介绍
心肌细胞是心脏的收缩单位。它们的生长和适应对早期胎儿发育期间的心脏发生具有重要意义，此时心脏已从原始的心脏管转变为生长中的四腔心脏，心室的流出部分正在发育。1,2,三与窦性静脉、心脏大静脉和肺静脉相关的心管静脉极和心脏间质的元素发展为小梁心耳、房间隔、心房中央导管部分和窦房结（SAN），正常心跳由此产生。1,4,5,6,7起源于心肺大静脉的心房结构被CM心肌化，8,9形成中庭光滑的导管部分。
然而，在这些发育室室中，细胞分裂、分化与收缩力、能量产生和心肌细胞电完整性的发展有关的机制尚不清楚。因此，需要探索CM的光谱、规格、生长以及在产前早期与其他细胞的相互作用，以提高对心脏健康、CM人群发展的认识，从而为心力衰竭的新再生治疗开辟潜在途径。
Asp等人。（2019）使用空间转录组学（ST）生成了撰写本文时最全面的人类怀孕后4.5至9周（PCW）胎儿心脏发育空间细胞图谱，10,11单细胞RNA测序（scRNA-seq），12和就地测序数据。13,14此数据集构成人类发育细胞图谱(HDCA公司). 在6.5–7 PCW时，Asp等人。（2019）确定了三个CM群体，分别对应心房CM、心室CM和富含MYOZ2的CM。在这里，我们对6.5–7 PCW的CM群体进行了高分辨率表征，通过应用为解剖和表征细胞类型异质性、定位细胞类型并探索其配体-受体（L-R）相互作用而开发的计算工作流程来实现。
结果
我们最初应用了均匀流形近似和投影（UMAP）15用于降维和聚类HDCA公司6.5–7 PCW心脏scRNA-seq数据集16(图S1A） ●●●●。为了专门研究人类产前心脏的CM异质性，我们对726个细胞进行了亚聚类，这些细胞对应于在HDCA公司数据集，即心室、心房和MYOZ2号机组-浓缩CM。通过这一过程，出现了八个构型管理集群(A；图S1B） ●●●●。其中6个（指定簇0–2、4、6和7）为心室CM簇，表达2007年5月两个（簇3和簇5）是心房CM簇，表达MYH6年.
心室肌细胞类型的基本特性
（A） scRNA-seq心室和心房CM簇的二维UMAP。
（B） 心室CM类型的基本特性总结：占总数的百分比、基因数量×1000、G2M和S期细胞的百分比、线粒体RNA的百分比、2007年5月，连接蛋白GJA1公司（Cx43）和GJC1公司（Cx45）、L-R相互作用的数量和DE基因的核糖体蛋白百分比。星号表示对从绝对数的单向方差分析或chi-square检验中获得的值：***p<0.0005；***p<0.0001。
（C） GO：生物过程。（D） 心室CM类型及其在ST图上的位置的反褶积。
心室肌细胞群特征
三个最大的心室CM簇（簇0、簇1和簇2；A和1B）包含≈75%的细胞，与其他三个心室CM簇（4、6和7）中的细胞相比，线粒体含量、连接蛋白表达和L-R相互作用更高。这表明它们更成熟，形态更完整，具有更高的氧化、收缩和导电能力。17,18
第三大簇（簇2）与该基因的强差异表达（DE）有关IRX3系列，调整后的p值（p_val_adj）为4.8×10−17(图S2A和S2B），这是浦肯野纤维远端的特征。19,20该簇还表达最强烈的编码缝隙连接蛋白43和45的基因(吉贾1和GJC1公司分别为；B） 在快速传导纤维中起着关键作用，21并以几个与传导和信号传导相关的基因本体（GO）术语为特征(C） ●●●●。综上所述，这些观察结果表明，集群2包括Purkinje CM公司.
第二大心室CM簇（簇1）与糖酵解相关的GO术语相关22以及对缺氧的反应，23表示高能量生产。此外，该簇强烈差异表达该基因HEY2公司（p_val_adj 2.5×10−27) (图S2A和S2B），是NOTCH信号的下游效应器，在紧凑型CM.24
HEY2公司抑制心房和小梁基因的表达待定5,25
NPPA公司、和GJA5公司（编码连接蛋白40）。因此，该集群中的细胞具有以下特征紧凑型CM.
