iScience。2023年1月20日；26(1): 105839.
口腔微生物组、宿主性状的性别差异及其因果关系
,1,2,8 ,2,8 ,2,三，8 ,2 ,2 ,2,4 ,2 ,2 ,5 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2,6,7 ,2,6,7 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2,三，∗ ,2,5,∗∗和2,三，9,∗∗∗
刘晓敏
1中国科学院大学生命科学学院，北京100049
2BGI-深圳，中国深圳518083
竹叶街
2BGI-深圳，中国深圳518083
三丹麦哥本哈根大学生物系
孙强
2BGI-深圳，中国深圳518083
4多伦多大学统计科学系，多伦多，ON M5G 1Z5，加拿大
卢浩荣
5中国国家基因银行，BGI-深圳，中国深圳518120
究所杨焕明
2BGI-深圳，中国深圳518083
6BGI-青岛，BGI-深圳，青岛266555，中国
7詹姆斯·沃森基因组科学研究所，杭州310058
王健（Jian Wang）
2BGI-深圳，中国深圳518083
6BGI-青岛，BGI-深圳，青岛266555，中国
7詹姆斯·沃森基因组科学研究所，中国杭州310058
刘伟斌（Weibin Liu）
2华大基因深圳，中国深圳518083
卡斯滕·克里斯蒂安森
2BGI-深圳，中国深圳518083
三丹麦哥本哈根大学生物系
慧觉佳
2BGI-深圳，中国深圳518083
5中国国家基因银行，BGI-深圳，中国深圳518120
张涛（Tao Zhang）
2BGI-深圳，中国深圳518083
三丹麦哥本哈根大学生物系
1中国科学院大学生命科学学院，北京100049
2BGI-深圳，中国深圳518083
三丹麦哥本哈根大学生物系
4多伦多大学统计科学系，多伦多，ON M5G 1Z5，加拿大
5中国国家基因银行，BGI-深圳，中国深圳518120
6BGI-青岛，BGI-深圳，青岛266555，中国
7詹姆斯·沃森基因组科学研究所，杭州310058
8这些作者贡献均等
9引线触点
2022年5月5日收到；2022年8月9日修订；2022年12月16日验收。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
- 补充资料
文件S1。图S1–S10
GUID:7E4FF2C0-3D4E-43B6-A411-5F90A40A2DB6
表S1.与图1和图3相关的样本和数据摘要
GUID:E445433B-93BF-4AF2-A3B9-B1B13C3E4027
表S2.使用PERMANOVA试验解释的每个宿主因子的唾液（舌背）微生物组成（β多样性），与图2和S4相关
GUID:D0681AFD-7C35-4650-9980-327A6544F618
表S3唾液（舌背）微生物群显示出显著的性别差异（Q值<0.05），与图1相关
GUID:DBE8854B-107F-4FFC-BDD8-441A6C82F2F1
表S4.由唾液（舌背）样本中性别组的最佳分类器选择的受歧视SGB，与图1和S3相关
GUID:A39DC6B0-A95A-4AE5-8049-CFC295377FC4
表S5宿主性状（代谢物、饮食等）与唾液（舌背）微生物组特征之间的显著相关性（FDR调整后P<0.05），与图2和S5相关
GUID:7DD7E047-533B-4567-BE8C-60BF0EB95D1A
表S6.根据性别分层时，由宿主因素解释的唾液（舌背）微生物组成（β分析），与图2、图S4和图S5相关
GUID:D2D045A8-C168-4F81-9E9F-69864A2762B5
表S7：宿主因素显示出较大的性别差异（F统计），与图5相关
GUID:9BAA22C3-EEA1-4CF0-88E5-2623099610EC
表S8.性别组合M-GWAS分析确定了X染色体上与唾液（舌背）微生物群相关的14个位点，与图3相关
GUID:E94A928C-20B7-4B83-9393-983FB94A48FE
表S9：发现队列中遗传变异与唾液（舌背）分类群之间的性别特异性关联（男性P<5×10-8，女性P>0.05，Psex-difference<0.05）及其在复制队列中的验证，与图3相关
GUID:1B790688-D3A6-4CC2-97A1-02550EC5457C
表S10：与图3相关的具有唾液（舌背）微生物组的性别特异性相关SNP的功能富集结果
GUID:62751F45-FAE9-49C6-B383-93FDC6BE215E
表S11：一个样本BMR确定了唾液（舌背）微生物组特征和宿主特征（代谢物、饮食等）之间的因果关系数量，与图4和S6相关
GUID:E8258B13-5352-40DC-A64A-E8ADBA89638C
表S12 MR推断的与STAR方法相关的口腔微生物组与疾病的因果关系
GUID:75F93B05-33F7-4DFC-8368-31BA082A27BB
表S13唾液（舌背）微生物组与MR推断疾病的性别特异性因果关系，与图6相关
GUID:6ACE328B-F92F-4773-9BAA-5A0828DBC748
表S14.进入唾液（舌背）M-GWAS分析的独立分类群（r<0.8）数量及其高度相关分类群，与图3相关
指南：D747B1E5-5437-4BD0-AE67-DCEE971BB5EF
- 数据可用性声明
所有统计结果都可以在补充表格CNGBdb公开了宿主遗传学和舌背微生物组、宿主遗传学和唾液微生物组之间的联系的汇总统计数据：https://db.cngb.org/search/project/CNP0001664这些汇总统计数据的发布得到了中国科学技术部的批准（项目ID:2021BAT1539）。根据中国人类遗传资源管理局（Human Genetic Resources Administration of China）和BGI-Shenzhen机构审查委员会（institutional review board of BGI-Shen）关于保护个人隐私的规定，测序数据是受控访问的，可通过申请获得。
总结
口腔微生物组与越来越多的疾病有关；然而，口腔微生物组的决定因素及其作用仍不明确。在这里，我们调查了4478名个体的口腔（唾液和舌背）宏基因组、全基因组和其他组学数据，并证明口腔微生物组的组成及其主要宿主因素在性别之间存在显著差异。因此，我们进行了一项性别分层的宏基因组全基因组关联研究（M-GWAS），并确定了11种与口腔微生物组的差异遗传关联(对性别差异 < 5 × 10−8). 此外，我们进行了性别分层孟德尔随机化（MR）分析，并确定了口腔微生物组和血清代谢物之间的大量因果关系。值得注意的是，性别特异性微生物与激素的相互作用解释了大多数观察到的性激素差异，例如女性醛固酮和男性雄烯二酮的显著增加。这些发现说明了性别分层的必要性，并加深了我们对口腔微生物群和血清代谢物之间相互作用的理解。
主题领域：微生物组，微生物代谢，口腔微生物学
