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iScience。2023年1月20日；26(1): 105825.
2022年12月17日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.isci.2022.105825
预防性维修识别码：PMC9830223型
PMID：36636351

转录组和代谢组的综合分析揭示了母猪发情至哺乳期的生物学基础

史立军,1,∗ 李慧慧,1 黄晓宇,1 泽书,1 李静娜,1 王立刚（Ligang Wang）,1 华艳,1和王立贤1,2,∗∗
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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数据可用性声明

总结

母猪妊娠发育的分子机制研究对于猪育种性状的遗传改良具有重要意义，也为人类妊娠疾病的生物医学研究提供了资源。然而，母猪妊娠多个发育阶段的转录组和代谢组仍然缺乏。在这项研究中，我们获得了从发情期到哺乳期六个发育阶段猪血的84个不同的RNA序列和42个代谢组数据集。我们确认了猪和人的初始序列和外显子结构特征、阶段特异性分子、分子的表达或积累模式、转录组和代谢组的调控机制以及重要的妊娠相关代谢物。综上所述，我们提出了母猪发情至哺乳期间RNA和代谢产物的关键差异，并提出了关键标记。这些数据结果有望为猪育种和人类妊娠疾病的生物医学研究提供必要的资源。

主题领域：发育生物学、胚胎学、Omics、代谢组学、转录组学

集锦

  • •
    猪转录组和代谢组从发情期到哺乳期的景观
  • •
    阶段特异性PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物
  • •
    发育阶段代谢组和转录组的综合分析
  • •
    人和猪妊娠关键代谢产物标记物

发育生物学；胚胎学；Omics公司；代谢组学；转录组学；

介绍

使用动物模型验证药物和更好地了解疾病的发展是有帮助的。利用猪作为神经、心血管和代谢问题的模型进行了深入研究。1动物的生殖特征具有经济意义，并且在很大程度上具有性别特异性。2许多导致生殖性状表型的关键事件发生在妊娠期和哺乳期。在怀孕母猪的一生中，每天都不一样，每天都是小猪成长的标志。孕妇的内分泌状况和营养状况对成功建立和维持妊娠至关重要。三怀孕期间的新陈代谢是一个动态的、精心计划的过程，如果它失败了，会对母亲和胎儿产生灾难性的影响。4母猪在生下一窝小猪之前，要经历大约三个月、三个星期和三天的妊娠期。猪妊娠的建立和维持十分复杂，取决于母猪的胚胎和子宫内膜的有效沟通，其中，母猪从发情到哺乳的阶段通常分为八个阶段，包括第0-9天（发情期和交配期）、第10-35天（着床期）、，第36-110天（胚胎期）、第111-114天（分娩前最后几天）、产后0-7天（哺乳初期）、产后8-20天（哺乳中期）和产后21天（哺乳后期）。5,6,7,8

转录组在不同生命阶段的显著变化可能导致特定年龄对疾病、繁殖或暴露于污染物的易感性。已经进行了几项社区范围的研究，以创建一个在小鼠、人类、大鼠和牛的正常发育过程中表达的基因数据库，9,10,11,12,13对于猪，尤其是处于妊娠期的母猪来说，这样的努力进展较慢。代谢物是基因转录和蛋白质表达的最终产物，也有能力控制这些过程。14结合转录组和代谢组的分析为解释从基因到表型的关键分子提供了信息。在猪身上，已经报道了一些关于重要经济性状或药物反应的转录组和代谢组联合研究，如饲料效率、，15低氧相关特征，16以及猪口服阿莫西林溶液的反应，17而对妊娠不同阶段代谢产物的研究还相当少。因此，基于转录组和代谢组数据表征猪繁殖和哺乳过程的分子机制是非常必要的，并且可以成为人类妊娠疾病的有用模型。

在本研究中，为了全面表征母猪从发情到哺乳发育阶段的关键分子，我们对7头约克郡猪的整个转录组和代谢组进行了测序。我们获得了126个序列数据集(图1)，并对RNA和代谢物进行生物信息学分析。这些数据结果将为研究猪育种和人类妊娠疾病提供非常有用的资源。

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研究设计细节

从七头猪的六个发育阶段（妊娠第1天、第30天、第100天和第113天，以及分娩后第120天和第130天）采集血液样本，并用于转录组和代谢组测序。

结果

猪转录组和代谢组从发情期到哺乳期的景观概述

我们在7头约克郡猪的6个阶段中获得了84个mRNAs、lncRNAs和miRNAs的RNA-seq数据集，产生了3910124178个干净的读码(表S1). 从发情期到哺乳期，猪血样本中共表达了14810个蛋白编码基因（PCG）、5058个lncRNAs（已知2701个，新2357个）和1889个miRNAs，已知340个，新1549个(表S2). 对于每个阶段，至少两个样本中的分子表达值≥0.1，六个阶段的转录组分子数量存在差异(表S3和图2A） ●●●●。具体而言，与其他五个阶段相比，第113阶段（分娩前最后几天）的PCG、lncRNAs和miRNAs表达量最少(图2A） ●●●●。在所有六个阶段中，13295个基因、4209个lncRNAs和1242个miRNAs是常见的表达分子。此外，我们获得了42个代谢物代谢组数据集，并鉴定了629个代谢品，包括225个非靶向脂质代谢物(表S2). 层次聚类分析（HCA，图2B） 所有42个样品的代谢产物中，不同阶段显示出独特的代谢产物谱。形态或功能相似的阶段，如第1天与第30天、第100天与第113天、第120天与第130天，彼此之间的聚类更紧密，表明这些阶段与其他阶段的代谢产物分布更一致(图2B） ●●●●。此外，第120天和第130天是哺乳期，它们与妊娠的其他阶段不同(图2B） ●●●●。我们还计算了每两组的相关系数，发现第1天和第30天、第100天和第113天、第120天和第130天的相关性高于其他组（0.9721、0.9567和0.9885）(表S4). 而PCG、lncRNA和miRNA的HCA结果在不同阶段之间没有明显的聚类差异(图S1A–S1C）。

