的静音RhoC公司诱导巨噬细胞M1级极化抑制结肠癌的迁移和侵袭PTEN公司/狐狸1通路

2.2. 转染

靶向RhoC（sh-RhoC）和阴性对照（sh-NC）的shRNA来自GenePharma。根据制造商的说明，在37°C下使用脂质体3000试剂（Invitrogen）将SW4800和HCT‐8细胞转染sh‐RhoC或sh‐NC细胞48小时。随后，转染细胞被用于下一个实验。

2.3. 巨噬细胞极化

THP‐1与佛波醇12‐肉豆蔻酸13‐醋酸盐（PMA，200 nM）（Sigma‐Aldrich）孵育24 h，并分化为巨噬细胞。转染的CC细胞在无血清培养基中培养24小时后收集上清液，并在1500℃离心20分钟克用CC细胞的条件培养基处理24小时后，巨噬细胞转化为TAM。非接触式transwell系统（孔径0.4 m，剑桥科宁）用于共同培养TAM和CC细胞。在顶部培养箱培养的TAM与底部培养箱中的可比CC细胞沟通48小时，然后移除CC细胞并进行进一步分析。

2.4. 蛋白质印迹分析

使用细胞裂解缓冲液（Sigma‐Aldrich）提取蛋白质。样品通过10%SDS‐PAGE溶解，然后转移到PVDF膜上。将膜用5%脱脂乳在25°C下封闭1小时，并与抗RhoC（1:1000，ab180785，Abcam）、MMP‐2（1:1000，ab92536，Abcam）、PTEN（1:1000，ab267787，Abcam）、FOXO1（1:1000，ab179450，Abcam）、对FOXO1（1:1000，ab131339，Abcam）、MMP‐9（1:1000，ab76003，Abcam）的一级抗体一起孵育和β-actin（1:1000，ab8227，Abcam）在4°C下过夜。随后，在25°C下清洗膜并用HRP偶联二级抗体（1:5000）孵育1小时。使用增强化学发光western印迹检测试剂盒（Sigma‐Aldrich）分析印迹。β-actin被用作蛋白质负荷控制。

2.5. 定量实时聚合酶链反应(qRT‐聚合酶链式反应)

使用TRIzol试剂（Sigma‐Aldrich）提取SW480和HCT‐8细胞中的总RNA。根据制造商的说明，使用逆转录酶试剂盒进行逆转录，使用SYBR®Green Master Mix试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行qRT‐PCR，并通过Mastercycler ep realplex检测系统（Eppendorf）进行分析。使用2^-ΔΔCt方法。引物序列如表所示1.

2.6. 3‐[4,5‐二甲基‐2‐噻唑基]‐2,5二苯基-2H‐溴化四唑(MTT公司)化验，化验

使用MTT试剂盒（Sigma‐Aldrich）测量SW4800和HCT‐8细胞的活性。将细胞在37°C的96孔板中培养24 h，并向孔中添加20μl MTT（2.5 mg/ml），并保持4-6 h。然后，用微孔板阅读器（Labcompare）测量吸光度（450 nm），并在0、24、48和72 h时记录。

2.7. 伤口愈合试验

细胞在6孔板无血清培养基中培养24小时。移液管尖端用于刮除细胞并创建间隙。24小时后，将死亡细胞洗掉，并立即拍摄显微照片。

2.8. Transwell分析

通过transwell（8μm孔，Corning公司）分析SW4800和HCT‐8细胞的侵袭。用1μg/μl Matrigel（BD Biosciences）预涂上层培养箱5小时，添加细胞（5×10⁴细胞）并在37°C下培养过夜。下室含有含有10%FBS的培养基。下室中的细胞用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.1%结晶紫在25°C下染色10分钟。光镜下计数侵袭细胞。

2.9. 动物

本研究使用30只BALB/c雄性裸鼠（5周，18-20g，上海斯莱克实验动物有限公司）。这项研究是按照美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行的，并得到哈里森国际和平医院伦理委员会的批准。将小鼠随机分为三组(n个=10），皮下注射HCT‐8细胞（40μl，0.5×10⁶ 细胞）转染sh-RhoC和sh-NC。他们在28天后被安乐死。每7天测量肿瘤重量，并使用公式（长×宽²)/2.