介绍
肠道微生物组被称为我们的“其他基因组”，因为它在人类健康中起着不可或缺的作用。口腔微生物可以在肠道定植1也与越来越多的疾病有关2,三,4超越龋齿5牙周炎。6许多研究表明，宿主因素，如性别、体重指数（BMI）、生活方式和社会人口统计学差异，可能会影响肠道微生物组的组成。7,8,9,10然而，关于口腔微生物群变异性的各种影响因素的研究有限，11,12,13其中大多数是在小样本采集样本上进行的，并利用16S rRNA基因扩增子测序对口腔微生物群进行测序，而之前的研究表明，16S rRNA无法实现整个基因测序所提供的分类分辨率。14因此，在一个精心设计的队列中，揭示形成和定义口腔微生物组的因素对于了解口腔和更广泛的系统健康至关重要。
4D-SZ队列是一个精心设计的多组分队列，15,16,17,18使用多个身体部位和宿主基因组的元基因组鸟枪数据，以及代谢特征、详细问卷和临床信息。基于队列，我们发现宿主遗传学对肠道微生物组有显著影响15确定了血液代谢物和肠道微生物组之间的58种因果关系16总共3432人。除了肠道微生物组相关研究外，我们还构建了一个高质量的口腔基因组目录17并进一步证实了宿主基因组对口腔微生物组的影响18通过将宏基因组数据与口腔基因组目录进行比对。值得注意的是，包括我们最近的论文在内的多项研究表明，性别特异性对肠道微生物组的影响。15肠道微生物组的性别差异主要由性激素驱动，19,20这反过来又导致了免疫力和疾病易感性的性别差异。7,21,22,23因此，基于我们之前良好的研究结果和性别证据解释了口腔微生物组分的变化，13,17,18我们旨在全面剖析4D-SZ队列中口腔微生物组、宿主性状（主要是血液代谢物，如性激素）的性别差异及其因果关系。
本文分析了4D-SZ队列中4478名个体（3504唾液和3694舌背）的全基因组和宏基因组鸟枪测序数据集，以及宿主因素（人体测量、饮食、牙周状况、常规血液测试、血清代谢组和其他元数据），研究性别对口腔微生物组分的影响(图S1; 研究概述面板）。我们首先确定了与口腔微生物组显著相关的性别特异性口腔微生物组和宿主主要因素。然后，我们进行了一项性别分层宏基因组-全基因组关联研究（M-GWAS）分析，以确定特定于性别的宿主遗传位点。利用性别分层M-GWAS鉴定的显著遗传变异作为工具变量，我们进一步采用孟德尔随机化（MR）分析来挖掘宿主因素（尤其是血清代谢物）与口腔微生物之间的性别特异性因果关系。据我们所知，本文首次使用M-GWAS和MR来研究性别对口腔微生物组的影响。本研究不仅为后续口腔微生物群性别特异性差异的机制研究提供了参考，也有助于根据性别制定针对微生物群的治疗干预措施。
结果
口腔微生物群在性别之间存在差异
4D-SZ（一个多组学队列）的口腔微生物种类概况15,16,17,18在深圳对3504份唾液和3694份舌背样本进行了测序，其中3165人同时具有这两种样本类型；表S1)根据与先前构建良好的高质量口腔基因组目录的比对，具有高度代表性的口腔微生物组，包括未培养菌株以及候选门辐射（CPR）的潜在寄生细菌。17在384个宿主特征（人体测量和血清代谢物等）中，性别是与口腔微生物组分相关的重要因素（PERMANOVA24试验，p=2×10−4唾液和舌背，表S2). 调整年龄、BMI、药物、补充剂和漱口频率后（参见STAR方法). 唾液和舌背样本共有903个性别差异SGB(表S3). 在唾液中，女性表现出更多S链球菌（20.028%，雌性/雄性富集的SGBs数量=266:13），普雷沃菌属（5.743%，女性：男性=60:20），以及颗粒链菌属（3.230%，女性：男性=37:8）。相比之下，男性唾液中的C含量更高弯曲杆菌A（9.045%，女性：男性=46:80），维洛内拉（5.096%，女性：男性=56:15），卟啉单胞菌属（2.799%，女性：男性=1:38），O细菌属（2.727%，女性：男性=1:37）(A和1B）。在舌背，一些属扩大了性别差异。值得注意的是，女性表现出更多的S链球菌（12.711%，女性：男性=146:34），兰斯菲尔德菌（7.768%，女性：男性=107:3），普雷沃菌属（6.850%，女性：男性=81:16），颗粒链菌属（3.531%，女性：男性=38:12），以及鲍扬塞尼亚（4.802%，女性：男性=59:9），男性舌背表现较多弯曲杆菌A（10.734%，女性：男性=60:92），卟啉单胞菌属（3.178%，女性：男性=0:45），C无细胞吞噬（2.966%，女性：男性=0:42），梭杆菌属（5.014%，女性：男性=1:70），以及原杆菌属（2.471%，女性：男性=6:29）(C和1D）。这些性别差异SGB对性别组显示出良好的鉴别效率，接收器操作特征曲线（ROC）下的平均面积（AUC）=0.878（95%置信区间[CI]:0.866-0.890；图S2)唾液和舌背样本的AUC分别为0.818（95%CI:0.804–0.833）。当拆分为发现和复制队列时(表S1)发现队列中确定的雄性和雌性之间差异丰富的物种也可以在独立复制队列中以相同甚至略高的精确度区分性别组（AUC；图S3和表S4)再次表明口腔微生物组在性别鉴别中的稳健性和关键作用。
口腔微生物群在性别之间存在差异
（A） 唾液微生物组的代表性性别特异性SGB的箱线图。前15名重要（按五倍随机森林性别分类法排名）女性或男性富含SGB，p<1×10−8（使用调整混杂因素进行GLM测试）。
（B） 唾液微生物组的雌性/雄性SGB数量增加。
（C） 舌背微生物组的代表性性别特异性SGB箱线图。前15名重要（按五倍随机森林性别分类法排名）女性或男性富含SGB，p<1×10−8（使用调整混杂因素进行GLM测试）。
（D） 舌背微生物群中女性/男性SGB数量增加。
与口腔微生物组相关的主要因素在性别之间存在差异
为了确定微生物组组成的影响因素，我们首先检查了每个因素解释的微生物组组成的变化。我们确定了158和129个宿主因子，包括宿主生理、生活方式和血液代谢物，它们分别与唾液微生物组和舌背显著相关（FDR<0.05）(表S2和图S4). 牙石（解释了1.3%的唾液微生物组成变异，1.24%的舌背变异）、牙龈出血频率（0.87%的唾液，0.3%的舌背变异）以及高脂肪和高糖饮食频率（0.88%的唾液，1.3%的舌背变异）是与口腔微生物组分相关的最重要因素(和表S2). 我们进一步利用多元线性回归研究了每个口腔微生物类群的相对丰度与每个宿主代谢性状之间的相关性。调整性别、年龄和其他混杂因素后（见STAR方法)，我们观察到宿主代谢特征与唾液和舌背微生物群之间分别存在3843和3963个显著相关性（FDR<0.05，表S5)作为前提条件，这表明在随后的MR分析中可能存在强烈的因果关系。
与口腔微生物组相关的宿主主要因素在性别之间存在差异