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母猪血液转录组和代谢组的景观

（A） 每个阶段表达的PCG、lncRNAs和miRNAs的数量。

（B） 42份母猪血样629种代谢物丰度的层次聚类分析（HCA）。样本之间的距离定义为距离=1-斯皮尔曼相关。

（C–F）lncRNA和PCG之间转录长度、外显子数量、每个基因的亚型数量以及基因表达的特征比较。

（G） 通过组织特异性指数显示转录物的阶段特异性。

（H） 整个转录或代谢物丰度平均百分比的累积分布有贡献。同一类别样品的平均值用线表示。转录物从最高丰度到最低丰度排列的比例由x轴显示。转录物相对于所有转录物的累积分数由y轴表示。

（一） 基因参与的所有转录的平均百分比的累积分布。

对所有阶段鉴定的PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物进行主成分分析（PCA），代谢物结果揭示了生物复制品之间的相似性和每两个阶段之间的差异(图S2)而PCG、lncRNAs和miRNAs的观察结果没有(图S3–S5). 此外，PCG、lncRNAs和miRNAs在任何两个阶段之间的PCA(图S2–S5)观察到它们中的一些可以彼此分离，例如第1天和第113天、第1天和第130天、第30天和第113天以及第30天和第120天。我们进行了方差分割分析，并计算了每个PCG、lncRNA、miRNA和代谢物的方差（按阶段、个体和残差解释）。我们发现，PCG、lncRNA和miRNA的分期解释的方差与个体解释的方差一样多，这可能解释了PCG、incRNA和micRNA中HCA分析和PCA分析的混合模式(图S1D） ●●●●。而代谢物阶段解释的方差远小于个体解释的方差；然后，我们可以在HCA和PCA分析中按阶段清楚地区分样本(图S1D） ●●●●。

通过研究初始序列和外显子结构特征，我们发现与PCG相比，lncRNAs的长度更短，外显子更少，转录数量更低，表达更低(图2C–2F）。通过计算基因和代谢物的阶段特异性，我们发现新的miRNA具有比其他分子更高的阶段特异指数，而PCG具有更低的阶段特异指标(图2G） ●●●●。对于大多数分子群来说，只有很少的一百个基因或代谢物负责大约50%的转录丰度(图2H） ●●●●。此外，第113天阶段的基因总转录输出比例最高(图2一） ●●●●。

发育相关分子的表达和积累模式

我们使用R中的DEseq2包来识别任何两个阶段之间的DE（差异表达）RNA转录组分子。共鉴定出3652个DE PCG、694个lncRNAs和184个miRNAs，DE转录组总分子显示在(表S5和图3A–3C）。DE RNA分子的数量在任何一对阶段都有显著差异。具体而言，相邻阶段第1天与第30天、第100天与第113天、第113天与第120天、第120天与第130天的DE RNA少于其他对照组。特别是，第1天和第30天没有DE lncRNAs和miRNAs。大多数DE PCG和lncRNA在第30天与第130天（1389个DE mRNAs和259个DE-lncRNAs）和第100天与第30天（2165个mRNA和430个DE lncRNA）检测到。通过对任何两个阶段的代谢物进行配对比较，共鉴定出515种显著不同的代谢品（SDM）(表S5和图3D） 其他阶段和产奶中期之间的比较具有更多的SDM，例如第1天与第130天、第30天与第30天、第100天与第13天。

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差异表达（DE）分析结果

（A–C）分别表示任何两个阶段之间DE PCG、lncRNAs和miRNAs的数量，方框中的数字是数字。

（D） 任何两个阶段之间显著不同的代谢物（SDM）数量，数字收件箱就是数字。

（E–G）分别表示从第1天到第130天DE PCG、lncRNAs和miRNAs的15、8和4种表达模式。

（H） 从第1天到第130天，21个SDM内容变化模式。

对于DE lncRNA，预测了4040对强lncRNA-mRNA相关对（相关性>0.9或<-0.9，p<0.05），其中包含235个lncRNA和1015个PCG(表S6). 通过筛选DE lncRNAs上游和下游100kb范围内的PCG，我们检测到2421个基因顺式-666 DE lncRNAs的目标(表S6). 我们总共确认了674个DE lncRNAs的3312个靶基因。对于miRNAs，我们预测2387个基因靶向106个DE-miRNAs(表S6).

