sCMOS相机和10倍物镜的尼康C2+显微镜，以每秒20帧的外荧光采集自发网络活动4分钟。每张盖玻片采集1-2个视野（FOV）。在NIS-Elements（v4.20尼康）中量化整个视野中的荧光变化，并将痕量导入MATLAB进行量化。使用“medfilt1”函数对信号基线进行归一化，使用“findpeaks”检测峰值，与基线相比变化最小1%。通过添加KCl（30 mM最终浓度）诱发峰直接进入成像室的ACSF。通过将荧光值除以基线荧光值（前50帧的平均值），对KCl诱导的峰值进行归一化。归一化峰被导入GraphPad Prism。曲线下面积（AUC）函数用于计算峰值的振幅和AUC，而非线性拟合用于估计曲线的衰减部分（T1/2).
PRRT2的免疫亲和纯化
对于每个免疫亲和纯化（IAP）实验(n个 = 3） 将10μg PRRT2兔抗体（Sigma，HPA014447）和非特异性兔IgG抗体（Santa Cruz，sc-2027）交联至30μl包装蛋白A/g珠（Pierce#20421）。抗体和珠在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中偶联，然后在pH为9的0.2M硼酸钠中进行三次洗涤。在硼酸钠缓冲液中使用20 mM二甲基吡美酰胺（DMP，Thermo Fisher）交联抗体。将耦合珠在0.2 M乙醇胺（pH 8.0）中清洗一次，并在室温下将剩余的DMP在乙醇胺中淬火1 h。珠在PBS中清洗三次，并保存在4°C下，直到IAP实验（<2天）。冲洗后的膜组分基本上如前所述制备105对于每个IAP实验，将8–10只6周龄小鼠的新皮质在添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的冷蔗糖缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，320 mM蔗糖，5 mM EDTA）中均质。将匀浆低速离心以沉淀细胞核和细胞碎片（3000g，在4o个C） 然后将上清液（S1）高速离心（38000克4点持续30分钟o个C） 以获得膜颗粒（P2）。将P2重新悬浮在碘化钾缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，1 M KI，5 mM EDTA）中，以去除膜相关蛋白（S3），并再次通过离心（38000）收集膜克在4℃下保持20分钟）。在添加蛋白酶抑制剂的CHAPS缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，100 mM NaCl，5 mM EDTA，1%CHAPS）中溶解之前，清洗膜（20 mM HEPES PH7.4，5 mmM EDTA）并再次造粒（S4）2 h，4o个C.溶解膜在10’000离心30分钟后澄清克，第4页o个C和为IAP实验保留的澄清上清液（S5）。将CHAPS不溶性颗粒重新悬浮在补充有蛋白酶抑制剂的SDS缓冲液（50 mM TRIS pH 7.4，150 mM NaCl，1%SDS）中，在37℃下溶解o个C静置20分钟，并通过离心（S6）澄清。将所有剩余的级分溶解在CHAPS缓冲液中。清洗后的膜组分（S5）与交联抗体珠在4℃孵育过夜o个第二天，在纯化柱中收集珠子（Biorad）。在洗脱含有1%CHAPS的100 mM甘氨酸（pH 2.5）中的蛋白复合物之前，将珠在CHAPS缓冲液中清洗三次。然后用1 M Tris pH 8.5（1:10）中和洗脱液，并用三氯乙酸（TCA）沉淀提取蛋白质。沉淀蛋白储存在−80o个MS前C。清除常见MS污染物。与IgG相比，PRRT2 IAP中显示平均光谱计数高2倍的所有蛋白质（单尾吨-测试，第页 < 0.1）被视为交互组数据集的一部分(n个 = 208).