最大的心室CM簇（簇0）包含大约三分之一的心室CM(B） ●●●●。GO特性(C） 包括比紧凑型CM相关术语更明显的收缩和膜相关术语。几个收缩相关基因被富集(图S2A和S2B），例如MYL2（马来西亚林吉特）,TNNI3公司、和3车型年款.HOPX公司，一种参与CM成熟的转录因子26也高度表达（p_val_adj 6.3×10−26). 因此，该集群中的细胞具有以下特征小梁CMs.
最小的心室CM簇（簇7）与少量的L-R相互作用和两者的弱表达相关MYH7型和连接蛋白表达(B） ●●●●。独特的GO术语与间质发育以及细胞外和细胞骨架特征有关(C） ●●●●。G2M期和S期细胞比例较高：分别为30.4%和21.7%。
高差异表达基因(图S2A和S2B）包括LGALS1公司（p_val_adj 1.2×10−7),PLAC9公司（p_val_adj 5.2×10−13),行动1（p_val_adj 4.4×10−12)、和S100A11型（p_val_adj 2.9×10−14).藻类1编码与细胞-基质相互作用有关的β-半乳糖苷酶结合蛋白，并与细胞内肌动蛋白共定位。27
PLAC9公司编码与细胞外基质网络有关的糖蛋白。28
行动1编码收缩器的主要组成蛋白；和S100A11型编码钙结合蛋白。这些特性表明，这群细胞是心肌成纤维细胞，主要在流出道发育(OFT CM)心室肌、半月瓣和大动脉在此发育。29,30,31
第三小心室CM中的大多数细胞处于G2M期(B） 及其GO条款(C） 与G2M期和有丝分裂有关。此外，基因的高DEPTTG1型（p_val_adj 3.9×10−35)和管A1B（p_val_adj 9.7×10−29)表明G2M细胞周期活动明显。因此，该集群具有以下特征高G2M CM。
相反，第二小心室CM（簇6）的G2M期细胞比例较低，68%的重要DE基因是核糖体蛋白mRNA(B） ●●●●。在剩下的24个DE基因中，有18个被记录在包括外泌体在内的人类囊泡中。32相关GO术语表明ER活动较高。基因YBX1型高差异表达（pvaladj 8.8×10−16) (图S2A和S2B），参与RNA分子的识别和微小RNA（miRNAs）的外体转运，33,34,35根据GO特征指示靶向ER的蛋白质。因此，该簇具有以下特征外泌体相关CM。
在心室CM簇之间和内部，基因表达和细胞周期相评分都有很大差异(图S2C和S2D）。所有心室细胞类型包括一些G2M期细胞。线粒体基因表达也有很大差异。OFT CMs中表达量较低，但在致密、小梁和富含外泌体的CMs中也有不同的低表达细胞组分(图S2C） ●●●●。这些弱表达细胞定位于HDCA数据集中的MYOZ2号机组-丰富的CM簇，而剩余的细胞定位于心室CM簇。总体而言，弱表达细胞（占总数的16%）的表达基因和转录物数量较低，线粒体基因表达较弱，但在G2M期的比例较高（26%对14%；根据卡方检验，p＜0.001）。
作为额外的验证，CM scRNA-seq簇被反褶积到ST段心脏形态学图上，其中六个心室CM簇中的四个固定在心脏的相关解剖结构上(D和第3章). 致密型心肌病主要位于两心室的心外膜附近和室间隔，而小梁型心肌炎则位于两心室内部。Purkinje纤维相关的CM定位于右心室和左心室的远中部，而OFT CM主要定位于流出道。外显子相关和高G2M CM广泛分布于心室。
心房心肌细胞类型
