通过酶挖掘消除主客体不相容性，实现高温生产N个-乙酰葡萄糖胺

嗜热酶GNA1s的性能

为了验证上述20种候选嗜热GNA1酶的功能，GlcNAc分解代谢途径中的基因如纳格P1和第2批（编码磷酸转移酶系统的GlcNAc-特异性酶），纳加（编码GlcNAc-6-P脱乙酰酶），以及伽马射线和纳格B（编码GlcN-6-P脱氨酶）地衣双歧杆菌MW3被阻断以获得五基因敲除测试菌株BNGS1(图3A和S1). 我们介绍了Scopgna1基因（密码优化版本酿酒酵母使用Jcat的GNA1网址：http://www.jcat.de/)转化为BNGS1菌株地衣双歧杆菌表达载体pHY300PLK获得菌株范围BNGS1用于性能测试。结果表明，成功地制备了GlcNAc(图S2). 此外，与对照组相比Sc公司BNGS1（gna1无密码子优化基因酿酒酵母，引入名为Sc公司BNGS1），GlcNAc生产范围在50℃时，BNGS1从0.24 g/L增加到0.9 g/L，这表明密码子优化是有效和必要的(图S2). 因此，使用Jcat对20种嗜热GNA1酶的核苷酸序列进行了密码优化(网址：http://www.jcat.de/). 根据我们建立的管道，将20个密码优化候选GNA1分别表达到含有5个组成型启动子的菌株BNGS1中，用于GlcNAc烧瓶试验。最佳启动子P_als公司筛选出具有最高GlcNAc滴度的20株候选菌株用于生产GlcNAc(图S2). 将20株候选GlcNAc生产菌株在37°C（普通微生物的最佳生长温度）、42°C（微生物的中温菌和嗜热菌的临界温度）和50°C（地衣双歧杆菌MW3）(图3B−3D）。结果表明，在这20株菌株中，有8株菌株分别在37℃、42℃和50℃的温度下产生GlcNAc，表明这8株嗜热GNA1酶候选基因在地衣芽孢杆菌.四个候选菌株Tt公司BNGS1，无BNGS1，百万吨BNGS1和计算机断层扫描之所以选择BNGS1，是因为它们在42和50°C时表现出较高的GlcNAc滴度(图3B−3D）。四个选定菌株中的四个嗜热GNA1，命名为Tt公司GNA1、，无GNA1、，百万吨GNA1，以及计算机断层扫描进一步分析GNA1的后续酶性质。

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图3

20株候选嗜热菌株的摇瓶发酵用于嗜热酶GNA1性能测试

（A−D）五个基因敲除质粒的构建（A）。在37°C（B）、42°C（C）和50°C（D）下摇瓶发酵20个候选嗜热菌株。对生理测量进行了三个复杂的实验，误差条代表SD。