使用PERMANOVA测试（基于布雷距离，4999个排列）显示了与两性之间每个口腔生态位微生物组分相关的前52个宿主主要因素。根据方差解释（R2)从雌性的唾液中提取。酒吧中的星星代表了PERMANOVA测试中微生物组分的主要因素。**对于Benjamini-Hochberg（BH）显著性Q<0.01，*对于Q<0.05，+对于Q<0.1。三角图表示Q<0.001时女性和男性基于β-多样性的F统计数据之间的显著差异，方法是采用自举方法估计微生物群落中差异的离散度（方法）。在前52个宿主主因子中，27个主因子解释了微生物组分的性别差异很大，红色上三角表示雌性的相关性更强，而蓝色下三角表示雄性的相关性更强。
当按性别分层时，牙石解释了女性舌背微生物组成的差异大于男性；然而，牙龈出血频率和高脂肪高糖饮食频率解释了女性唾液微生物组成的较大差异(n个=2509）比男性(n个 = 1,955) (和表S6). 血尿素氮（BUN）是前10个因素之一（唾液为0.6%，舌头为0.8%），这解释了唾液和舌背样品中女性微生物组成的较大差异。进入口腔的尿素被细菌尿素酶水解成二氧化碳和氨。25BUN与血友病菌株和BUN与链球菌菌株支持链球菌25(表S5). 男性与女性相比，叶酸、甘油三酯、BMI、高脂血症、脂肪肝、空腹血糖和基础代谢率等因素的相关性更强(). 此外，女性特有因素（月经初潮年龄、月经周期、怀孕、哺乳、更年期；唾液0.1%-0.7%，舌头0.1%-1.2%）、饮食结构（唾液0.1%，舌头0.1%）和口腔生活方式（刷牙次数、使用牙线频率；唾液0.3%-0.4%，舌头0.2%-0.3%）都被发现是口腔微生物组的重要因素(图S4和表S6). 血清类固醇代谢物（醛固酮、孕酮、皮质酮、睾酮；唾液为0.1%–0.4%，舌头为0.1%-0.4%）和女性特有因子的生物标记物也很重要，将在MR分析中详细描述。
唾液和舌背样本都支持性别间β多样性指标的许多差异（40%）(和第5章A；表S6). 使用广义线性模型对这些数据进行了进一步分析(表S5). 该模型证实了代谢物与微生物群的性别二型关联。在男性和女性之间，与口腔微生物组关联性差异最大的代谢物是谷氨酸(图S5B） ●●●●。在计算寄主性状的性别差异时，雄性的谷氨酸平均浓度是雌性的1.39倍(表S7). 这些结果表明，通过宿主性状解释的β多样性方差来测量口腔微生物多样性的性别二型性。
人类和口腔微生物组的遗传联系包括和性染色体的联系
4D-SZ队列的性别组合M-GWAS分析确定了340和374个与舌背和唾液微生物组显著相关的独立基因座（p＜5×10−8)分别是。1817个与舌背微生物群相关的基因座和14个与唾液微生物群有关的基因座位于X染色体上(表S8). 例如，在舌背样本的M-GWAS中，属的丰度纤毛菌A与关联第44页该基因编码一种与小GTPase rab11相互作用的蛋白质。流感嗜血杆菌是引起哮喘的最常见病原体，26与附近的删除关联FAM9C（传真9C）据报道与哮喘相关的基因。27在M-GWAS唾液样本中，小维勒内拉与自身免疫性疾病类风湿关节炎（RA）有关2这在女性中更为普遍，与SMARCA1公司基因。
尽管样本量变小了，但按性别对个体进行分层可以减少异质性28,29并帮助从M-GWAS获取性别差异信号。唾液样本的性别分层M-GWAS确定327个男性特有的独立关联(表S9和A；p<5×10−8男性；女性p>0.05对性别差异 < 0.05; 定义为距离<1MB和r的独立位点2<0.1）和277个女性特有关联（p<5×10−8女性；男性和对性别差异<0.05）。除了涉及在低深度数据集中未发现的变量的关联外(表S1)242个男性特异性关联中的13个和216个女性特异性关联的14个可在同一性别中沿次要等位基因的相同方向复制（p<0.05）。rs1410336242在LOC105371703号基因(β女性的 = 0.22,对女性的 = 1.30 × 10−12与…相比β男性的 = −0.06,对男性的 = 0.08;对性别差异 = 1.68 × 10−9,A） 与属有关蛋形目观察到7种男性特有的关联对性别差异 < 5 × 10−8：rs142374260网址：LALBA-KANSL2具有F0040 uSGB 94; rs370266368，网址：L3MBTL4级具有1992年密螺旋体C uSGB; rs756149092，电话：UPF2-DHTKD1系列具有uSGB 2747号属于杆菌科；rs147250707，网址：阿克纳具有牙周梭杆菌C; rs11739353，电话：LOC101928651号具有CAG-793 uSGB 3551; rs1206782373，电话：DACH2号机组具有溶菌属.; 和rs74694053LOC105377143-KBTBD8具有uSGB 1945年属于心杆菌科。两者都有梭菌属口腔中的肉杆菌与结直肠癌（CRC）风险降低有关。17
性别分层M-GWAS识别口腔微生物组的性别特异信号
（A和B）性别分层M-GWAS确定唾液（A）和舌背（B）微生物组的性别特异性信号。男性特异性关联表示M-GWAS结果，p<5×10−8男性，但女性p>0.05对性别差异 < 0.05. 女性特异性关联代表M-GWAS结果，p<5×10−8女性，男性p>0.05，以及对性别差异 < 0.05. 性别差异最大的M-GWAS相关性（p<5×10−8一种性别中，但另一种性别的p>0.05，以及对性别差异<5 × 10−8)使用基因和相关微生物分类群列出，并用红线标记。灰色实线表示性别差异p截止值0.05，灰色虚线表示性别差别对5×10截止−8.
对于舌背，我们确定了339个男性特异性和269个女性特异性独立关联(表S9和B类；p<5×10−8在一个性别中，但在其他性别中p>0.05；对性别差异 < 0.05). 除了在低深度复制数据集中未发现的变异外，247（18/247）个可用的男性特异性关联中的18个和15/197个女性特异性关联可以在同性中的次要等位基因的相同方向上进行复制（p<0.05），显示出比唾液更强的复制能力。观察到三种男性特异性关联对性别差异 < 5 × 10−8但对于女性特有的关联则没有。他们的电话是192945350卢比KCNH5-RHOJ公司与关联F0040 uSGB 1289; chr10:99050952，网址：HPSE2型与关联嗜血杆菌D属.在RA患者中耗尽2; 和rs9532851RGCC-VWA8公司与关联鲍扬塞尼亚spp.，最近从放线菌属,30之前被认为是RA的高度预测性和CRC风险的降低。17