为了评估母猪妊娠整个发育过程中的发育依赖性转录组和代谢组活性，我们通过比较任何两个相邻的发育阶段，进行了阶段过程差异PCG、lncRNA和miRNA表达和代谢产物积累分析。我们在图3E–3H和表S7总之，我们在第1天、第30天、第100天、第113-120天和第130天期间分别观察到PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物的15、8、4和21种表达或含量模式，其中更多的PCG参与DMMMM和MDMMM模式，更多的miRNA和代谢品参与MMMDM模式。绝大多数PCG、lncRNA、miRNAs和代谢物在整个阶段保持不变（超过73%），并且在该阶段没有分子表达持续变化，无论是增加（UUUU）还是减少（DDDDD）。我们对同一模式中的分子进行了功能注释，发现它们在不同模式中是不同的(表S7). 例如，MUMDM和MMUMM模式的PCG可能分别为胚胎着床和哺乳做准备，它们分别参与造血和细胞骨架的结构组成，以及蛋白质和脂质代谢过程(表S7).

此外，我们还进行了时间序列分析，以全面揭示发育依赖的转录组和代谢组分子，我们分别在PCG、lncRNA、miRNA和代谢物中发现了9个、11个、8个和8个具有显著时间序列特征的图谱(图4和S6系列、和表S8). 从第1天到第130天，图谱39中含有107个PCG、98个lncRNA和61种代谢物的分子保持上升，150个PCG、64个miRNA和26种代谢物在整个期间持续下降。在这些重要的图谱中，包括1586个PCG、1431个lncRNAs、419个miRNAs和211个代谢物。其中575个PCG、282个lncRNAs和70个miRNAs是DE分子，174个代谢物是SDM。

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使用STEM在不同阶段包含PCG和lncRNAs的50种模式

（A） PCG结果。

（B） lncRNAs的结果。按重要性排序的配置文件。配置文件框左上角的数字是配置文件ID号，而配置文件框右下角的数字则是p值。彩色剖面上分配了大量具有统计学意义的基因。相同颜色的非白色配置文件表示分组到单个簇中的配置文件。

阶段特异性PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物

PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物在特定阶段的表达高于任何其他阶段的四倍以上被视为阶段特异性分子。总共，我们分别鉴定了123、23、188和12个阶段特异性PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物(图5A–5D，表S9). 第113天阶段的PCG（65）和lncRNAs（11）最特异，第30天和第120天的miRNAs最特异(图5A和5B，表S9).

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阶段特异性PCG、lncRNAs和miRNAs的表达以及阶段特异性代谢物的积累

该框显示第25–75个百分位（即四分位范围；IQR）；该线表示中间值；晶须显示1.5×IQR。这些PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物在特定阶段的表达高于任何其他阶段的四倍以上，被视为阶段特异性分子。Phi系数≥0.6表明该分子在（几乎）所有来自该阶段的样品中表达（不包括该阶段），并且也被视为阶段特异性分子。

此外，计算Phi系数以找出每个阶段的专属PCG、lncRNAs和miRNAs。均方关联系数（Phi系数）≥0.6表示该分子几乎在该阶段（不包括该阶段）的所有样本中表达，而在其他阶段几乎没有表达。Phi系数≤−0.6的分子表明，它（几乎）不在该阶段的样品中表达，而几乎在其他阶段表达。数千个DE分子被鉴定出来，而阶段优先表达分子只有11个(图S7). 我们还认为这11个分子是阶段特异性基因类型(表S9)其中，有6个是第130天的专属，其中4个是lncRNAs。

我们对阶段特异性分子进行了功能注释，发现它们与免疫反应和氧载体活性有显著关系(表S9). 此外，不同发育时期阶段特异性分子的富集程度不同(表S9). 例如，第1阶段的分子强烈参与脂质和糖原代谢过程，第113和130阶段的分子与蛋白质和氨基酸代谢显著相关(表S9).

分子共表达网络分析

为了找到与母猪妊娠和哺乳相关的共表达模块，我们使用PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物进行无符号加权基因网络分析（WGCNA）。共发现26个共表达模块，包括PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物(图6A） ●●●●。图6B显示了每个模块中的分子数。六个模块的表达明显（Bonferroni p-价值 < 0.05,图6C） 特定阶段，即分别在第1天、第30天、第100天、第113天和第130天使用两个、一个、一、一个和两个共表达模块(图6A） ●●●●。根据功能注释，阶段特异性模块与信号转导、代谢过程、免疫反应和细胞过程密切相关(图6C和表S10). Darkgreen与第1天和第30天的阶段高度相关，其中包括19个LysoPC代谢物。紫色模块含有97种TG代谢物，与第100天显著相关，这可能是分娩和哺乳所需。Lightgreen模块中的31种PC代谢物与产奶量显著相关（第130天）。许多PCG、lncRNAs、miRNAs和功能不明确的代谢物与相同模块中注释的分子共同表达，为猪的分子注释提供了有用的资源。

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加权基因共表达网络分析（WGCNA）

（A） 模块与阶段的关联。Bonferroni方法用于多重校正统计显著性。每个单元格包含相关性和校正的p值。

（B） 条形图显示了单个模块中检测到的转录组和代谢组分子的数量。

（C） 热图显示了六个重要模块中的RNA表达和代谢产物积累。TFs的重要功能丰富性、表达和代表序列的基序几乎都显示在相应的模块中。

PCG、lncRNAs和miRNAs调控网络的构建

我们基于DE lncRNAs和miRNAs的靶基因，在任何两个阶段的比较中，研究了特定阶段的PCG是否强烈参与某些lncRNAs和miRNAs的靶基因。表S11观察了详细的汇总统计数据。这些富集的lncRNAs和miRNAs可能会强烈影响母猪妊娠发育。例如，lncRNAs ENSSCG0000041596和XLOC_522486的靶点分别在第113天和第1天特异表达(图7A） ●●●●。lncRNA ENSSCG0000041596的靶点显著参与含伴侣蛋白的T复合物和补体激活(表S11). 第113天特异表达的miRNA ssc-miR-7142-3p靶点(图7A） 在蛋白谷氨酰胺γ-谷氨酰胺转移酶活性、ATP酶活性的正调控和肽交联方面显著富集(表S11).