酶学性质和AlphaFold2蛋白结构预测

通过氨基酸序列比对，四种蛋白质无GNA1、，Tt公司GNA1、，百万吨GNA1，以及计算机断层扫描GNA1与GNA1具有47.1%、45.2%、44.2%和43.0%的氨基酸同一性Sc公司分别为GNA1(图S3). 我们插入了Nf公司GNA1、，Tt公司GNA1、，百万吨GNA1，以及计算机断层扫描GNA1转化为pETDuet-1载体，并将其转化为大肠杆菌BL21（DE3）分别用于进一步的蛋白质表达和纯化。四种蛋白质中的每一种无GNA1、，Tt公司GNA1、，百万吨GNA1，以及计算机断层扫描净化后的GNA1显示为单车道，约为20 kDa(图S4). 根据其酶学性质，对四种纯化蛋白进行了进一步表征(图S4和第5章). 最佳温度计算机断层扫描GNA1、，Tt公司GNA1、，百万吨GNA1，以及无GNA1分别为50°C、60°C、40°C和25°C(图4A−4D）。其中，Tt公司GNA1在较宽的温度范围内表现出良好的催化活性，在37−60°C时保持超过60%最大活性的相对活性(图4A） ●●●●。最佳pH值计算机断层扫描GNA1、，时间GNA1、，百万吨GNA1，以及无GNA1分别为7.5、6、7和7.5(图4E−4H），这是地衣双歧杆菌。此外，四种GNA1酶具有热稳定性，在37和50°C培养48小时后，显示出超过60%的初始活性残留(图4I−4升）。在这四种酶中，Tt公司GNA1具有最高的热稳定性，在37°C、50°C和60°C下孵育48小时后，其初始活性残留物超过90%(图4一） ●●●●。由于无GNA1在60°C下的活性在12小时内迅速降至零，但在37和50°C下热稳定性很好，这可能对发酵的影响很小地衣双歧杆菌50°C时的MW3。与四个筛选的GNA1相比，Sc公司GNA1表现出较低的热稳定性，在50°C下孵育48小时后，只有20%的初始活性残留(图S6). 此外，五种酶的差示扫描量热仪（DSC）特征表明Sc公司GNA1（47.4）远低于Tt公司GNA1（60.1），计算机断层扫描GNA1（59.3），百万吨GNA1（54.8），Nf公司GNA1（58.5），在我们筛选的四种GNA1中表现出优异的蛋白质稳定性(图S7).

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图4

的活性测定Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，Nf公司GNA1，以及计算机断层扫描GNA1公司

（A−D）温度对Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1.误差条表示标准偏差。

（E−H）pH值对Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1。方形柠檬酸-柠檬酸钠；三角形，NaH₂人事军官₄-纳₂高性能操作₄; 菱形，Tris-HCl；星，NaHCO_三-纳₂一氧化碳_三。误差线表示标准偏差。

（I−L）热稳定性Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描37°C、50°C和60°C时的GNA1。在37°C、50°C或60°C下孵育72小时后，通过定时采样对每种酶的热失活进行评估。每种酶的剩余活性以初始活性的百分比进行测定。误差线表示标准偏差。

（M−P）金属离子对Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1.误差条表示标准偏差。进行了三个复杂的生理测量实验，误差线代表SD。

此外，我们测量了四种GNA1酶的特定动力学参数。与催化效率相比(k个_猫/K_米)第页，共页Sc公司GNA1、Tt公司GNA1、，无GNA1、，计算机断层扫描GNA1，以及百万吨GlcN-6P的GNA1分别为1867.56、322.52、1817.43和1764.88秒⁻¹百万分之一⁻¹分别是Sc公司分别为GNA1(表S3). 这个k个_猫/K_米的值Tt公司GNA1、，无GNA1、，计算机断层扫描GNA1，以及百万吨Ac-CoA的GNA1为1671.41、238.99、1580.29和763.78秒⁻¹百万分之一⁻¹分别是Sc公司分别为GNA1(表S3). 这些结果表明时间GNA1对GlcN-6P和Ac-CoA的催化效率高于其他三种GNA1酶。图4M−4P显示了不同金属离子对Tt公司GNA1、，无GNA1、，计算机断层扫描GNA1，以及百万吨GNA1.仅镁²⁺提高了铜这四种酶的活性²⁺和汞²⁺对四种GNA1酶有明显的抑制作用，其余金属离子对四种酶的活性无明显影响。