3.2.RhoC公司沉默抑制细胞活力、迁移和侵袭

通过在SW480和HCT-8细胞中转染shRNA‐RhoC来研究RhoC对CC细胞的影响。RhoC沉默后，RhoC的表达降低（图2安培,第页 < .01). RhoC沉默降低了SW480和HCT‐8细胞的活性（图2B型,第页 < .01). 此外，RhoC的敲除抑制了SW480和HCT‐8细胞的迁移和侵袭（图2C、D,第页 < .01). 此外，western blot分析表明，SW480和HCT-8细胞中RhoC沉默降低了与迁移相关的基因水平（MPP-2和MPP-9）（图第二版,第页 < .01). 数据表明，RhoC沉默降低了细胞活力，抑制了CC细胞的迁移和侵袭，从而有助于抑制CC的进展。

在单独的窗口中打开

图2

RhoC沉默抑制细胞活力、迁移和侵袭。（A） ●●●●。通过RT-qPCR检测不同组中RhoC的表达。（B） ●●●●。MTT法测定细胞活力。（C） ●●●●。进行伤口愈合试验以检测迁移。（D） ●●●●。采用Transwell分析检测侵袭。（E） ●●●●。western blot检测迁移相关基因（MMP-2和MMP-9）的水平**第页 < .01与sh‐NC。

3.3.RhoC公司沉默抑制平方米两极分化和促进M1级极化

人类蛋白质图谱(https://www.proteinalas.org/)用于预测RhoC表达，将其与CC组织中不同单细胞类型簇中的已知细胞类型标记物联系起来。如图所示第3页，CD163（M2巨噬细胞标志物）的表达上调。因此，在与TAM共同培养的CC细胞中，研究了RhoC沉默对巨噬细胞极化的作用。M2标记物（CD206、Arg‐1和IL‐10）水平降低（图3B、C,第页 < .01），而M1标记物（iNOS、TNF‐α和COX2）在接受来自sh‐RhoC转染CC细胞的CM处理的巨噬细胞中表现出较高的表达（图3D、E,第页 < .01). 数据表明，抑制RhoC促进M1巨噬细胞极化，抑制M2巨噬细胞极化。

在单独的窗口中打开

图3

RhoC沉默抑制M2极化并促进M1极化。（A） ●●●●。数据来自人类蛋白质图谱。（B、C）。通过RT-qPCR测定M2标记物（CD206、Arg‐1和IL‐10）的水平。（D‐E）。采用RT-qPCR检测M1标记物（iNOS、COX2和TNF-α）水平**第页 < .01与sh‐NC。

3.4.RhoC公司沉默抑制细胞活性、迁移和侵袭PTEN公司/FOXO1系列通路

Western blotting显示RhoC沉默上调HCT‐8细胞中PTEN和p‐FOXO的表达（图4A级,第页 < .01). 为了阐明CC中RhoC的机制，用PTEN抑制剂（SF1670，2μM）处理HCT‐8细胞。数据表明，与sh-RhoC组相比，SF1670提高了HCT-8细胞的存活率，促进了迁移和侵袭，并增加了迁移相关基因（MPP-2和MPP-9）的表达（图4B–E级,第页<.01），表明SF1670逆转了RhoC沉默对CC细胞的抑制作用。

在单独的窗口中打开

图4

RhoC沉默通过PTEN/FOXO1途径抑制细胞活性、迁移和侵袭。（A） ●●●●。western blot检测PTEN/FOXO1的表达。（B） ●●●●。MTT法检测不同组的细胞活力。（C–D）。采用创面愈合实验和穿孔实验检测各组动物的迁移和侵袭。（E） 。western blot检测不同组中与迁移相关的基因（MMP-2和MMP-9）水平*第页 < .05, **第页 < .01与sh‐NC。^# 第页 < .05,^## 第页 < .01与sh‐RhoC‐1。

3.5.SF1670系列反转的效果RhoC公司巨噬细胞极化沉默

此外，还探讨了RhoC沉默是否通过调节PTEN/FOXO抑制M2巨噬细胞极化。数据表明，SF1670逆转了RhoC沉默对M2标记（CD206、Arg‐1和IL‐10）和M1标记（iNOS、TNF‐α和COX2）表达的影响（图5A、B级,第页 < .01). 数据表明，sh-RhoC通过上调PTEN和FOXO的表达抑制巨噬细胞极化。

在单独的窗口中打开

图5

SF1670逆转RhoC沉默对巨噬细胞极化的影响。（A、B）。通过RT-qPCR检测不同组M2标记（CD206、Arg‐1和IL‐10）和M1标记（iNOS、COX2和TNF‐α）的表达**第页 < .01与sh‐NC。^# 第页 < .05,^## 第页 < .01与sh‐RhoC‐1。

不适用。