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PCG、lncRNAs和miRNAs的监管网络

红色、蓝色和黄色分别表示lncRNAs、PCG和miRNAs。

（A） 两个lncRNAs和四个miRNAs及其靶基因的阶段特异性分子调控网络。

（B） lncRNA-miRNA-mRNA相互作用包括在与第113天相关的Lightcyan模块和与第130天密切相关的Darkgrey模块中识别的12个miRNAs。

我们还进行了一项竞争性内源性RNA研究，以确定lncRNAs在各阶段通过介导miRNAs对PCG表达的调节影响。表S12详细描述了miRNA-目标对的显著负相关（p<0.05），其中包含632个DE PCG、349个DE lncRNAs和73个DE miRNAs。在73个DE miRNA中，有11个miRNA在与第113天相关的重要模块Lightcyan中发现，而Darkgrey模块中的一个miRNA与第130天密切相关。这个图7B显示了这12个miRNAs的lncRNA-miRNA-mRNA相互作用。

TFs预测

对于DE和阶段特定PCG，以及WGCNA重要模块中的PCG，我们预测了它们的结合TF。总共有3762个PCG富含33个重要的基序(E值 < 0.05,图S8)，注释为297 TF。其中，40个、4个和2个TF分别是DE PCG、阶段特异性PCG和WGCNA重要模块中的分子(表S13).

有四种TF（EGR1、EGR3、KLE1和MSGN1）参与母猪妊娠的发育，表现出阶段特异性表达。例如，EGR1和EGR3是第1天的阶段特异性基因，分别参与运动节律和神经肌肉突触传递(表S9). MSGN1作为参与蛋白质二聚化活性的基本螺旋-环-螺旋转录因子，在第120天表现出阶段特异性表达(表S9)，并激活Notch通路中的基因，该通路作用于乳腺干细胞以促进自我更新。18,19对于WGCNA重要模块中的PCG，HIC1和EGR2被确定为第1天和第30天重要Darkgreen模块中的TF(图6C、，表S10)参与转录调控和运动神经元轴突导向。

发育阶段代谢组和转录组的综合分析

为了分析SDM的调节网络，对各组的DE PCGs/lncRNAs/miRNAs和SDM进行相关分析。相关分析表明，2936个DE PCG、517个lncRNA和147个miRNAs分别与300、284和258个SDM显著相关（相关值≥0.7或≤-0.7，p<0.05，表S14和第15节). 一个阶段特异性miRNA与第30天的四种代谢物密切相关，一个PCG、两个lncRNAs和两个miRNAs作为第100天的特异性分子与七种代谢品显著相关(表S14和第15节). 在WGCNA的重要模块中，99个转录组分子与45个代谢物显著相关。许多代谢物受到多种RNA的正向或负向调节，单个转录组分子可以调节多种代谢物(表S14和第15节). 例如，对照组第1天与第30天的11，14，17-二十碳三烯酸（FFA（20:3n3）与13个DE PCG显著相关（两个呈负相关，11个呈正相关，图8A） ●●●●。显著模块相关的第1天的PCG ENSSCG0000036983被注释为与ChE（20:4）*ChE（20-4）和PC（38:4）*PC（18:0_20:4）正相关(图8B） ●●●●。第100天的阶段特异性miRNA 1_737与七种代谢物（鹅去氧胆酸、猪胆酸、鹅去氧胆酸-甘氨酸结合物、甘胆酸、硫酸孕烯醇酮、硫酸孕甾醇酮和X-MZ397RT475、，图8C） ●●●●。根据这些结果，在猪从发情期到哺乳期的代谢产物积累和转录组分子表达的变化之间起着复杂的调节机制。

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转录组和代谢组之间关联的热点

行中的PCG、lncRNAs和miRNAs以及列中的代谢物观察到RNAs与代谢物之间的相互关系。正相关和负相关分别用红色和蓝色表示。

（A） 第1天和第30天DE RNAs和SDM之间相关性的热点。

（B） 第100天阶段特异性RNA和代谢物之间的相关性。

（C） 与第1天相关的重要模块的RNAs和代谢物之间的相关性。

人类重要妊娠相关代谢产物的联合分析

我们搜索了与人类妊娠相关的代谢产物的报告研究，发现了50种常见于人类和猪的代谢产物。这50种代谢物(表S16)主要通过四项研究在人类身上发现，4,20,21,22其中，8种代谢产物是人类妊娠的重要标志物。这八种代谢物也是猪妊娠的标志物，并通过DE分析、阶段特异性分析和WGCNA进行了显著检测。此外，八种代谢产物中的四种（4-乙烯基苯酚硫酸盐、胆碱、孕烯醇酮硫酸盐和孕烯醇酮硫酸盐）分别参与苯甲酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、孕酮代谢和甾体激素生物合成，它们与214个PCG、34个lncRNA、，和42个miRNA。我们展示了这四个关键代谢指标的调节网络图9和S9–S11.