AlphaFold2用于预测四种GNA1酶的蛋白质结构，⁵¹FoldX用于计算四种蛋白质的稳定性。^52,53晶体结构Sc公司GNA1从PDB下载，PDB编号为1i21，我们使用FoldX中的RepairPDB模块最小化能量，然后计算五种蛋白质的最终稳定性（ΔG）。^54,55四种预测蛋白质的结构(Tt公司GNA1、，无GNA1、，计算机断层扫描GNA1，以及百万吨GNA1）相对相似，底物囊倾向于保守。FoldX计算的展开自由能（ΔG）Tt公司GNA1、，Nf公司GNA1、，计算机断层扫描GNA1，百万吨GNA1，以及Sc公司GNA1分别为−62.69、−76.32、−42.29、−45.74和10.23 kcal/mol，表明我们筛选的酶比Sc公司GNA1公司(图S8).图5A−5B表示底物口袋周围每种GNA1酶和整个蛋白质的溶剂可及表面积（SASA）。整个蛋白质的SASA值Tt公司GNA1、，计算机断层扫描GNA1、，百万吨GNA1，以及无GNA1分别为21472.5、17839.6、17604.4和14516.2²分别是。基板凹槽周围的SASA值（乙酰-CoA）Tt公司GNA1、，计算机断层扫描GNA1、，百万吨GNA1，以及无GNA1分别为1825.9、1931.9、1912.0和1787.8²分别是。这些结果表明Tt公司GNA1、，计算机断层扫描GNA1，以及百万吨GNA1比它更亲水无GNA1，这与他们的K_米值。此外，在四种GNA1酶中，底物乙酰辅酶A周围的氢键数量略有不同(图5C−5F）。与Tt公司GNA1，计算机断层扫描GNA1，以及百万吨GNA1，英寸无GNA1，Gly116的主链NH与乙酰辅酶A的O4A和辅酶A-GlcNAc-6P之间形成了额外的氢键，表明底物Ac-CoA和产物CoA-GlcNAc-6P在无GNA1，有助于建立催化构象(图S9−S12). 我们还使用高级泊松-玻尔兹曼解算器（APBS）显示了四种蛋白质的表面静电势。结果表明，静电势在基板凹槽周围的分布存在显著差异无GNA1与其他三种GNA1酶的比较(图5G） ，这可能会影响底物的结合能力。

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图5

蛋白质结构预测Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1公司

（A） 计算的整个蛋白质的溶剂可及表面积（SASA）Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1。

（B） 基底袋周围的计算溶剂可及表面积（SASA）Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，Nf公司GNA1，以及计算机断层扫描GNA1。

（C−F）计算与底物乙酰基CoA结合的氢键数量Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1。

（G） 预测的高级泊松-玻耳兹曼解算器（APBS）导致了基板凹槽周围的静电势分布Tt公司GNA1、，百万吨GNA1、，无GNA1，以及计算机断层扫描GNA1。

此外，与中温酶相比，嗜热酶倾向于形成更多的α-凝胶，以使蛋白质结构更加稳定，并且β-支链残基（Val、Ile和Thr）会影响螺旋稳定性。Tt公司GNA1、，百万吨GNA1，以及计算机断层扫描GNA1显示较少β-螺旋和整个序列中的支链残基含量，而Tt公司GNA1具有更多的α螺旋，这增加了蛋白质的稳定性(表S4). 计算柔韧性指数以分析四种蛋白质的热稳定性。的价值Tt公司GNA1（0.9703）低于百万吨GNA1（0.9866），无GNA1（0.9839），以及计算机断层扫描GNA1（0.9862），表示Tt公司GNA1相对更耐热(表S5). 这一结果与Tt公司GNA1，在60°C下表现出更高的稳定性。

GlcNAc生产中的代谢通量重塑

为了进一步增加GlcNAc的产生，我们使用系统代谢工程来重新编程代谢流(图6). 首先，我们插入了一个更强的启动子P_als公司之前全球监测系统在基因组中地衣双歧杆菌BNGS1号机组(图S13)，并转换为pHY300PLK-Tt公司GNA1，pHY300PLK-无GNA1，pHY300PLK-计算机断层扫描GNA1和pHY300PLK-百万吨GNA1获得四个菌株Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨分别为BNGS2。在37°C、42°C和50°C下进行烧瓶发酵24小时(图7A和7B）。在37°C下，GlcNAc的产量分别增加了35.5%、39.1%、54.8%和57.6%Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨BNGS2分别与Tt公司BNGS1，无BNGS1，计算机断层扫描BNGS1和百万吨BNGS1号机组(图7A和7B）。在42°C时Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨BNGS2分别增长27.6%、48.4%、58.3%和58.0%(图7A和7B）。在50°C时，GlcNAc滴度Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨BNGS2分别增长19.1%、45.1%、60.0%和70.7%(图7A和7B）。图7B还显示了在50°C的烧瓶发酵24小时后副产物浓度的检测。丙酮浓度Tt公司BNGS2，无BNGS2，百万吨BNGS2和计算机断层扫描BNGS2分别达到15.0、16.0、16.3和11.6 g/L，2,3-丁二醇浓度分别达到1.51、2.49、2.31和1.41 g/L，被认为是主要副产物。