除了性别相关的11个顶级协会对性别差异 < 5 × 10−8，我们还研究了基于性别特异性基因座的性别特异性途径(表S10). 对于唾液微生物组，男性特异性相关SNP主要富集在KEGG或REACTOME数据库中的6条通路中（DAVID工具中p<0.05）。这些途径包括hsa00510:N-聚糖生物合成、hsa04514:细胞粘附分子（CAMs）、hsa01100:代谢途径（例如GO数据库中的碳水化合物代谢过程）、HSA 04015:Rap1信号途径、HSA 01230：氨基酸生物合成，以及R-HSA-205017:NFG和proNGF与p75NTR结合。这些结果支持了先前的发现，即雄性表现出更丰富的N-聚糖31并倾向于氧化更多的总碳水化合物32而不是女性。女性特异性相关SNPs富集途径包括R-HSA-167060:NGF（神经生长因子）处理、GO:0045596～细胞分化负调控和GO:0007507～心脏发育，表明心脏基因表达的性别特异性改变。33对于舌背微生物组，男性特异性相关SNP聚集成硫酸乙酰肝素/肝素-糖胺聚糖（HS-GAG）代谢相关通路，例如R-HSA-2024096：肝糖胺聚糖降解，R-HSA-2020 2928：肝糖苷聚糖生物合成，R-HSA-1971475：GAG合成需要四糖连接子序列，hsa04722：神经营养素信号通路。研究表明，脑源性神经营养因子的某些功能或作用机制以性别依赖的方式变化，并可能受到性激素的调节。34,35女性特异性相关SNP富集于6条通路，包括hsa04261：心肌细胞肾上腺素能信号通路、hsa04024：cAMP信号通路、hsa05032：吗啡成瘾、hsa05033：尼古丁成瘾、hsa04973：碳水化合物消化和吸收以及hsa04725：胆碱能突触。心肌细胞中的性别特异性肾上腺素能信号再次表明心脏功能存在性别二型性。33,36胆碱能突触传递在成人中也表现出性别二型性C类.雅致.37
MR确定口腔微生物组与宿主性状之间的因果关系
由于与口腔微生物组有很强的遗传联系，我们接下来进行了MR以确定宿主性状和口腔微生物之间的潜在因果关系。性别联合单样本MR分析分别确定了502和290个宿主性状与唾液或舌背微生物群之间的显著因果关系(表S11;邦费罗尼分别对3843和3963个宿主性状与唾液和舌背微生物群之间的显著相关性进行了校正（p<0.05）。在复制队列的MR分析中，85.5%（429/502）的宿主唾液微生物组和57.6%（167/290）的宿主口腔背微生物组的病死率被复制（p<0.05；表S11)，强化了这些因果关系。大多数死亡原因在于牙龈和牙石的出血频率，这与我们的上述发现一致，即它们解释了口腔微生物成分的大部分原因。我们的MR确定了牙周病原体在这两个利基中的因果影响，例如牙髓卟啉单胞菌(图S6;β=0.285，p=2.69×10−10唾液；β=0.266，p=1.13×10−11对于舌），中间普氏菌(β=0.196，p=1.04×10−6唾液；β=0.201，p=2.92×10−7对于舌），牙密螺旋体B(β=0.226，p=8.75×10−7唾液；β=0.211，p=1.14×10−7)、和核梭杆菌(β=0.168，p=1.21×10−3唾液；β=0.139，p=2.43×10−3对于舌头）对牙龈和牙石的出血频率的影响，并且相反的影响也是真实的。这些因果关系在复制数据集中得到了很好的复制(图S6). 此外，我们还发现了一些与心脏代谢相关的因素，如铬、，38肌酸，39胱氨酸，40和谷氨酸41与少数口腔微生物群的丰度有因果关系(表S11). 例如，铬(β=−0.158，p=4.25×10−6)，胱氨酸(β=−0.247，p=1.14×10−12)和胱硫醚(β=−0.252，p=3.50×10−10)与丰度呈负相关乳酸杆菌，而肌酸(β=0.327，p=1.52×10−13)和谷氨酸(β=0.345，p=2.46×10−17)与丰度呈正相关乳酸杆菌在唾液样本中，这表明人体循环代谢物对乳酸杆菌住在口腔里。这些因果推论与实验验证一致，即使用肠道可以降低血铬乳酸杆菌,42它直接催化L-胱氨酸生成L-半胱氨酸过硫化物和胱硫醚生成L-半月氨酸。43
性别分层单样本MR确定了唾液微生物组与宿主性状之间的62个男性特异性和45个女性特异性因果关系(A和4B；表S11)以及27个雄性和36个雌性特异性舌背微生物组与宿主性状之间的因果关系(C和4D；表S11). 这些特定性别的死亡人数在一个性别中是显著的(邦费罗尼调整后p<0.05），但其他组无显著性差异（p>0.05），且性别差异显著(对性别差异 < 0.05). 男性和女性的口腔卫生习惯和饮食表现出不同的效果。漱口水对无气杆状菌uSGB 1301和原杆菌属唾液中只有雄性，属于这两个属的物种与低尿酸测定器有关SLC2A9系列在我们最近的研究中。18漱口水与罗提亚sp001808955在男性中，与颗粒菌uSGB 3045女性舌背微生物组。牙龈出血频率对女性充血有负因果关系链球菌在女性中，利基和男性富集的积极因果效应聚集细菌. (A类.基里亚尼B和A类.塞格尼斯)男性舌背微生物组。相反，牙周病原体增加牙密螺旋体B,uSGB梭杆菌1916，F082系列，普雷沃氏菌uSGB 2526,F0422 uSGB 2370、和溶菌uSGB 1551所有这些都导致牙龈出血频率增加，但增加了梭杆菌uSGB 2180导致牙龈出血频率降低。高脂肪和高糖饮食与低脂肪真菌uSGB 1015男性在口腔生态位中的丰度和低丰度麻疹孪生球菌和原杆菌uSGB 1591女性舌背微生物组。增加Gemella massiliensis kSGB梅西拉菌238与牙石风险增加有关。
确定口腔微生物组的性别分层MR结果
（A–D）左侧面板分别显示了宿主表型特征（血清代谢物等）对唾液（A）和舌背微生物群（C）的因果影响。右侧面板分别显示了唾液（B）和舌背微生物群（D）对宿主表型性状（血清代谢物等）的因果影响。标有“**”的单元格表示小于0.01的性别差异p值，而“*”表示小于0.05的性别差异p值。每个部分分为两组，分别代表雄性（蓝色）或雌性（橙色）的显著MR结果。
作为基本代谢调节剂的血清氨基酸也显示出与口腔微生物组之间丰富的性别特异性因果关系(). 肌肽增加，标志着骨骼肌的性二型性，男性明显高于女性，44与减少有关牙周梭杆菌C唾液中的含量和链球菌.（主要是S公司.mitis和S.假肺炎O)舌背，仅限男性(图S7). 胱硫醚对梭杆菌雄性舌背丰富。反过来，梭杆菌.例如牙周梭杆菌C与男性唾液中较低的胱硫醚水平显著相关，这表明与之前文献中的发现相结合，两者之间的负相关是相互的45,46那个梭杆菌可有效利用胱硫醚生产硫化氢（H2S），这是一种有毒的恶臭气体。然而，TM7x uSGB 3001对女性舌背胱硫醚有正因果关系。在研究宏基因组学功能模块时47与胱硫醚有关，我们发现{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“K01739”，“term_id”：“194076”，“term_text”：“KW1739”}}K01739号：胱硫醚γ-合成酶（metB:2.5.1.48）和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“K01758”，“term_id”：“163263”，“term_text”：“K10758”}}K01758号：胱硫醚γ-裂解酶（CTH:4.4.1.1）在胱硫苷相关属中富集梭杆菌属(图S8). 谷氨酸增加与奈瑟菌科.,Ottowia uSGB 2417号、和艾克奈拉但增加了F0422基于SGB 1710（维氏菌科）存在于雌性唾液中。谷氨酸的增加也对低丰度的TM7x uSGB 1196和Lachnoanaerobaculum sp000287675但与普雷沃氏菌uSGB 34我们发现谷胱甘肽相关模块（如鸟氨酸生物合成、脯氨酸生物合成，血红素生物合成和谷胱甘苷生物合成）在奈瑟菌科,奥托维亚,艾克奈拉,Lachnoanaerobaculum sp000287675、和Prevotella uSGB 34型基因组。胱氨酸对属有积极的因果效应Pauljensenia种.例如Pauljensenia sp000278725唾液中，但对卟啉单胞菌uSGB 3273舌背仅适用于男性。胱氨酸相关模块（如半胱氨酸生物合成、蛋氨酸回收、蛋氨酸生物合成和蛋氨酸降解）也在鲍扬塞尼亚和卟啉单胞菌uSGB 3273(图S8). 增加uSGB梭杆菌2817,假单胞菌uSGB 3325、和CAG−793 uSGB 3551与α-氨基己二酸水平较低有关，α-氨基己二酸被发现是糖尿病风险的标志，48自身免疫和人类胶原蛋白的年龄相关性变化。49,50