因为太少了SAN CM为了通过聚类算法进行识别，在细胞共存时使用有监督的方法进行检测TBX18型,选购2、和盐酸.36,37,38在UMAP分析生成的地图中(A） 显示两个心房簇（簇3和簇5），SAN CM（共8个细胞）位于心房簇5的末端。A还显示了10个与心房功能相关的标记物的表达位点。TBX18具体位于集群5的上端，即SAN CM区域，而选购2在簇5中表达更显著且广泛(图S4). 在这个发育阶段选购2，一种来源于中胚层的生长因子仅限于右心房导管区域19,39,40肺静脉口周围的左心房导管区。我们的结果与之前的发现一致，其中选购2与心外膜前和间充质衍生转录因子协同作用TBX18型,41与SAN起搏器CM的发生和心肌收缩基因程序表达的降低有关。如所示A、 这涉及早期心脏转录因子NKX2-5型（簇5中的表达低于簇3，SAN中的表达也低于簇5（CMs：分别为p<0.008和<0.003），并且传导相关转录因子的表达增加（p<0.0001）TBX3型.同时，NPPA公司在簇5中的表达低于簇3，在SAN中的表达也低于簇5（CMs分别为p<0.0001和<0.004）和连接蛋白40编码基因GJA5公司簇5的表达强度低于簇3：p<0.0001。这种适应可能会阻止SAN CM成为快速传导的心房CM。38,42此外PPP1R1A，编码细胞质蛋白磷酸酶抑制剂的基因，该抑制剂调节影响SAN起搏器细胞内在自动性的时钟机制，43SAN中的值高于集群5中的值（p<0.0001）。
心房CM子类型属性
（A） 心房小梁、导管和SAN CM的二维UMAP和相关基因的热图。
（B） GO特征：生物过程。（C） 心房CM类型及其在ST图上位置的反褶积。
两个心房CM簇（簇3和簇5）在肌肉收缩力GO方面相似(B） 但只有较小的簇（5）表达上皮细胞迁移、上皮-间充质转化、内皮细胞增殖、骨形态发生蛋白（BMP）和典型的WNT信号通路。这些差异表明，较大的簇（3）与原始心房有关，主要发育为小梁心耳(心房小梁CMs)而簇5与心房中央光滑部分有关，该部分由心外膜、间质和包括肺静脉在内的大静脉发育而成8,9,30(心房导管CM). SAN CM的GO术语(B） 与传导、动作电位调节和心率有关。作为附加验证，C和第3章显示SAN CM定位于右心房上部，导管心房CM主要定位于心房中央部分，而小梁心房CM定位于心房外周。在几个中央点检测到小梁和导管CM的信号。这可能是因为显微切割转录组图空间网格中的每个点可能代表20–30个细胞，当然，这些细胞可能包括不同的共定位细胞类型。
不同细胞类型的空间共定位
器官发育过程中不同细胞类型之间的相互作用非常重要。通过反褶积非心肌细胞（non-CM）单细胞簇高密度密度钙(图S1A） 在ST点上，我们可以可视化共定位细胞类型，从而获得关键细胞及其在局部发育中相互作用的指示。A显示包含OFT CM和B显示了与这些OFT CM斑点共定位的非CM斑点的分数。这些斑点中心外膜衍生细胞、与大小血管相关的成纤维细胞样细胞、成纤维样平滑肌细胞和心脏骨骼细胞、内皮细胞和施万祖细胞的分数均较高。具有独特心房导管CM的ST点(B） ，虽然也存在心外膜细胞，但观察到了类似的细胞类型组成。非CM细胞类型的分数较低。这表明CMs在OFT区域（主要发育事件包括主动脉、肺动脉和半月瓣的分隔和形成）中的作用可能不如在心房中的作用显著，心房中的肌肉形成是主要发育事件。
具有OFT-CM和相关配体受体串扰的有色非CM细胞类型
（A） 心脏115段OFT区域（椭圆）有投射OFT CM的ST点。
（B） 从中描述的scRNA-seq簇中反褶积出的表达非CM细胞类型的点的分数图S1用于表达（上方）OFT CM和（下方）导管心房CM的点。
（C） 热图显示了OFT CM和非CM之间的L-R相互作用数量。