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图6

高效生产GlcNAc的代谢工程方案

×，基因敲除进入地衣双歧杆菌MW3；粗向下箭头，基因过度表达；乙酰辅酶A；GlcN-6P，葡萄糖胺-6-磷酸；GlcNAc-6P，N个-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸；葡萄糖胺合酶；谷氨酰胺；谷氨酸；GNA1、GlcN-6PN个-乙酰转移酶。

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图7

摇瓶发酵和50-L生物反应器补料分批发酵

（A） 摇瓶发酵范围BNGS1，Tt公司BNGS1，无BNGS1，计算机断层扫描BNGS1和百万吨BNGS1分别在37°C、42°C和50°C下。对生理测量进行了三次实验，误差条表示SD。

（B） 摇瓶发酵范围BNGS2，Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨分别在37°C、42°C和50°C下检测BNGS2，并检测Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨50°C时为BNGS2。对生理测量进行了三种硅酸盐实验，误差线代表SD。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，通过t检验与范围BNGS1，Tt公司BNGS1，无BNGS1，计算机断层扫描BNGS1和百万吨BNGS1分别在37°C、42°C和50°C下。

（C） 摇瓶发酵范围BNGS3，Tt公司BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3和百万吨BNGS3温度分别为37°C、42°C和50°C。对生理测量进行了三种硅酸盐实验，误差线代表SD。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，通过t检验与范围BNGS2，Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨BNGS2分别为37°C、42°C和50°C。

（D） 摇瓶发酵Tt公司BNGS4，无BNGS4，计算机断层扫描BNGS4和百万吨BNGS4分别在37°C、42°C和50°C下。对生理测量进行了三种硅酸盐实验，误差线代表SD。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，通过t检验与Tt公司BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3和百万吨BNGS3分别为37°C、42°C和50°C。

（E） Fedbatch发酵无BNGS4在42°C的50-L生物反应器中。

（F） Fedbatch发酵Tt公司BNGS4在50°C的50-L生物反应器中。

（G） Fedbatch发酵Tt公司BNGS4在具有温度编程的50-L生物反应器中。外径₆₀₀，在600纳米处的光密度。0−15小时，42°C，15−33小时，温度从42°C上升到46°C，每2小时上升0.5°C。33−41小时，温度每2小时升高1°C至50°C。

为了进一步提高GlcNAc的产量，在BNGS2的基础上敲除了编码乙酰乳酸合成酶（AlsS）和乙酰乳酸脱羧酶（Als D）的乙酰丙酮和2，3-丁二醇生物合成基因，以阻断合成途径。四种质粒pHY300PLK-Tt公司GNA1，pHY300PLK-无GNA1，pHY300PLK-计算机断层扫描GNA1和pHY300PLK-百万吨GNA1转化为BNGS2获得时间BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3和百万吨分别为BNGS3。四种菌株Tt公司BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3和百万吨在摇瓶中测试BNGS3(图7C、，第14条、和第15节). 在消除丙酮和2,3-丁二醇途径后，未检测到这两种副产物的积累。GlcNAc的最高浓度时间BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3，以及百万吨BNGS3达到3.85、3.35、3.20和3.47 g/L，分别比对照组高40.0%、50.6%、46.9%和58.5%Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨BNGS2分别在37°C时(图7C） ●●●●。在42°C时Tt公司BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3和百万吨BNGS3达到3.39、3.23、3.26和3.39 g/L，比对照组分别高44.2%、57.2%、61.9%和67.0%Tt公司BNGS2，无BNGS2，计算机断层扫描BNGS2和百万吨分别为BNGS2(图7C） ●●●●。在50°C时Tt公司BNGS3，无BNGS3，计算机断层扫描BNGS3和百万吨BNGS3分别达到3.97、1.85、2.95和2.86 g/L，分别比对照高62.7%、25.9%、50.5%和63.4%Tt公司BNGS2，无BNGS2。计算机断层扫描BNGS3和百万吨分别为BNGS3(图7C） ●●●●。