HEK细胞和小鼠大脑皮层的免疫沉淀
HEK293T细胞（ATCC）在含有10%FBS和1%pen/step的DMEM中培养。将细胞接种到10 cm的平板上，并按照制造商的说明转染脂质体2000。5微克FLAG-项目2转染质粒（GeneCopoeia）和5μg SNARE质粒（T7-VAMP2或myc-STX1A，由日本东北大学Mitsunori Fukuda善意提供），并在免疫沉淀（IP）前表达48小时。用PBS清洗HEK293T细胞，在IP缓冲液中均质（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1%Triton X-100，含蛋白酶抑制剂混合物），并在4°C下溶解1 h。通过15000的离心作用澄清可溶性物质克在4°C下保持10分钟。然后将可溶性蛋白质与1μg抗FLAG抗体（F1804，Sigma）或1μg小鼠IgG（sc-2025，Santa Cruz）在4°C下孵育过夜，然后在第二天用20μl蛋白a/g珠捕获1小时。然后用IP缓冲液清洗珠子三次，然后添加2×Laemmli缓冲液（Biorad），并在95°C下煮沸5分钟。在成年小鼠（>6周）中进行小鼠脑IP，基本如上。使用IP缓冲液和5μg抗pan-Na对来自新皮质的可溶性P2膜部分进行钠通道IPv（v）抗体（S8809，Sigma）。输入和IP样品通过SDS-PAGE和western blotting进行分析。
癫痫敏感性分析
所有实验都是在6-8周龄的小鼠上进行的，实验对象是同窝对照组和对基因型一无所知的实验者。初始实验（图)在3个独立的队列（WT，n个 = 16只小鼠；杜普，n个 = 17只老鼠）。救援实验（图)在5个独立队列中进行（WT，n个 = 14只小鼠；杜普，n个 = 13只小鼠；科尔，n个 = 16只小鼠；Het，n个 = 16只老鼠）。实验前至少24小时，将小鼠放置在储藏室中。第二天，将小鼠放置在一个干净的有机玻璃室中，记录其诱导前行为15–30分钟。然后，向小鼠腹腔注射28 mg/kg的海人酸（Sigma），这是一种已知的化学惊厥剂，用于评估小鼠的癫痫敏感性。注射后行为记录长达两小时，并在动物死亡后停止。行为评估是由对基因型视而不见的实验者进行的。我们分析中的主要结果指标是全身强直阵挛发作（GTCS）的发病时间和死亡时间。此外，根据改良的Racine量表，在注射后1小时对小鼠进行监测并对其癫痫相关行为进行评分106具体如下：1。静止不动。鼠标平放在地上，一动不动。2.头部点头和僵硬迹象（尾巴竖立，前肢伸出）3。前肢阵挛。前肢的非自愿肌肉收缩。4.背伸（“抬起”）和前肢阵挛。这只老鼠在阵挛时失去了相当大的平衡。5.持续抬高和摔倒。动物也可能在地面上反复翻滚（“滚桶”），短暂发作（<1s）或剧烈奔跑。6.全身强直阵挛性发作。小鼠在地面上无法直立，痉挛性强直和阵挛性肌肉收缩至少持续5秒7。由于GTCS的严重性导致动物死亡。数据以卡普兰-迈耶曲线表示，代表了一段时间内的累积百分比。GTCS的延迟百分比变化（补充图8)除以16p11.2的平均潜伏期校正16p11.2的平均延迟重复/+，对于两种基因型都有GTCS的每次癫痫诱导试验(n个 = 11).
鼠标行为
所有实验均在6-10周龄的小鼠上进行，不考虑基因型。露天试验：对3个独立队列（WT、，n个 = 20只小鼠；杜普，n个 = 14只小鼠；科尔，n个 = 17只小鼠；赫特，n个 = 13只小鼠）将小鼠放在一个竞技场（30 cm×30 cm×30cm），并使用头顶摄像机记录运动活动。对小鼠进行30分钟的监测，并使用追踪软件（Ethovision，Noldus）来评估行进的总距离。三室社交互动测试：进行了3个独立队列的社交能力测试（WT，n个 = 17只小鼠；杜普，n个 = 7只小鼠；科尔，n个 = 16只小鼠；赫特，n个 = 12只老鼠）在一个长方形玻璃竞技场中，分为3个房间，每个房间之间有一个入口。测试分为两个阶段：在第一阶段（习惯化），物体（倒置的金属丝杯）被放置在左右腔室中。将小鼠置于中央室中，允许其探索竞技场5分钟。在第二阶段（社交），将一只新的小鼠（性别相同，试验小鼠不知道）放在其中一个杯子下，而另一个杯子保持空。然后将试验小鼠置于中间的房间中，允许其探索5分钟。手动记录每只小鼠研究空物体或新奇小鼠（定义为嗅觉或互动）的时间。将每只小鼠的数据转换为辨别指数（DI（%）=[（t鼠标-t吨对象)/（t）鼠标 + 吨对象)×100]).
统计分析
所有统计检验均采用GraphPad Prism或R进行。所有数据均采用D'Agostino和Pearson综合正态性检验进行正态性测试。未成对的吨-如果数据是参数化的，则使用检验；如果数据是非参数的，则采用曼希特尼检验。除非另有规定，否则条形图显示为平均值±SEM。对于癫痫敏感性分析，使用Log-rank检验分析存活率和GTCS发病曲线。使用Fisher精确检验比较生存率和GTCS。然后进行事后Bonferroni校正，以确定每个距离间隔的统计显著性。对于Corr小鼠的行为，使用Tukey的事后检验进行双向方差分析项目2基因型和16p11.2基因型的作用作为自变量。对于谷氨酸盐成像，进行了Kruskal–Wallis检验，并对多次比较进行了Dunn校正。在比较振幅时，基于α=0.01的Grubb检验去除了一个孤立点。在R中进行基因集分析的超几何检验。如果第页 < 0.05，除非另有规定。对于所有统计测试，星号表示：*第页 < 0.05;**第页 < 0.01,***第页 < 0.001. 每个实验的“n=”是指：细胞数量（用于神经元形态学、脊椎分析和点状分析）、盖玻片数量（用于体外钙成像）、切片数量（用于急性脑切片）、FOV数量（用于谷氨酸成像）或动物数量（用于癫痫发作和行为分析）。