（D） OFT-CM和共定位非CM细胞类型之间的特定高表达L-R串扰。非心肌细胞类型的缩写：Epicardium-d：Epicordium-derived，Fb_l_vascular：成纤维细胞样（更大的血管发育），Fb_smooth_m：成纤维样平滑肌细胞，Schwann：雪旺祖细胞，Fb_骨架：成纤维状（心脏骨架）。“Log2mean（配体受体）”表示簇1中相互作用分子的平均表达水平除以簇2中相互作用分子平均表达水平之间的比率。“p值（-log10）”是指在每种相互作用的细胞类型对中，相互作用的配体-受体对的富集。
配体-受体串扰
L-R相互作用的数量44不同CM类型之间的相互作用很低，几乎没有整合素相互作用(图S5A） ●●●●。相比之下，心室CM细胞和非CM细胞之间的相互作用(图S5A） 在位于区域的致密、小梁和Purkinje相关的CM中显著且最高，这些CM也具有最高数量的整合素相互作用，表明结缔组织和血管结构在心脏发育、CM发育和锚定中的重要性。
在OFT CM点中，大多数检测到的L-R相互作用(C） 介于与血管发育相关的成纤维细胞样细胞、内皮细胞、心外膜衍生细胞和雪旺祖细胞之间。OFT-CM和这些细胞类型之间的串扰相对较弱，可能是因为CM在OFT发育中起着次要作用，这涉及到隔膜和瓣膜形成。27个OFT CM交互(D） 经鉴定，12个（44%）与来自或朝向OFT CM的具有特定L-R相互作用的整合素有关。在非整合素类中，OFT-CM表达胎盘生长因子，该因子作用于几个受体（FLT1、NRP1和NRP2），刺激内皮生长和血管生成。更多的非CM配体作用于OFT CM，反之亦然。
L-R相互作用的复杂性体现在涉及表皮生长因子受体（EGFR）的那些相互作用，EGFR参与各种非CM细胞类型和OFT CM之间的串扰，取决于所涉及的配体（NRG1、TGFB1、MIF或GRN）。这与EGFR在二尖瓣和血管结构发育中的作用一致。45,46参与相互作用的其他因子包括BMP、LRP1（低密度脂蛋白受体）和TNFR。BMP是TGF-β超家族的成员，与NOTCH信号一起调节CM增殖。47,48LRP1影响心肌细胞的脂质摄取，而TNFR的激活可能参与凋亡，并被描述为招募心脏祖细胞49和刺激OFT CM。LGAL、NCAM1和ESAM是参与细胞与细胞及细胞与基质相互作用的配体。因此，确定的L-R串扰表明了OFT CM在其环境中发展的各个方面。
由于神经嵴衍生物对隔膜流出道的发育很重要，雪旺祖细胞之间的L-R相互作用是OFT中最突出的神经嵴衍生物(B） 和共定位细胞类型(图S5B） ●●●●。在153个检测到的L-R相互作用中，92个（60%）涉及整合素。重要的是，雪旺祖细胞通过一系列细胞因子与内皮细胞以及另一系列细胞素与心外膜源性细胞、成纤维细胞和平滑肌相互作用。此外，施万祖细胞和其他类型细胞之间也存在着肾上腺素、NOTCH、TGF-β和酪氨酸激酶的相互作用。
外泌体相关的CM散布于心室肌(D） ●●●●。只有32个检测到这些细胞的L-R相互作用是显著的，其中11个（34%）涉及整合素(图S5C） ●●●●。整合素配体仅在外显体相关的CMs表达，表明与非CMs单向结合。FGF和VEGF配体都通过共定位细胞的各种受体发挥作用，TNF、BMP、NPPA和酪氨酸激酶AXL也一样，影响平滑肌、成纤维细胞和内皮细胞。影响胞外体相关CMs的细胞外指示信号包括L-R与淋巴结形态原TGF-β对LEFTY2_TDGF1的串扰50,51,52和CD47_SIRPA，表明这些CM处于早期发展阶段。SIPRA是一种在心肌祖细胞和早期心肌细胞表达的细胞表面受体。53,54
窦房结和导管心肌细胞
B显示，含有心房导管CM的ST点中，除了心外膜细胞外，还含有与OFT CM点相似的非CM细胞类型，尽管非CM组分较小，这表明这些点中的主要细胞类型是导管CM。