虽然质粒很容易插入细胞并允许强大的基因表达，但它们容易发生遗传不稳定性，这不利于化学品的工业生产。⁵⁶因此，四个GNA1，Tt公司GNA1、，无GNA1、，百万吨GNA1，以及计算机断层扫描带有组成型启动子P的GNA1_als公司分别整合到BNGS2染色体上，获得四株无质粒菌株Tt公司BNGS4，无BNGS4，计算机断层扫描BNGS4和百万吨BNGS4。如所示图7D、 在四种无质粒菌株中，只有无BNGS4使GlcNAc浓度在42℃时从3.23 g/L提高到3.78 g/L，在50℃时从1.85 g/L提高至2.25 g/L，分别比对照组高17.0和21.6%无BNGS3.其他三株菌株的GlcNAc浓度变化不大或略有下降，无统计学差异，这可能是由于GNA1整合到染色体后拷贝数较低所致。

在50L发酵罐中扩大生产GlcNAc

为了测试大型生物反应器中四个GNA1整合系统的稳定性和稳健性Tt公司BNGS4，Nf公司BNGS4，CtB公司NGS4和百万吨使用BNGS4在50L发酵罐中扩大GlcNAc的生产。无BNGS4的GlcNAc产量最高，为119.3 g/L，纯化后葡萄糖为0.22 g/g，在42°C下50 h内高产量为2.39 g/（L·h）(图7E中，第16节、和第17节)，甚至比101.2 g/L的Tt公司BNGS4公司(图S18). 50°C时，Tt公司BNGS4的GlcNAc产量最高，为47.4 g/L，为2.37 g/（L·h），相比之下无BNGS4，计算机断层扫描BNGS4，以及百万吨BNGS4与T型tGNA1（全球导航卫星系统1）(图7F、，第19节、和S20码). 然而，四株菌株的发酵表明，在50°C时，乙酸溢出，导致细胞生长受到抑制，GlcNAc的生产受到限制(图7F） ●●●●。这可能是由于ATP和NAD不足所致⁺在高温和代谢更旺盛的条件下，导致细胞物质代谢和能量需求之间的失衡。此外，NAD⁺在高温条件下不稳定。⁵⁷因此，我们推测，适当降低温度可能会达到完美的平衡，以缓解醋酸流量。温度降低梯度设置为50°C至42°C(图S21和S22型). 当温度降至47℃时，GlcNAc滴度从47.4 g/L增加到86.4 g/L，增加了82.3%，乙酸从29.7 g/L减少到8.3 g/L，对GlcNAc发酵几乎没有影响(图S22)它被认为是平衡物质代谢和能量需求以避免乙酸溢出的临界温度。为了进一步提高发酵温度并减少乙酸溢出，提出了通过将发酵温度从42°C缓慢提高到50°C来逐渐使GlcNAc生产宿主适应不断上升的温度来进行温度编程(图7G） ●●●●。如所示图7G、 在发酵周期中，发酵温度主要保持在42℃至47℃之间。最后，GlcNAc产量达到83.0 g/L，几乎不产生醋酸盐，这表明我们提出的温度规划对减少醋酸盐溢出的有效性。

资源可用性

实验模型和主题细节

方法详细信息

这项工作得到了国家自然科学基金（22138007、32170105和31870088）的资助。我们高度感谢穆晓玲、汤浩、陈思红、李伟丽、谭春林、智佳慧、冯元元和徐航在本研究实验中的协助。我们感谢陈寿文教授提供pHY300PLK质粒。我们感谢T&J生物工程（上海）有限公司和上海百伦生物技术有限公司为初步实验提供生物反应器。