性激素也显示出性别特定的因果关系丰富。该队列中女性醛固酮水平高于男性的激素醛固酮(A和表S7)在两个生态位中，女性的死亡人数都显著增加，女性有139人死亡（p<0.01），而男性有52人死亡（p<0.05）(B类；χ2检验，p=7.39×10−14)女性有139例显著的舌背死亡，男性有52例显著的舌背死亡（p<2.2×10−16). 例如，醛固酮对女性口腔微生物群有因果影响，如降低F0040单件两个利基市场都很丰富。然而，物种副血链球菌B,溶菌uSGB 1570、和非典型韦氏杆菌所有这些因素对女性舌背样本中的血清醛固酮有积极的因果影响(C） ●●●●。在进一步研究其他性激素时，我们发现女性体内的可的松和脱氢表雄酮水平高于男性(表S7)，两者都显示出女性舌背的显著死因富集（分别为p=0.03和p=0.002）。一直以来，雄烯二酮是几种“男性”性激素中的一种，作为雄激素，雄烯二酮在男性舌背中表现出因果关系丰富（p=1.17×10−3). 雄甾烯二酮与该属的丰度在遗传上呈正相关鲍扬塞尼亚（重命名自放线菌属)及其物种，如P（P）.溶纤维素菌和P（P）.溶牙菌此外，它的另外两个物种，Pauljensenia uSGB 1578号和uSGB 682型与雄烯二酮呈交互正相关。雄烯二酮和鲍扬塞尼亚舌背仅存在于男性，但不存在于女性(对性别差异<0.05;D） ●●●●。上述发现表明，性别特异性微生物与激素的相互作用解释了口腔微生物组成和血清激素中观察到的主要性别特异性差异。
性别特异性微生物与激素的相互作用解释了观察到的血清激素的性别特异性差异
（A） Barplot显示了男性和女性性激素水平的比较，并观察到显著的性别差异（详见表S7). 采用X平方检验，并标记p值。
（B） 几种性激素在特定性别中表现出与口腔微生物群一致的MR富集。酒吧的长度代表了男性和女性分别计算的与特定性激素相关的所有死亡人数中重大死亡人数的比例（p<0.01）。
（C） 森林样地显示雄烯二酮（雄性含量高于雌性）与属的丰度呈遗传正相关鲍扬塞尼亚唾液样本中其种类在雄性中，但在雌性中不存在（雄性p<0.01；雌性p>0.05；以及对性别差异<0.05). 图中显示了MR估计值和95%CI值。列出了男性和女性MR分析的相应p值及其比较的T统计值。
（D） 森林图显示醛固酮（女性高于男性）与唾液样本中女性的几种口腔细菌丰度有因果关系，但男性没有因果关系（女性p<0.01；男性p>0.05；以及对性别差异<0.05). 图中显示了MR估计值和95%CI值。列出了男性和女性MR分析的相应p值及其比较的T统计值。
此外，微量元素铬与男性富集呈正相关弯曲杆菌A在雄性舌背，硒对粘滑罗斯菌女性舌背。气动芽孢杆菌uSGB 728在我们的M-GWAS研究中，与低尿酸测定仪SLC2A9相关联的维生素B1水平较低具有因果关系。密螺旋体D uSGB 79与低硒水平有关。之前的研究报告密螺旋体表现出对硒的生长依赖性。51
Gemella uSGB 2990型与血铅水平有因果关系。
MR推断口腔微生物组与疾病之间的因果关系
我们通过使用该队列中的口腔微生物组GWAS汇总数据以及日本生物银行的疾病GWAS汇总统计数据进行两样本MR分析，推断口腔微生物组与疾病之间的因果关系。52MR分析确定了口腔微生物群与疾病之间的大量因果关系(表S12). 两者都有溶牙鲍氏菌（也称为溶牙放线菌)C组和B组（p=6.49×10−7p=3.90×10−4唾液）与2型糖尿病（T2D）风险增加有因果关系。脑膜炎奈瑟菌是脑膜炎球菌病的主要病因，53其在舌背的相对丰度与心律失常风险增加有关（p=4.44×10−6). 此外，我们还发现唾液和舌背微生物组共有97例疾病死亡(表S12). 值得注意的是罗戈萨微球菌哮喘是相互的罗戈萨微球菌降低哮喘风险，哮喘与低丰度罗戈萨微球菌.增加了牙周梭杆菌C,冠状链球菌B,化脓性鲍氏菌、和Pauljensenia uSGB保罗杰森尼亚uSGB 2911与T2D风险增加有因果关系。丰度下降1992年密螺旋体C uSGB与T2D风险增加有因果关系。这些结果与之前的发现一致54口腔微生物组链球菌和梭杆菌属丰度较高，但密螺旋体与对照个体相比，T2D患者的丰度较低。4D-SZ队列的验证结果，两个物种，来自雄性富集弯曲杆菌A(uSGB 1156和uSGB 3418)增加了心律失常的风险。一贯地，弯曲杆菌A uSGB 2510和弯曲杆菌A uSGB 2316充血性心力衰竭和缺血性中风的风险分别增加。这些证实了弯曲杆菌A种与之前报道的心血管疾病有关。55
MR还显示了口腔微生物组与疾病之间的性别特异性因果关系(表S13).牙周梭杆菌C根据我们的上述MR分析，肌肽和胱硫醚对男性的病因有负面影响，与女性外周动脉疾病风险增加有关（p=1.19×10−3;A） ●●●●。三个分类群，罗戈萨微球菌,鼻窦原杆菌、和纤毛菌A sp001274535在观察性研究中，女性的丰度均高于男性，这分别与慢性阻塞性肺病、结直肠癌和心律失常的风险降低有关，但只有女性存在这种因果关系(A） ●●●●。癫痫对兰斯菲尔德菌例如兰斯菲尔德菌属sp000564995在舌头和唾液中，这只存在于女性而不存在于男性。此外，癫痫与以下疾病的uSGB丰度增加有关：梭菌属,卡通纳,维洛内拉、和TM7倍但周星科的uSGB丰度下降，杰梅拉牌手表、和D型嗜血杆菌脑动脉瘤在女性中更为常见，对脑动脉瘤的丰度下降有显著的因果影响链球菌物种，如S公司.口腔,S公司.澳大利亚、和S公司.米提斯在女性舌背中，与链球菌及其物种，如S公司.口腔,S公司.克里斯塔特斯、和S公司.sp001553685型雄性唾液中(B） ●●●●。这些结果有助于了解特定的口腔微生物群在心脏代谢疾病和某些癌症的性二型性中是否起到因果作用。
口腔微生物组与疾病之间的性别特异性因果关系
（A） 森林样地代表了四种唾液细菌对女性疾病的显著因果影响，这四种细菌在女性中比男性更普遍。显示了MR估计值和95%CI值。
（B） 森林图分别代表了男性和女性脑动脉瘤对唾液微生物群因果影响的MR估计值和95%CI值。P_obs_diff表示观测分析中两性相对丰度的差异显著性（详见表S3). P_MR_diff表示MR估计值在性别之间的差异显著性（详见表S13). P_male和P_female分别代表MR推断的男性和女性死亡人数的显著性。
讨论