我们检测到导管CM与非CM细胞的更多L-R相互作用（即226，包括72个整合素相互作用）(A） 与OFT CM相比(C） ●●●●。例如，导管CM通过NOTCH、WNT或BMP信号通路与所有分析的非CM细胞类型进行通信，这是心脏发育过程中的基本途径55(B） ●●●●。此外，NPPA、成纤维细胞生长因子（FGFs）、VEGFs、血管生成素和Semaphorin 356已知能促进血管生成的配体与导管CM的内皮细胞发生深刻的相互作用。最后，导管CM与心外膜细胞和内皮细胞有广泛的相互作用(A） ●●●●。在这方面，LAMA3、FGF10、EFNA1和LGR4(C） 与上皮细胞向间充质细胞的转化有关57,58,59,60在静脉起源的心房壁，这可能有助于其心肌化。41,61,62,63,64
具有导管CM和相关配体受体串扰的有色非CM细胞类型
（A） 热图显示导管心房CM簇和六个非CM簇之间的L-R相互作用数量。
（B） 导管和共定位非CM之间的特定高表达L-R串扰。
（C） 共定位非CM和导管CM之间的特定高表达L-R串扰。非心肌细胞类型的缩写：Fb_l_vascular：成纤维细胞样（大血管发育），Epicardium-d：心外膜衍生，Fb_skeleton：成纤维样（心脏骨架）。Fb_smooth_m：成纤维样平滑肌细胞，Fb_s_vascular：成纤维细胞样（较小的血管发育）。“Log2mean（配体受体）”表示簇1中相互作用分子的平均表达水平除以簇2中相互作用分子平均表达水平之间的比率。“p值（-log10）”是指在每个相互作用的细胞类型对中相互作用的配体-受体对的富集。
讨论
6.5-7 PCW的人类胚胎心脏处于动态阶段，其中心肌的左心室和右心室生长，近端OFT的肌肉组织仍在发育。
我们的结果表明，在心室构型管理人群的主要部分中，细胞分裂和RNA合成的速率很高，但存在异质性，线粒体基因和连接蛋白43（构型管理之间细胞间电连接的标记）的表达具有高度异质性。这种异质性与先前的研究结果一致，即细胞周期基因表达通过可能影响共定位细胞增殖的位置特异性信号分子下调肌节和细胞骨架标志物。65我们还检测到广泛的L-R串扰，具有特定的轮廓，例如OFT、外泌体相关和导管心房CM以及雪旺祖细胞。
与定位的小梁、致密和Purkinje CMs相比，两种CM类型，即外泌体相关和高G2M CMs，其表达较低2007年5月连接蛋白和线粒体，并分散在空间隔室中。与外泌体相关的小CM具有外泌体蛋白的mRNA的显著表达。这些CM可能值得在开发基于外泌体的CM再生用于治疗性心力衰竭方面给予更多关注。66
OFT巨细胞瘤不同于致密和小梁巨细胞瘤，具有更像成纤维细胞的轮廓。近端OFT、右心室圆锥和左心室OFT的发育晚于致密心肌和心室心肌。67关于DE和GO特征，OFT CM表达与结缔组织发育相关的基因。对于流出道心肌化是基于心室肌细胞的向内生长还是与OFT相关的间质、心外膜和心内膜的分化，存在一些争议。67我们的结果表明，后一种来源可能很重要，至少在所分析的心脏中是如此。
总之，我们对单细胞和空间转录组分析以及空间共定位细胞类型之间的L-R串扰进行的联合分析揭示了产前早期人类心脏中CMs的细胞组成、表达模式和功能的复杂动态变化。我们的方法还提供了一种策略来进一步描述组合的和公开可用的单细胞和空间转录组学资源。
研究的局限性
该研究基于Asp等人发布的数据集。，2019.由于缺乏人类产前资料，这些数据集基于两颗怀孕后年龄相近的心脏。我们的假设生成结果是通过应用生物信息学方法。进一步的实验验证将加强我们的发现。
