以单细胞分辨率绘制脂肪肝的转录异质性和代谢网络

文库准备、单细胞RNA测序和数据预处理

所有样品在同一轮中测序，以避免批量校正。这些文库是使用10X Genomics 3′版本3单细胞基因表达试剂盒制备的。然后在Illumina HiSeq 4000上测序，测序结果为2x101 bp。然后，在斯坦福基因组测序服务中心的Illumina HiSeq 4000测序器上，以100-bp配对连接的配置，汇集分离的小鼠肝细胞的双索引库并进行测序。读取结构为双索引测序，从read 1开始的read 1为28个碱基，包括细胞条形码和唯一分子标识符（UMI）、索引i7为10个碱基、索引i5为10个碱，read 2为90个包含转录信息的碱基。这些文库使用10x Genomics Cell Ranger 3.1.0的管道进行处理和反编译。⁴⁵

单细胞RNA测序数据的聚类鉴定与表达分析

使用Seurat分析数据²⁹在R工作室。将两个数据集（chow和NAFLD）的原始计数表加载到Seurat中，并应用Seurat“merge”函数执行汇总分析。在去除少于200个基因或超过50000个基因的细胞并过滤掉超过5%的线粒体含量后，基因表达通过全球尺度归一化方法“对数归一化”进行归一化，并按照标准的Seurat包程序进行合并和聚类。^29,46与之前的报告一致的是，chow和NAFLD小鼠肝脏的组合数据集确定了种群。^47,48,49聚类定义热图说明了每个聚类的三个代表性基因表达标记，以log2值表示，以定义种群。为了比较小鼠和人类sc-RNA测序数据，使用Bader实验室提供的Rshinn应用程序生成和分析肝细胞簇。在Bader等人中。，簇1、簇3、簇4、簇6、簇14和簇15被鉴定为肝细胞。进行了以下分析：（1）所有小鼠和人类基因的散点图（12398个基因在小鼠13519个基因和人类数据集中20007个基因之间发现共同点），表示为人类数据集中所有样本（8444个细胞）与小鼠（5932个细胞、NAFLD和chow）的平均基因表达，（2）小鼠和人类基因重叠的venn图，以及（3）提取人类数据集的聚类信息，以确定基因是否在人类肝细胞簇中异质表达。使用Bonferroni校正对多次测试的P值进行调整。

用于预测致病基因的AI嵌入模型

为了识别疾病相关基因，我们基于基因与PPI嵌入图中功能模块的接近程度建立了预测模型。⁵⁰我们应用node2vec在64维嵌入空间中捕获14707个基因（来自STRING-2019）的网络拓扑特征。⁵¹Node2vec是一种图形算法，它使用基因周围的局部连通性来总结其在低维空间中的交互作用；⁵²相邻节点具有相似的交互作用，并且在嵌入空间中“很近”，如余弦距离所测量。然后，我们通过计算基因与一组220个功能模块（47个来自ImmProt的免疫反应模块，⁵³来自MsigDB的50个信号通路模块，⁵⁴人类代谢反应数据库中的123个代谢模块⁵⁵已知的疾病基因。构建NASH预测模型的方法如所述图S6给定一个由一组基因组成的模块，我们将单个基因嵌入向量相加，以生成功能模块的摘要向量。余弦相似性度量基因嵌入和模块载体之间的接近性。对于给定的基因，我们可以计算其与上述每个功能模块的相似性；值向量描述了基因的功能关系。给定一组与疾病有关的黄金标准基因，我们可以使用这些功能关系的嵌入式表示的机器学习来预测其他疾病基因。作为概念验证，我们从DisGeNET收集了70个NASH基因³⁹作为金标准清单。我们确定了与这70个NASH基因最接近的功能模块。我们使用线性支持向量机（Linear SVM）创建分类器，用于定义与已知70个基因具有相似特征的其他基因。一组随机选择的基因被用作阴性示例。我们进行了10倍交叉验证，并系统地改变了模型的参数(图S6). 使用大规模基因嵌入，⁵⁰模块嵌入是通过对给定功能模块内的单个基因嵌入向量求和来计算的，以生成摘要向量。

免疫组织化学

在OCT包埋的6μm厚冰冻切片上对小鼠肝脏进行免疫组化。组织切片在20°C的PBS中用3%福尔马林固定1h。对于苏木精和伊红（H&E）染色，玻片用苏木精染色，用水和95%乙醇清洗，伊红染色30分钟。然后用乙醇和二甲苯对切片进行脱水，并用固定介质固定。根据制造商的说明，使用三色染色试剂盒（Sigma，#HT15）进行三色染色。对于CAR定量，对石蜡包埋的人类肝组织进行免疫染色。简言之，将石蜡块切成5μM厚的切片，用二甲苯脱蜡，并用降低水中乙醇浓度的方法进行再水化。将载玻片在95°C的柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中培养25分钟，然后在室温下冷却20分钟，即可获得抗原。将载玻片在3%过氧化氢中孵育10分钟，以猝灭内源性过氧化物酶。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗切片5分钟。根据制造商说明，使用封闭试剂盒封闭内源性抗生物素和生物素（Vector Laboratories，Burlington，ON，Canada）。一抗（1/100#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“CF805306”，“term_id”：“37974813”，“term_text”：“CFR805306“}}CF805306，ThermoFisher）在室温下的加湿室中使用2h。在PBS中冲洗载玻片后，在室温下将其在聚合物-HRP二级抗体（Vector Laboratories）中培养30分钟。用PBS清洗5分钟后，将载玻片与Vectastain ABC试剂（Vector Laboratories）孵育30分钟。用PBS洗涤五分钟后，通过使用二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）溶液（Vector Laboratories）两分钟实现显色。在蒸馏水中清洗后，在氨水中用苏木精和蓝色对切片进行复染，通过乙醇和二甲苯脱水，并使用基于二甲苯的安装介质盖上盖子。使用尼康eclipse e1000立式光学显微镜同时检查所有幻灯片，并使用尼康Digital Sight DS-Fi1彩色相机和Spot Advanced软件拍摄图像。