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人类和猪体内常见代谢物硫酸孕烯醇酮的调节网络

（A） 转录组和代谢物的相关性。棕褐色、蓝绿色和红色分别表示PCG、lncRNA和miRNA。硫酸孕酮主要参与孕酮代谢。圆圈和三角形分别表示负相关和正相关。

（B） PCG、lncRNAs和miRNAs的ceRNA调控网络参与相关网络。

讨论

在本研究中，我们构建了母猪RNA-Seq转录组和代谢组BloodMap，包括发情到哺乳的六个阶段。尽管一些PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物表现出阶段特异性差异表达，但在所有六个阶段中通常有数千个分子表达。有趣的是，与其他阶段相比，第113天的特定分子更多，这可能满足身体对即将到来的分娩和哺乳的需求。阶段特异性分子与每个阶段的生物功能密切相关。例如，100天特异性lncRNA在胚胎发育中被激活。这表明母猪在整个繁殖发育过程中可能有各种各样的调控系统。

通过HCA和PCA分析，我们观察到不同阶段的代谢产物存在明显的聚类差异，这表明生物复制品之间的相似性和阶段之间的差异。对于转录组分子，聚类差异似乎很弱，而PCA结果可以将一些阶段彼此分开。方差分配分析证实个体效应是影响转录组分子表达的主导因素。为了消除个体因素，我们通过使用“设计=～阶段+个体”模型考虑个体效应，仔细进行差异表达分析。通过DE分析，我们发现对照组第30天与第130天、第100天与第13天的DE PCG、lncRNAs和miRNAs以及SDM均为数千，这表明妊娠和哺乳期之间存在显著差异。分子的相同表达模式表明它们的功能相似。发现四种阶段特异性TF（EGR1、EGR3、KLF1和MSGN1）与胚胎着床、胎儿血液供应和胚胎发育相关。23,24,25,26与第1天和第30天相关的重要模块中的两个TF，EGR2和HIC1，被建议参与标记乳腺形态发生和健康。27,28因此，这些RNA可能是调控母猪妊娠发育的关键分子。

SDM的鉴定表明，各阶段的代谢物含量差异很大，而阶段特异性代谢物相对较少，这是由于代谢物之间的相关性。通过WGCNA，我们获得了289种与母猪从发情到哺乳的发育阶段显著相关的代谢物，这些代谢物可能是相应阶段的标记。此外，这些代谢产物可能是人类妊娠与研究相关代谢疾病的重要标志物。例如，在人类怀孕期间，硫酸孕烯醇酮的积累增加，4并且在猪妊娠第100天时显著升高，这表明硫酸孕烯醇酮对人和猪的作用相似。此外，我们对代谢组和转录组进行了综合分析，表明许多转录组分子和代谢产物参与了特定阶段的相同功能途径。转录组RNA的表达与代谢物表现出强烈的相关性，这表明代谢物有机会作为基因表达标记。

根据DE和时间序列分析、阶段特异性分子鉴定、WGCNA以及代谢组和转录组的综合分析，检测到许多参与生殖过程的有希望的候选分子。例如，九个PCG(SLC45A1型,MAL公司,埃及镑3,表皮生长因子受体1,血红蛋白,SNCG公司,NR4A1型,AHSP公司、和DNM3（DNM3）)DE和时间序列分析以及阶段特异性分子鉴定共同证实了一个lncRNA（ENSSCG0000045096）和一个代谢物（甘胆酸）。埃及镑3和表皮生长因子受体1在TF预测中也观察到。SLC45A1型与婴儿期的发育有关，29和MAL公司在早期内体膜中高度表达。30 乙型肝炎病毒与多种生理特性相关，其p.K65R单核苷酸多态性对阿瓦西母羊的繁殖性能有强烈影响。31 SNCG公司在乳腺、卵巢和宫颈等多种人类生殖器官肿瘤中过度表达。32,33,34 NR4A1型是一个编码孤儿核受体的早期基因，在排卵过程中起关键作用，是增加猪产仔数的潜在分子标记。35 AHSP公司对与流产有关的氧化应激源有保护作用。36 DNM3（DNM3）是大型GTPase蛋白dynamin超家族的成员，dynamin聚合物有助于膜分裂和母膜新生囊泡的断裂。37lncRNA ENSSSCG0000045096的功能研究有限，而其靶向PCGCDS1（CDS1）第113天、第120天和第130天的表达明显高于第30天。之前的研究表明CDS1（CDS1）是细胞生长所必需的基因，38与DNA复制有关。39据报道，甘胆酸是妊娠特异性肝病的潜在标志物。40这表明关键分子可能参与猪胚胎着床和发育过程，是重要的遗传标记。

NCBI数据库可以访问这些数据集补充信息这项研究包括母猪怀孕期间多个发育阶段的42个样本。它可以用于检测新基因、lncRNAs和miRNAs，并更好地注释猪转录组。本研究42个样本中新基因、lncRNA或miRNA表达和代谢物积累的特征可作为指纹来推断其在母猪妊娠发育中的正常生物学功能。此外，阶段特异性表达分析、关键分子的表达模式以及代谢组和转录组的综合分析可用于检查药物的药理和毒理学效果，这些药物可能因人类妊娠阶段的不同而有所不同。此外，本文报道的血型图可能被用作跨物种比较的基础，从而改进了临床前动物安全研究结果转化为人类健康影响的方式。