在本研究中，我们生成了一个完整的资源数据库，包括丰富的性别组合和性别特异性观察相关性，以及口腔微生物组与宿主因子（主要是血液代谢物）之间的进一步因果关系。我们强调，在调查宿主遗传变异和其他主要因素对口腔微生物组组成的贡献时，性别分层是必要的，这与日益增多的性别分层遗传关联研究一致。29,56,57,58,59我们在此总结了几个关键发现。我们首先观察到口腔微生物组具有性别二型性，决定口腔微生物组组成的主要因素在性别之间存在差异。通过对发现队列中的2984名个体进行单样本双向磁共振成像，并在1494名个体的独立队列中进行复制，我们确定了与口腔微生物群相关的性别特异性遗传位点，并进一步发现口腔微生物群和血清代谢物之间存在丰富的性别差异因果关系。性别二形性核磁共振分析发现，男性肌肽和胱硫醚的增加与肿瘤细胞的丰度降低有关牙周梭杆菌C然后在疾病MR分析中发现其对T2D有因果影响。雄甾烯二酮作为雄激素在男性舌背中显示出显著的MR富集。同样，女性醛固酮水平较高的女性在这两个利基中表现出显著的MR富集。这些结果与男女性激素水平差异开始的事实一致子宫内并在生物体的整个生命周期中持续存在。60总的来说，这一宝贵的资源提供了潜在的微生物-代谢物偶然关系，为机理和临床研究奠定了性别差异的基础。未来的研究预计将在更多样本和人群中复制致病性，并使用无菌小鼠和参考菌株调查潜在机制。
通过应用此MR分析来探索因果关系，我们的结果进一步支持了先前报道的几种微生物群-代谢物关系。例如，四个分类群，核梭杆菌,中间普氏菌,牙密螺旋体、和牙髓卟啉单胞菌已被广泛报道与牙周炎相关。61,62,63我们的数据驱动的MR证实，这两个生态位中的这四个分类群是牙周炎问题的原因，如牙龈出血频率和牙石(图S6). 此外，在我们的疾病MR分析中，这四个分类群还显示了对多种疾病的因果影响（p<0.05）：唾液中的中间普氏菌十几种疾病的遗传风险增加，包括CRC、T2D、缺血性中风、慢性阻塞性肺病和肝细胞癌；牙髓卟啉单胞菌唾液中肾病综合征和心律失常的遗传风险增加；牙密螺旋体B唾液增加了肺癌和子宫内膜异位症的风险；和核梭杆菌在舌中，肺癌和食管癌的遗传风险增加。这些证据表明，牙周病原体可导致牙龈慢性炎症，甚至通过诱发局部炎症和加剧胰岛素抵抗而导致疾病，64,65与之前的研究结果一致，慢性牙周炎与糖尿病等全身性疾病有关，66心血管疾病，67和某些癌症。68此外，针对特定牙周病原体（例如P（P）.中间层和P（P）.牙髓)可能有助于改善特定的牙周炎相关的并发症，如T2D和心律失常。牙线也是减少牙周病原体丰度的简单方法。我们观察到使用牙线的频率确实与牙周病原体呈负相关中间普氏菌(β=−0.199，p=6.07×10−6唾液）在MR分析和牙髓卟啉单胞菌和牙密螺旋体B在观察分析中。
雄甾烯二酮与属的丰度呈遗传正相关鲍扬塞尼亚物种，如P（P）.溶牙菌在我们代谢物的MR分析中。溶牙鲍氏菌与疾病MR分析中T2D风险增加有关。这表明性激素通过与微生物群的相互作用改变微生物群落，并可能调节自身免疫性疾病的命运，这些微生物群不仅限于肠道，而且还存在性别二型性。7,20口腔和肠道微生物失调对自身免疫性疾病的影响越来越受到重视，69包括先前MR研究所说明的因果关系。70,71两者都有副唾液链球菌B和维洛内拉（V.显示,V（V）.小甲虫)在观察分析中与甘油三酯和高脂血症呈正相关（p＜1×10−8)支持口腔微生物组与心血管疾病之间的联系，也观察到肠道微生物组与心脏疾病之间的关联。72
副唾液链球菌B与漱口频率呈正相关（p＜2.48×10−5)高脂高糖饮食（p<6.52×10−13)睡眠时间超过午夜（p<3.30×10−7) (表S5)这表明，生活方式的健康管理者可能会降低该分类单元的丰度，以降低心血管疾病风险，而不是漱口。72MR进一步透露副唾液链球菌B对女性舌背样本中的血清醛固酮有积极的因果关系(C、 p<6.12×10−6)高醛固酮与高血压、充血性心力衰竭、冠心病、慢性肾脏病和代谢综合征的发展和严重程度相关。73这些对宿主微生物-代谢物相互作用及其在疾病中的作用的因果理解可能有助于转化为微生物靶向治疗干预的未来发展。
总之，我们的工作为口腔微生物组和血液代谢物之间的潜在相互作用提供了证据，并对疾病有潜在影响。我们的结果还呼吁有必要考虑对性别敏感的分析，以便在未来的研究中阐明可能的性别特异性微生物-代谢物相互作用机制。
研究的局限性
我们目前的研究有两个局限性。首先，我们根据两个最常用的标准将3589个SGB定义为“物种级”74,75,76：i）至少95%的平均核苷酸一致性（ANI）和ii）对齐的宏基因组组装基因组（MAG）至少30%的重叠。这可能有点不准确，因为可以将两个或多个SGB注释为同一个最具代表性的物种。尽管如此，我们并不排除它们来自不同物种，但不是亚种（通常定义为≥95%ANI77,78)尤其是那些在人群中表现出低丰度相关性和负β效应的人群。有16.7%（占3589个SGB总数的598个）的SGB可以注释为相同的代表物种，这不会显著减少分析的类群数量。在注释为同一代表物种的1395对SGB中，485对（35%）的相关性较差（spearman r<0.6），特别是对于一些罗戈萨微球菌新加坡银行（编号：2362；3333；1190；3494）。两者均呈负相关（spearman r<0）；对于聚集细菌sp000466335SGB和Pauljensenia sp000278725SGB，表明对同一物种的分类注释可能不准确。结合这些列出的事实，我们认为SGB级别显示出更好的分辨率，并避免通过直接加总其丰度将不同的SGB合并到同一物种id中，但“物种级别”的准确分类值得进一步研究。我们希望在未来利用日益发展的宏基因组技术、工具和管道实现更高质量的组装、装箱和分配/分类结果。其次，为了降低相关性、关联性和因果关系的复杂性，我们使用贪婪算法来获得核心分类群的最小集(表S14). 正如许多相关研究所做的那样，我们过滤了高度相关的细菌，只保留了所有高度相关细菌中最具代表性的一个，以减少GWAS测试的数量。70,79,80,81然而，过滤出来的细菌可能在生物学上更有意义。识别控制微生物群落中生态网络的驱动物种可能有助于更容易地解释。我们也希望未来将微生物功能网络作为研究目标，而不仅仅局限于微生物类群。
STAR★方法
实验模型和主题细节
研究对象
如前所述，4D-SZ队列中的所有中国成年个体均被招募用于多组学研究。15,16,17,18目前，这项研究共包括4478名个体，其中3504人有唾液样本，3694人有舌背样本（3165人有两种样本类型），用于全基因组测序(表S1). 该队列可分为两个独立的部分，即发现和复制。在发现队列中，深圳市2984名患者的血液样本被纳入高深度全基因组测序（平均深度为33X），其中2017名患者的舌背，1915名患者的唾液样本被纳入全元基因组测序。在复制队列中，从1494名进行了低深度全基因组测序（平均深度为9X）的个体中采集了血液样本，其中1333人有舌背样本，1299人有唾液样本进行了宏基因组测序(表S1). 复制队列以相同的方式设计，但在中国多个城市（武汉、青岛等）以较小的规模组织。血液和口腔采集的方案，以及整个基因组和宏基因组测序，与我们之前的文献类似。15,16,17,18根据制造商的协议，使用MagPure Buffy Coat DNA Midi KF试剂盒（编号D3537-02）提取血样的DNA。使用MGIEasy试剂盒收集舌背和唾液样本。对于唾液样品，使用2倍浓度的稳定试剂盒，收集2 mL唾液。使用MagPure粪便DNA KF试剂盒B（编号MD5115-02B）提取口腔样本的DNA。血液和口腔样本的DNA浓度由Qubit（Invitrogen）估算。来自血液和口腔样本的500 ng输入DNA用于文库制备，然后使用BGISEQ-500平台进行配对100 bp测序。82