CAR量化

通过将RGB图像转换为灰度并拉伸转换后的像素强度以使像素的顶部1%和底部1%饱和，对每个图像独立地进行分割。在最大像素强度的40%处引入阈值。灰度强度低于该阈值的任何像素都被视为细胞核的一部分。为了进一步改进分割，应用了填充操作和5像素磁盘形状的形态开口。计算每个分割细胞核内的平均RGB像素颜色，这被认为是该细胞核最可能的颜色。为了将细胞核分为阳性细胞和阴性细胞，将RGB像素颜色转换为HSV空间。间隔[120；300]内有色调的细胞核被视为阴性；否则，该细胞被视为阳性。脚本位于https://github.com/Svensson-Lab/Coassolo2022.

油红O染色和定量

对于载玻片或细胞中的油红O染色，样品用3%福尔马林固定在PBS中，用水冲洗两次，用60%异丙醇孵育5分钟，然后用预混合油红O溶液（Sigma，#1395）孵育，油红O:H的比例为3:2₂O静置20分钟，然后用H清洗₂O.为了量化细胞中的油红O染色，将0.5 ml异丙醇添加到24孔板中的染色细胞中，提取油红O着色，并转移到96孔的透明平底板中。在540 nm处读取吸光度。数值表示为通过细胞数归一化的吸光度。

免疫荧光染色和定量

对于Srebp1（Santa Cruz，sc-13551）和LipidSpot染料（Biotium，70069，PBS中1:1000稀释）联合染色，按顺序进行染色。Srebp1抗体（1:200稀释PBS/1%BSA）在4°C下应用24小时，然后使用二级荧光抗体（Thermo Fisher Scientific，A11001，1:500稀释PBS/1%BSA），持续1小时。然后根据制造商的方案，将LipidSpot染料应用于相同的肝组织上2小时。Srebp1和LipidSpot的荧光图像是使用徕卡SP8共焦显微镜和63x物镜拍摄的。使用ImageJ软件的免疫荧光图像对核定位Srebp1进行定量。每组分析10张图像。为了量化Srebp1高细胞和低细胞，使用DAPI染色定量每个图像的细胞核数。测量每个细胞核中Srebp1染色的强度，并以Srebpl染色的平均像素强度作为阈值来确定阳性或阴性表达。将截止值设置为108.5，定义为Srebp1染色的平均像素强度(图4B） ●●●●。当Srebp1表达高于第50百分位时，被解释为阳性。这些值表示为Srebp1的百分比^高的和Srebp1^低的细胞。通过Chow Srebp1之间的比较进行统计分析^高的和NAFLD Srebp1^高的使用双尾Student t检验和P值<0.05被认为具有显著性。为了量化Srebp1在脂质阳性或脂质阴性区域的表达，从6周的NAFLD饮食小鼠中选择了10张脂质阳性和阴性区域的代表性图片（90μm×90μm）。通过定量脂斑染色确定脂质阳性区域。共定域面积（μm²)在每个区域定量Srebp1和DAPI染色。这些值表示为Srebp1阳性细胞核的百分比。总共对10个脂质阳性和脂质阴性区域进行了定量。通过使用双尾Student t检验比较脂质阳性和阴性区域进行统计分析，P值<0.05被认为是显著的。

血浆丙氨酸转氨酶（ALT）活性测定

处死喂食chow或NAFLD饮食的动物，通过心脏穿刺抽血并收集在肝素化管中。血液以6000倍离心克在4°C下收集血浆10分钟，将上清液转移到新管中并保持在−80°C。根据制造商的方案，使用丙氨酸转氨酶比色活性测定试剂盒（Cayman，#700260）进行ALT活性测量和分析。简单地说，将150μl底物、20μl辅因子和20μl 2x稀释血浆样品一式两份加载到96孔板上，包括试剂盒中提供的阳性对照。将平板在37°C下培养15分钟。孵育后，通过添加20μl ALT引发剂启动反应，然后在37°C下每10分钟立即测量340 nm处的吸光度。两个时间点之间吸光度值的绝对差值除以时间点差值，然后乘以消光系数0.21/（4.11 x 0.02）和稀释系数。数值以单位（U）/L表示。

作者贡献

概念化，L.C.，Y.J.K.J.S。；方法学，L.C.，Y.J.S.B.N.，K.J.S。；验证，Y.J.、M.Z.、L.C.、K.J.S。；形式分析，L.C.，Y.J.，S.B.N.，K.J.S；调查，L.C.、Y.J.、M.Z.、T.L.、L.C.、S.P。；资源、G.C.、R.A.、A、K-K、H.Y-J.、K.J.S。；写作——原稿，L.C.，K.J.S。；写作——评论与编辑，L.C.、M.Z.、T.L.、R.A.、K.J.S。；融资收购，K.J.S。；监理，K.J.S。