研究的局限性

本研究提供了一个相对较大的数据集，并提出了哺乳动物妊娠的重要生物标志物及其初步调控机制。我们的研究是早期的生物信息学分析；在此，缺乏对这些标记的验证。另一个限制是样本量小，导致个体效应不可忽略，而我们使用“设计=～阶段+个体”模型来减少个体效应对差异分析的影响。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源来源标识符
生物样品
健康猪血组织中国农业科学院动物科学研究所昌平实验基地（中国北京）https://ias.caas.cn/
存放的数据
原始和分析数据这篇论文PRJNA857151公司
代谢物原始数据这篇论文表S2
实验模型：生物体/菌株
猪：约克郡猪中国农业科学院动物科学研究所昌平实验基地（中国北京）网址：https://ias.caas.cn/
软件和算法
UPLC-HRMS仪器赛默飞世尔不适用
AcquityTM HSS C18立柱Waters公司。不适用
AcquityTM BEH酰胺柱Waters公司。不适用
Accucore C30核壳柱赛默飞世尔不适用
集成数据库https://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index？db=core不适用
XCalibur软件赛默飞世尔不适用
STAR公司网址：http://star.mit.edu/网址：http://star.mit.edu/
Cytoscape软件https://cytoscape.org/https://cytoscape.org/
BED工具https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
StringTie公司https://bioinformaticshome.com/tools/rna-seq/descriptions/StringTie.html#gsc.tab=0https://bioinformaticshome.com/tools/rna-seq/descriptions/StringTie.html#gsc.tab=0
元分析5.0https://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtmlhttps://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml
KOBAS公司http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/
MEME套房http://meme-suite.org/index.htmlhttp://meme-suite.org/index.html

资源可用性

引线触点

有关资源和试剂的更多信息和请求，请联系首席联系人Lixian Wang(iaswlx@263.net).

材料可用性

本研究没有产生新的独特试剂。

实验模型和主题细节

动物个体和样品采集

所有实验动物均为来自中国农业科学院动物科学研究所昌平实验基地（中国北京）的550日龄约克郡猪。7头约克郡猪来自同一家养猪场，将为第三次怀孕做准备。从发情期到哺乳期，即第1天（发情期和交配期；妊娠第1天）、第30天（着床期；妊娠第30天）、第100天（胚胎期；妊娠第100天）、第113天（分娩前最后几天，妊娠第113天），第120天（产奶早期，分娩后第6天）和第130天（产乳中期，分娩后16天）。每个阶段共进行七次生物复制。

采集了7头猪的全部42份血样。我们将每个血样分为两部分：一部分用红细胞裂解缓冲液（中国北京天根RT122）处理以获得白细胞，剩余的血液用于离心15分钟（3000 rpm）分离血清。白细胞和血清样本在液氮中快速冷冻。

方法详细信息

RNA和代谢物提取

使用42份血白细胞样本，用TRIzol试剂提取总RNA（美国加利福尼亚州生命技术公司）。使用1%琼脂糖凝胶追踪RNA降解和污染。纳米光度计®分光光度计（IMPLEN，CA，USA）用于检查RNA纯度。RNA浓度和完整性分别通过Qubit®2.0荧光仪（Life Technologies）和RNA Nano 6000检测试剂盒中的Qubit™RNA检测试剂盒进行检测。

将每个血清样本分为两部分，提取极性和非极性脂质代谢产物进行代谢组学分析。极性代谢物提取：精密吸取100μL血清至EP管中，加入400μL甲醇-丙酮（1/1，v/v），涡流120 s，15000 g离心15 min，将200μL液体分别转移至两个1.5 mL EP管中。脂质代谢产物提取：向20μL血清中加入120μL甲醇（包括内标神经酰胺脂质提取液（D18:1/26:0-O-18:1（D9）），旋涡180 s，依次加入360μL甲基叔丁基醚和100μL超纯水，旋涡混合后，在4°C冰箱中放置10分钟，15000 g×15 min离心层，在EP管中准确转移300μL上层脂质提取物。最后，在离心浓缩（Thermo Scientific，美国）中用低温真空还原干燥极性和脂质代谢物。

RNA文库构建和测序

对于mRNA和lncRNA，通过将核糖体RNA移除到来创建链特异性库。41通过EpicentreRibo-Zero™rRNA去除试剂盒（美国威斯康星州Epicenter），我们分别从总RNA中去除rRNA，得到无rRNA残留。随后，将RNA断裂成250–300 bp的短片段，作为模板合成cDNA。分别进行PCR扩增和产物纯化（AMPure XP系统）以构建文库。最后，根据库的有效集中度和数据输出要求，我们使用Novaseq 6000平台（Illumina，NBE，USA）对库进行排序，并获得150 bp的配对读取。

我们利用美国伊利诺伊州Illumina的Small RNA Sample Pre Kit构建了一个小RNA文库。简单地说，将小RNA的两端直接加入适配器，然后反转录合成cDNA，其中总RNA样本作为满意的材料。目标DNA片段在PCR扩增后通过PAGE凝胶电泳分离，并通过重复使用切片凝胶创建cDNA文库。基于库的有效集中和数据输出要求，我们通过Novaseq 6000平台（Illumina，NBE，USA）对库进行排序，并实现了50 bp的单端读取。