该研究得到了BGI-Shenzhen机构审查委员会（IRB）的批准，所有参与者在入学时都提供了书面知情同意书。
方法详细信息
全基因组测序和质量控制
在发现队列中，2984名有血液样本的个体被测序，整个基因组的平均值为33倍。为了进行复制，对1494个个体进行了全基因组平均9倍的测序。包括纳入和排除标准在内的完整研究设计在其他地方进行了描述。18简言之，在进行变异和样本质量控制后，发现队列中有2984名个体（其中2017人的舌背匹配，1915人的唾液样本匹配）和1000万个常见和低频（MAF≥0.5%）变异被留作M-GWAS和MR分析。复制队列中1494名个体（其中1333名具有匹配的舌背，1299名具有匹配唾液样本）和860万常见和低频变异（MAF≥0.5%），被留作M-GWAS和MR发现结果的验证分析。
口腔微生物组的性别差异/比较
在调整潜在混杂因素（年龄、性别、BMI、药物、漱口频率以及是否患有呼吸道感染疾病）后，使用广义线性模型（R中的“glm”函数）比较每个SGB或每个宿主因子（主要是代谢参数）的性别差异。报告了Benjamini–Hochberg调整后p<0.05的结果。
使用R中randomForest软件包中改进的RFCV分类器功能评估基于口腔微生物组的性别分类性能。这是根据不同数量的SGB（1、3、7、14、28、56、112、223、446、892、1784、3569）进行分类的。唾液中223个SGB和舌背中112个SGB达到了最佳ROC。ROC用R中的pROC包绘制。
与口腔微生物组有关的主要因素
利用PERMANOVA确定微生物群组成和宿主代谢性状之间的联系24分析（adonis测试，基于SGB-level Bray–Curtis差异，4999个排列）。为了消除潜在的混杂影响，PERMANOVA回归模型中包括了年龄、性别、BMI、药物、漱口频率和呼吸道感染疾病。为了测试代谢参数的基于β-多样性的F统计数据测量的性别偏见指标，如前所述，使用自举方法评估微生物群落差异的分散性。83更具体地说，我们通过对每个性别的样本重采样25次来引导F统计值。对于所有分析，进行了Mann-Whitney U检验，以比较男性队列和女性队列的自举F统计，然后应用Benjamini-Hochberg错误发现率校正。
口腔微生物特征的性别分层GWAS分析
如前所述，18我们对细菌进行了过滤，使其出现率保持在90%以上，平均相对丰度保持在1×10以上−5（这些微生物类群的代表属占整个群落的99.63%（舌背）和99.76%（唾液））。由于许多口腔微生物分类群具有高度相关性，我们进行了许多Spearman相关性测试，并且只保留了一个相关系数大于0.8的细菌对。Spearman相关性是在所有分类群之间成对计算的，并且相关性用于生成邻接矩阵，其中相关性>0.8表示分类群之间的边缘。然后使用该矩阵的图形表示贪婪地选择代表性分类群。节点（微生物群分类群）按等级排序，然后选择等级最高的节点作为最终分类单元（如果是并列的，则随机选择）。然后将该分类单元及其连接的节点从网络中移除，并重复该过程，直到找到最终的分类单元集，使得每个被丢弃的分类单元与至少一个分类单元相关联。这种过滤产生了1583个和1685个分别用于舌背和唾液的独立微生物分类群，用于关联分析。这些剩余的独立分类群及其高度相关的分类群列于表S14.
我们分别对男性和女性进行了性别特异性GWAS分析。为了测试宿主基因和口腔细菌之间的联系，我们通过PLINK v1.9使用了一个线性模型84基于口腔细菌的相对丰度。具体而言，相对丰度通过自然对数进行转换，其性能优于CLR转换(图S9). 剔除了偏离平均值超过四个标准差的异常个体，以便将细菌丰度视为一个数量性状。考虑到饮食和生活方式等环境因素对微生物特征的影响，我们纳入了与β多样性显著相关的所有潜在联合创始人（Benjamini–Hochberg FDR<0.05）解释方差分析中的估计值，以及作为M-GWAS分析协变量的前四个主成分（PC）。
男性特异性变异被确定为（i）与男性分类群显著相关（p男性的 < 5 × 10−8)在女性中不显著（p女性的>0.05），和（ii）具有名义上的显著性别差异（测试β值估计的性别特异效应大小差异的p值，p差异 < 0.05). 女性特异性变异被确定为（i）与女性分类群显著相关（p女性的 < 5 × 10−8)在男性中不显著（p男性的>0.05），和（ii）有显著的性别差异（p差异<0.05，如下所述）。对于每个变体和表型（分类群的相对丰度），我们计算了p值（p差异)男性特异性和女性特异性β估计值差异的检验和使用t统计量
具有和是的标准错误或性别特异性β估计值之间的相关性计算为每个表型所有变异的Spearman秩相关系数。
寄主性状的GWAS分析
对于每个寄主表型性状（人体测量学、饮食、代谢性状等），如果是连续数据，则将中值正常值的log10-变换用作PLINK中实现的线性模型中的数量性状。如果宿主性状（牙龈出血频率，是否患有牙石等）是离散数据，则在关联分析的逻辑模型中将其视为二元性状。对于数量性状，缺失值和平均值超过4 s.d.的样本被排除在关联分析之外。在发现数据集中确定的1000万个常见和低频变体以及在复制数据集确定的860万个常用和低频变体中的每一个都进行了独立的关联分析测试。年龄、性别和前四名PC作为协变量被纳入。同样，对男性和女性分别进行性别分层GWAS分析。
性别特异重要基因座的功能分析
使用ANNOVAR将关联分析中确定的重要遗传变异映射到基因。85鉴于一些重要的遗传变异在M-GWAS结果中频率较低，因此最适合输入基因列表进行富集分析。我们根据20kb窗口内的物理距离将变体映射到基因，并获得用于富集分析的基因列表。戴维(网址：https://david.ncifcrf.gov/)用于进行功能和途径富集分析。DAVID是一种用于分析基因列表相关生物注释的系统集成功能注释工具，并提供GO富集和KEGG通路分析的功能解释。86p值<0.05被认为具有统计学意义。此外，在FUMA中使用GENE2FUNC程序对定位基因进行了进一步研究(http://fuma.ctglab.nl/)它为53个GTEx组织特异性基因表达集、7246个MSigDB基因集和2195个GWAS目录基因集中的丰富映射基因列表提供了超几何测试。87使用GENE2FUNC程序，我们检查了在GWAS目录中定位的基因是否在特定疾病或性状中富集，以及是否表现出组织特异性表达。如果观察到错误发现率（FDR）校正后p<0.05，则选择显著结果。
独立工具变量（IV）选择