代谢组学分析和代谢物含量评估

根据制造商的说明，我们使用UPLC-HRMS仪器（Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）分析代谢物。报告的研究还描述了详细信息，14其中，极性代谢产物采用AcquityTM HSS C18柱（Waters Co.，USA，2.1×100 mm）和AcquityTMBEH酰胺柱（Water Co.，US，1.7μm，2.1×100mm），脂质代谢产物采用Accucore C30核壳柱（Thermo Scientific，USA）。通过XCalibur软件（Thermo Scientific，USA），按照70000、17500和120000个全宽半最大分辨率这三个分辨率执行高分辨率质谱检测条件，以获取MS/MS光谱数据。

使用Compound Discoverer软件，我们按照制造商的说明进行了全面扫描并处理了轮廓数据，以提取综合组件。此外，通过XCalibur Quan Browser提取的曲线下面积值，获得并导出了极性代谢物的定量信息。对于脂质组学数据，我们使用LipidSearch软件处理峰值选取，并识别脂质。

蛋白质编码基因（PCG）、lncRNAs和miRNAs的鉴定

根据清洁读数，进行了所有后续分析。对于mRNAs和lncRNAs，我们通过STAR软件将干净的读数与猪参考基因组（Scrofa11.1）对齐。StringTie用于计算基因片段，每千基外显子模型片段数（FPKM）表示PCG和lncRNAs的表达。使用StringTie和Scripture（beta2）检测新的lncRNA转录物，详细描述见之前的研究，42而lncRNA的初始鉴定没有被表达水平过滤。对于小RNA，通过Cutadapt 2.8，我们修剪了读取的质量并删除了适配器，并根据报告研究中的描述方法识别了miRNAs。43参考基因组为Scrofa11.1，新的miRNA是通过结合未标记序列和已知的miRNA注释从Ovis白羊座,Bos金牛、和五倍子.

转录组和代谢组分子表达谱分析

在本研究中，如果转录组分子在FPKM中的PCG和lncRNAs表达值以及五（10%）个样本中miRNAs的百万分计数（CPM）等于或大于0.1，则认为该转录组分子已表达。如果在每个阶段的两个样本中，转录组分子在FPKM或CPM中的表达大于0.1，则认为该分子在该阶段表达。此外，转录组分子被认为是一种普遍表达的RNA，其表达发生在所有发育阶段。

我们根据这些样本Spearman相关性的距离矩阵对PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物进行了HCA，并进行了二维散点图，以通过PCA分析可视化样本之间的全局关系。我们进行了初始序列和外显子结构特征分析，并检查了tau评分（τ）（0-1）所示的基因丰度的阶段特异性，其中，0和1分别表示普遍转录和高度组织特异性基因。我们分析了通过阶段特异性指数观察到的转录物的阶段特异性，并对通过基因或代谢物供应的所有转录物或代谢品丰度的平均百分比进行了累积分布，按从最多到最少的顺序排列。

血液富集阶段特异性PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物

任何两个阶段之间的DE PCG、lncRNAs和miRNAs通过R中的DEseq2包进行识别，并使用校正后的p-值小于0.05，其中，我们使用“设计=～阶段+个体”模型仔细考虑了个体效应。我们对代谢物进行了t检验，其中p-价值小于0.05且褶皱变化（FC）≥2或≤0.5表示统计显著性。利用正交PLS-DA确定这些样品之间的差异，并消除不相关的差异。如果变量在投影中的重要性（VIP）值大于1，则认为变量不同。最后，通过p筛选SDM-值小于0.05，FC≥2或≤0.5，VIP大于1。使用不同的4倍阈值确定阶段特异性分子。如果PCG、lncRNA、miRNA或代谢物在给定阶段的表达水平或含量水平高于任何其他阶段的四倍以上，则认为其是一种阶段特异性分子。

我们计算Phi系数，以找出每个阶段的专属PCG、lncRNAs和miRNAs。条件选择了表达（FPKM/CPM≥0.1）或未表达（FPKM/CPM<0.1）的样本。我们使用0.1的阈值保守地选择具有实质性表达的阶段特异性PCGS、lncRNAs和miRNAs。第二个条件选择来自测试阶段或所有其他阶段的样本。我们使用R包心理的函数Phi系数计算Phi系数。Phi系数测量两个二进制变量之间的关联。我们将Phi系数≥0.6的PCG、lncRNA和miRNA定义为阶段特异性基因。

发育相关分子的表达和含量模式分析

根据DE分子，我们分析了它们在任何两个相邻阶段之间的表达模式，以年轻阶段为分母。两个相邻阶段之间的DE上调分子被归类为“上调”模式。相邻两个阶段间DE下调的分子被归类为“减少”，相邻两个时期间表达无差异的分子被归为“维持”。因此，DE分子被归类为125种模式中的一种，从up-up-up-up-up（UUUU）、maintain-maintain-maintain maintain（MMMMM）到decrease-decrease-decrease（DDDD）。

此外，我们使用STEM（Short time-series expression Miner）对所有PCG、lncRNAs、miRNAs和代谢物进行了时间序列分析，44其中，“模型轮廓的最大数量”和“模型轮廓在时间点之间的最大单位变化”分别设置为50和2。

转录因子结合基序分析

MEME套件检测到DE PCG启动子中结合的TF的富集(http://meme-suite.org/index.html). 我们通过Ensembl数据库的BioMart程序提取了DE PCG上游的2000 bp序列(https://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index？db=core)通过STREME工具预测8–15宽度丰富的图案(E值 < 0.05). JASPAR CORE脊椎动物数据库用于检测和注释Tomtom工具的主题。我们使用查找个体母题发生率（FIMO）工具筛选与TF匹配的DE PCG，其中阈值为p-价值<1E-04。

DE-lncRNAs和miRNAs靶基因的预测

通过BEDTools，45这个顺式-确定了DE-lncRNAs的靶点（lncRNAs上游和下游100kb范围内的PCG）。计算DE lncRNAs和已识别PCG之间的Pearson相关性，以检测反式-皮尔逊相关系数>0.9且p值<0.05的目标。此外，米兰达46能量<−10和TargetScan46当上下文得分百分位数>50时，miRNAs的靶基因被同时鉴定。然后计算DE miRNAs及其靶基因之间的Pearson相关性，以确定最终的靶基因与负相关和p-值 < 0.05.

ceRNA调控网络和WGCNA的构建

作为DE miRNAs的靶基因预测方法，我们预测了DE miRNA的靶lncRNAs，其中选择了负皮尔逊系数的配对。ceRNA由所有DE-miRNA及其靶PCG和lncRNA生成。ceRNA网络由Cytoscape软件可视化。47

R包WGCNA创建了一个基因共表达网络，其中在所有六个阶段识别出13295个基因、4209个lncRNAs和1242个miRNAs。Bonferroni p值<0.05的显著模块被定义为猪从发情到哺乳的发育阶段的功能模块。

转录组和代谢组的综合分析

DE、阶段特异性和重要模块分子用于不同发展阶段的综合分析。代谢组和转录组的整合通过Spearman方法进行。仅选择皮尔逊相关系数值≥0.7或≤−0.7且p<0.05的检测相关性。使用热图来显示RNA和代谢物之间的联系。

路径分析

在本研究中，我们通过KOBAS对RNA和代谢物进行了功能注释(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/)和MetaboAnalyst5.0(https://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)分别是。p的丰富性-值小于0.05被认为是显著的。

人和猪共同代谢标记物调控途径的构建

我们将猪和人类的结果进行了比较，以确定共同的代谢标记。此外，结合转录组结果和功能分析，我们构建了调节共同代谢标记物的途径。

量化和统计分析

使用R进行统计分析。具体分析的细节如图图例、结果和方法细节所示。

致谢

我们要感谢中国农业科学院动物科学研究所的养猪员在采集血样方面提供的帮助。这项工作得到了财政部和农业厅中国农业研究系统、农业科技创新计划（CAAS-ZDRW202006-04）和农业科技创新项目（ASTIP-IAS02）的资助。

作者贡献

本研究由Lx构思和设计。L.S.在H.Y.、Z.S.、J.L.和Lg的帮助下收集DNA。W.数据分析由L.S.在H.L.和X.H.的帮助下进行。本手稿由L.S..编写。所有作者阅读并批准了最终手稿。

利益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

笔记

发布日期：2023年1月20日

脚注

补充信息可在网上找到https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105825.

补充信息

文件S1。图S1–S11：
单击此处查看。（180万，pdf）

表S1.与图1相关的动物信息和RNA-seq数据：
单击此处查看。（12K，xlsx）

表S2.从约克郡猪血液中鉴定的转录组和代谢组分子，与图2相关：
单击此处查看。（10M，xlsx）

表S3.每个阶段表达的转录组分子，与图2相关：
单击此处查看。（170万，xlsx）

表S4.PCG、lncRNA、miNRA和代谢物在不同发育阶段的表达和含量水平相关性，与图2相关：
单击此处查看。（10K，xlsx）

表S5.任何两个阶段之间的DE PCG、lncRNAs、miRNAs和SDM，与图3相关：
单击此处查看。（1.1M，xlsx）

表S6.与图7相关的DE-lncRNAs和miRNAs的靶基因：
单击此处查看。（317K，xlsx）

表S7.DE分子的表达模式及其功能，与图3相关：
单击此处查看。（57K，xlsx）

表S8.通过时间序列分析得出的重要曲线中涉及的分子，与图4相关：
单击此处查看。（110K，xlsx）

表S9：与图5相关的阶段特异性分子及其功能：
单击此处查看。（94K，xlsx）

表S10：与图6相关的重要模块的分子及其功能富集：
单击此处查看。（84K，xlsx）

表S11.DE lncRNA和miRNA的阶段特异性靶基因及其功能注释，与图7相关：
单击此处查看。（385K，xlsx）

表S12：与图7相关的miRNA-靶对的显著负相关（p<0.05）总结：
单击此处查看。（141K，xlsx）

表S13.TF及其靶基因，与图6相关：
单击此处查看。（1.0M，xlsx）

表S14发育阶段代谢组和转录组的综合分析结果（相关值≥0.7或≤−0.7且p<0.05），与图8相关：
单击此处查看。（3.1M，xlsx）

表S15.与图8相关的RNA与代谢物的相关性热图：
单击此处查看。（360万，xlsx）

表S16：与图9相关的人类和猪体内常见代谢物：
单击此处查看。（10K，xlsx）

数据和代码可用性

此处使用的RNA-seq数据已在加入PRJNA857151后提交给NCBI序列读取档案（SRA）(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/生物项目/PRJNA857151). 新陈代谢的原始质谱数据表S2.

本文不报告原始代码。

重新分析本手稿中报告的数据所需的任何其他信息可从引线触点根据要求。

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