对于微生物特征和寄主表型特征（主要是代谢特征）的每个全基因组关联结果，我们选择了在p<1×10时显示关联的遗传变异−5然后以LD r为阈值进行连锁不平衡（LD）估计2<0.1用于聚类分析，以获得作为IV的独立遗传变异。p值阈值为1×10−5通过最大化遗传工具的强度和独立样本中遗传预测因子解释的平均遗传变异量，用于选择与微生物特征相关的遗传IV。对于每个微生物特征，我们在发现数据集中使用不同的基因工具对阈值，包括5×10−8, 1 × 10−7, 1 × 10−6,和1×10−5。我们测试了这些仪器在不同条件下的强度P（P）通过检查它们是否预测了独立样本中相应的微生物特征来确定阈值(图S10)，我们观察到仪器F统计的平均值为3.57，当使用5×10时，微生物特征仪器平均只能解释0.28%的表型变异−8因此，我们使用了一个更宽松的阈值p<1×10−5选择用于微生物特征的仪器，仪器平均F统计值达到22（舌背微生物群）和18（唾液微生物群），这表明仪器很强大。为了一致性，我们在发现队列和复制队列中使用相同的阈值和程序来选择代谢性状的遗传IV。分别在发现队列和复制队列的相应样本中计算变异体之间的LD估计。
单样本MR分析
为了研究这个多组学队列中微生物特征和宿主表型特征之间的因果关系，我们首先在发现数据集中进行了一个单样本双向MR分析。如上所述，我们指定了p<1×10的阈值−5选择SNP仪器和LD r阈值2<0.1用于聚类分析，以获得独立的遗传变异作为MR分析的IVs。然后，使用GWAS数据中的独立遗传变异计算每个个体的未加权多基因风险评分（PRS）。每个SNP被记录为0、1和2，这取决于个体携带的特异性风险增加等位基因的数量。我们采用两阶段最小二乘回归（TSLS）方法进行仪器变量（IV）分析。88在第一阶段，对于每个暴露特征，使用线性回归模型评估GRS和观察表型值之间的关联，并获得基于该仪器的预测拟合值。在第二阶段，对第一阶段的结果特征和遗传预测暴露水平进行线性回归。在这两个阶段，分析都根据年龄、性别和人口结构的前四个主要组成部分进行了调整。对于每个性状，使用R中AER包中的“ivreg”命令执行TSLS。接下来，我们尝试在复制数据集中复制性状之间的因果关系。当按性别分层时，我们对男性和女性分别进行了与上述相同的MR分析，但没有对性别进行调整。
日本生物库疾病的两样本MR分析
为了研究微生物特征与疾病之间的因果关系，我们使用来自我们队列的口腔微生物群汇总统计数据和来自日本生物银行的疾病信息进行了双样本双向MR分析。我们从日本生物银行下载了42种疾病的性别组合和性别分层汇总统计数据52(http://jenger.riken.jp/en/result). 对疾病表型进行了性别联合和性别分层MR检查。采用GCTA-GSMR（基于孟德尔随机化的综合汇总数据）方法进行双样本双向MR分析89使用HEIDI-outlier分析去除水平多效性SNP。为了保持一致性，p<1×10的遗传变异−5和LD r2<0.1被选为我们队列中口腔微生物群的工具变量。对于疾病暴露，SNP仪器是在全基因组显著阈值（p<5×10）下选择的−8)在日本生物银行的研究中。
量化和统计分析
使用广义线性模型（R中的“glm”函数）比较每个SGB或每个宿主因子的性别差异。使用R中randomForest软件包中改进的RFCV分类器功能评估基于口腔微生物组的性别分类性能。利用PERMANOVA确定微生物群组成和宿主代谢性状之间的联系24分析（adonis测试，基于SGB-level Bray–Curtis差异，4999个排列）。在统计分析中，报告了Benjamini–Hochberg调整后p<0.05的结果。采用Spearman相关检验筛选高度相关的分类群。根据口腔细菌的相对丰度，使用线性模型进行M-GWAS分析。TSLS模型（来自R中AER包的“vreg”）用于进行单样本MR分析。采用GCTA-GSMR方法进行双样本双向MR分析。
致谢
我们衷心感谢中国国家基因库的支持。我们感谢所有志愿者花时间用我们的试剂盒自行收集口腔样本。我们感谢国家自然科学基金（No.32200548）的支持。
作者贡献
H.J.和T.Z.构思并组织了这项研究。J.W.发起了整个卫生项目。X.X.、H.Y.、X.J.、Y.H.、Y.Zong和W.L.对队列组织、样本收集和问卷收集做出了贡献。H.Lu负责DNA提取和测序。X.L.和X.T.处理了全基因组数据。Z.J.、J.Z.、L.T.、Q.S.、Y.J.和L.Z.处理了宏基因组数据。Z.J.对口腔微生物组进行了性别差异分析。X.L.和X.T.进行了性别分层M-GWAS和MR分析。X.L.和H.J.写了手稿。所有作者都对这份手稿中的数据和文本作出了贡献。
补充信息
表S2.使用PERMANOVA试验解释的每个宿主因子的唾液（舌背）微生物组成（β多样性），与图2和S4相关：
表S3唾液（舌背）微生物群显示出显著的性别差异（Q值<0.05），与图1相关：
表S4.由唾液（舌背）样本中性别组的最佳分类器选择的受歧视SGB，与图1和S3相关：
表S5宿主性状（代谢物、饮食等）与唾液（舌背）微生物组特征之间的显著相关性（FDR调整后P<0.05），与图2和S5相关：
表S6.根据性别分层时，由宿主因素解释的唾液（舌背）微生物组成（β分析），与图2、图S4和图S5相关：
表S7。宿主因素显示出较大的性别差异（F统计），与图5相关：
表S8.性别组合M-GWAS分析确定了X染色体上与唾液（舌背）微生物群相关的14个位点，与图3相关：
表S9：发现队列中遗传变异与唾液（舌背）分类群之间的性别特异性关联（男性为5×10-8，女性为P>0.05，Psex差异<0.05）及其在复制队列中的验证，与图3相关：
表S10：与图3相关的性别特异性相关SNP与唾液（舌背）微生物组的功能富集结果：
表S11.单样本BMR确定了唾液（舌背）微生物组特征和宿主特征（代谢物、饮食等）之间的因果关系数量，与图4和S6相关：
表S12 MR推断的与STAR方法相关的口腔微生物组与疾病的因果关系：
表S13唾液（舌背）微生物组与MR推断疾病的性别特异性因果关系，与图6相关：
表S14.进入唾液（舌背）M-GWAS分析的独立分类群（r<0.8）数量及其高度相关分类群，与图3相关：
数据和代码可用性
所有统计结果都可以在补充表格CNGBdb公开了宿主遗传学和舌背微生物组、宿主遗传学和唾液微生物组之间的联系的汇总统计数据：https://db.cngb.org/search/project/CNP0001664这些汇总统计数据的发布得到了中国科学技术部的批准（项目编号：2021BAT1539）。根据中国人类遗传资源管理局（Human Genetic Resources Administration of China）和BGI-Shenzhen机构审查委员会（institutional review board of BGI-Shen）关于保护个人隐私的规定，测序数据是受控访问的，可通过申请获得。
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